酵母高质粒小量提取试剂盒

◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ 目录号 RP02 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ 酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒 ◆ 目录号 1206 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 - 1 - 酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒 目录号：1206 目录编号 包装单位 120601 50次  适用范围： 适用于酵母小规模质粒制备（mini preparations）  试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50 次 RNaseA（10mg/ml） -20℃ 150µl Lyticase -20℃ 2500U 溶液 YP1 4℃ 15 ml 溶液 YP2 室温 15 ml 溶液 YP3 室温 20 ml 去蛋白液 PD 室温 25 ml 漂洗液WB 室温 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液 EB 室温 15 ml 吸附柱 AC 室温 50 个 收集管（2ml） 室温 50 个 本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。 - 2 - 储存事项： 1. 第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 YP1（终浓度 100µg/ml） 置于 4℃保存。如果溶液 YP1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残 留，在溶液 YP1 中补加 RNase A 即可。 2. 环境温度低时溶液 YP2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几 分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3. 为避免降低活性，方便运输，提供 Lyticase(2500U)为冻干粉状，收到后，可短暂 离心后，加入 0.25 毫升灭菌水溶解配制成 10U/μl，因为反复冻融可能会降低酶活 性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。  产品介绍： 本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞并结合 lyticase 特异消化酵母细胞壁， 能在 1 小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒 DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细 胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 PH 值状态下选择 性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后低盐、高 PH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。  产品特点： 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2. 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种 分子生物学实验。 - 3 -  注意事项： 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 溶液YP3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮 肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 3. 通常酵母质粒拷贝数都很低，高拷贝质粒最大得率一般为每5 ml 培养物提取1μg 左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl用做PCR 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ;5-10μl 用 于转化大肠杆菌 ,选择高效率的感受态细胞。 4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条 DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成， 与提取物 培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超 螺旋可以超过90%。 5. 用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ -巯基乙 醇)。配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β -巯基乙醇(商品化的β -巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。 6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x10 7 cells/ml，由于菌种 和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。 7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在 －20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。 - 4 -  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：  第一次使用前请先在 15ml 漂洗液 WB 中加入 60ml 无水乙醇，充分混匀，加入后 请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!  将 RNase A 全部加入溶液 YP1 中，混匀，每次使用后置于 2-8℃保存。  将 YP3 溶液放在冰上预冷。  吸取使用量的 Sorbitol buffer 加入 0.1%β -巯基乙醇，回复到室温备用。 1. 取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5X107 cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸 弃上清，收集菌体。 收集超过 1.5 毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个 1.5ml 管内加入更多的菌 液，重复步骤 1，直到收集到足够的菌体。 2. 加入 600μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；可按照 20-50U/1x107cells 的 比例加入 Lyticase(一般 5 ml 培养物可能需要加到 200U)，充分颠倒混匀，37℃温 育至少 30 分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。 如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度，还 可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或 者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。 3. 13,000rpm 离心 1 分钟，尽可能吸弃上清，加入 250μl 溶液 YP1 重悬菌体沉淀， 涡旋振荡至彻底悬浮。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 4. 加 250μl 的溶液 YP2，温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘 - 5 - 稠后就可以做下一步，不是一定要准确的 5分钟。 5. 加 350μl 溶液 YP3，立即温和地上下翻转 4 -7 次，充分混匀时会出现白色絮状沉 淀。冰上静置 3-5 分钟，13,000rpm 离心 10 分钟，小心取上清。 加入溶液 YP3 后应该立即混匀，以免产生 SDS 的局部沉淀。如果上清中还有微 小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6. 将上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）， 12,000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。 7. 可选步骤:加入 500μl 去蛋白液 PD，12,000rpm 离心 30-60 秒，弃废液。 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为 JM系列、HB101 等 endA 菌 株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为 XL-1 Blue 和 DH5α 等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。 8. 加入 700μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30-60 秒，弃掉废液。 9. 加入 500μl 漂洗液 WB，12,000rpm 离心 30-60 秒，弃掉废液。 10. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液， 以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 11. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓 冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置 2 分钟， 13,000rpm 离心 1 分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸 附柱中，离心 1 分钟。 洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于 50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。 - 6 -  问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 与解决方法 问题 评论与建议 质粒 DNA 产量低 *忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长-建议：确保固体、液体 培养基中都加入了适当的抗生素。 *细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解-建议：接种过夜培养的 新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中，培养 12-16 个小时。 *使用了低拷贝数质粒-建议：使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒 应该适当加大处理体积。 *细菌培养时间过短，细菌浓度过低-建议：细菌培养到[A600]吸光 值为 2-4 时，收集菌体。 *细菌细胞裂解不完全-建议：使用建议的菌体处理量，不要过量； 涡旋或者吹打，确保菌体充分重悬于溶液YP1 中，不应该见到 未散开的细菌团块；加入裂解液 YP2 后，应该是粘稠和透明的。 *某些种类酵母裂解困难-建议：仔细阅读步骤 2，确认处理的酵 母种类可以用 lyticase 裂解，还可以考虑选用其它裂解方法如 Zymolase、玻璃珠涡旋、反复冻融等，lyticase 最好按照使用量 分装冻存，保证有效性 *质粒 DNA 产量使用分光光度计定量不准确-建议：分光光度计 定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB染色定量。 *洗脱效率不高-建议：请阅读实验步骤 10 和注意事项 7。 未提取到 质粒 DNA *漂洗液 WB 中忘加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇 *质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳 /EB 染色定量时质粒 DNA 漂出上样孔-建议：确保已经做了步骤 10，将离心吸附柱 的残留乙醇去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。。 - 7 - 问题 评论与建议 质粒 DNA 下游酶切不能 切开或者酶切不完 全 *忘记做步骤 10，乙醇抑制了酶切反应-建议：做步骤 10，之后在 空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗 脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心1分钟，小心取上清使用。 质粒 DNA 降解或 者无质粒 DNA *核酸酶活性太高-建议：确保已经做了步骤 7，使用去蛋白液 PD 去除核酸酶。 基因组DNA 污染 *裂解时基因组 DNA 被剪切打断了-建议：做步骤 4 时，轻柔颠 倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。 质粒 DNA 缺口或 者电泳时超螺旋带 前出现变性质粒带 *步骤 4 裂解时间过长-建议：裂解时间不要超过 5 分钟。 产物中含有 RNA 污染 *第一次做实验时，忘记将 RNase A 加入YP1 溶液，RNase A 失 活或者起始处理量过量-建议：第一次实验前确保将 RNase A 加入了溶液 YP1；YP1 溶液超过 3 个月的，可加入一些新 RNase A；处理量不要过量；菌体重悬于 YP1 溶液后可放置几分钟让 RNase A 充分作用后再进行下一步。