高通量测序技术及应用

书书书 中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１）：１０９１１４ 高通量测序技术及其应用 王兴春１，２　杨致荣３　王　敏１　李　玮１　李生才２ （１山西农业大学生命科学学院　太谷　０３０８０１　２山西农业大学农学院　太谷　０３０８０１） （３山西农业大学文理学院　太谷　０３０８０１） 摘要　高通量测序技术是ＤＮＡ测序发展历程的一个里程碑，它为现代生命科学研究提供了前所 未有的机遇。详细介绍了以４５４、Ｓｏｌｅｘａ和 ＳＯＬｉＤ为代表的第二代高通量测序技术，以 ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ ＴＩＲＭ和ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳＭＲＴ为代表的单分子测序技术，以及最近 ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ公司推出的 ＩｏｎＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）测序技术等高通量测序技术的最新进展。在此基础上，阐述 了高通量测序技术在基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲 基化等研究领域的应用。最后，讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问 题及其未来的发展前景。 关键词　高通量测序　深度测序　下一代测序　基因组测序　转录组测序 中图分类号　Ｑ３ 收稿日期：２０１１０４１１　　修回日期：２０１１０６０２ 山西省青年科技研究基金（２０１００２１０３０１）、国家自然科学基金 （３１１００２３５）资助项目 通讯作者，电子信箱：ｗｘｉｎｇｃｈｕｎ＠１６３．ｃｏｍ；ｓｘａｕｌｓｃ＠１２６．ｃｏｍ 　　作为最重要的分子生物学分析方法之一，ＤＮＡ测 序不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物 学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等 应用研究中也发挥着重要的作用。随着科学的发展， 传统的Ｓａｎｇｅｒ测序技术的局限性日益突出。一方面， 该技术依赖于毛细管电泳，不但费时，而且测序反应数 也受到限制（目前常用的 ＡＢＩ３７３０测序仪每次只能分 析９６个样品）；另一方面，该技术基于酶法测序，成本 较高。自 ２００５年以来，以 Ｒｏｃｈｅ公司的 ４５４技术、 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｓｏｌｅｘａ技术和 ＡＢＩ公司的 ＳＯＬｉＤ技术 为标志的高通量测序技术相继诞生。虽然高通量测序 技术建立的时间不长，但发展非常快。已经应用于基 因组，包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研 究的许多方面［１］。高通量测序技术已经将人们带到了 真正的高通量测序时代，这些技术必将在生命科学领 域得到广泛的应用，并产生极大的推动作用。然而，许 多科研人员仅知道高通量测序技术的大概原理，而对 于该技术在生命科学领域的应用却知之甚少。为此， 本文详细阐述了高通量测序技术的最新进展及其在生 命科学研究中的应用，以期使科研工作者尽早地了解 该技术，并将其更好地应用到科研工作中。 １　高通量测序技术及其发展现状 　　高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里 程碑，该技术可以对数百万个 ＤＮＡ分子进行同时测 序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全 貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）［２］或下一代测序技术 （ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）［３］。目前，所说的高通量测序技术主 要是指４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ公司、ＡＢＩ公司和 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公 司推出的第二代测序技术以及 ＨｅｌｉｃｏｓＨｅｌｉｓｃｏｐｅＴＭ和 ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ推出的单分子测序技术。 １．１　第二代测序技术 　　２００５年，４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ公司（现已被Ｒｏｃｈｅ公司 收购）首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高 通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。 该技术的原理是酶级联化学发光反应：首先将 ＰＣＲ扩 增的单链ＤＮＡ与引物杂交，并与 ＤＮＡ聚合酶、ＡＴＰ硫 酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素 酶和５′磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中 只加入一种ｄＮＴＰ，若该ｄＮＴＰ与模板配对，聚合酶就可 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１２０１２ 以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。 焦磷酸盐被硫酸化酶转化为 ＡＴＰ，ＡＴＰ就会促使氧合 荧光素的合成并释放可见光。ＣＣＤ检测后通过软件转 化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正 比［４］。此后，Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司和 ＡＢＩ公司相继推出了 Ｓｏｌｅｘａ［５］和ＳＯＬｉＤ（ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｏｌｉｇｏｌｉｇａｔｉｏｎｄｅｔｅｔｉｏｎ）［６］测 序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似，核心思想 都是边合成边测序（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），即生成新 ＤＮＡ互补链时，要么加入的 ｄＮＴＰ通过酶促级联反应 催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的 ｄＮＴＰ或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放 出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰 值，获得互补链序列信息。由此可见第二代测序技术 无需进行电泳，操作极为简便。这不但大大节省了成 本和时间，而且可以在芯片上进行高通量分析。该测 序技术单次反应可以对数以百万计的样品进行分析， 这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。假 如利用这种方法进行人类基因组的测序，那么在数天 内就可以完成，而且成本也将大大降低。 　　Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司目前拥有三种测序平台，分别为 ＨｉＳｅｑ２０００、ＨｉＳｅｑ１０００、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘ（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／）；ＡＢＩ公司则主要是 ＳＯＬｉＤ３和 ＳＯＬｉＤ４两个测序平台。ＨｉＳｅｑ２０００测序平台单次反 应可以读取２００Ｇ的数据，而ＳＯＬｉＤ４仅为１００Ｇ左右。 从通量这个最直观的数字看来，ＨｉＳｅｑ２０００领先于 ＳＯＬｉＤ４。更高的通量就意味着更低的成本，利用 ＨｉＳｅｑ２０００以３０倍的覆盖度对两个人类基因组进行测 序，每个基因组的费用不到 １万美元（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｈｉｓｅｑ＿２０００．ｉｌｍｎ）。就测序读长 来说，４５４测序平台读长最长，目前已经达到４００ｎｔ。因 此，４５４平台比较适合对未知基因组从头测序，但是在 判断连续单碱基重复区时准确度不高。Ｓｏｌｅｘａ测序读 长较４５４短，仅为１００ｎｔ左右，但测序通量高、价位低， 适合基因组重测序等。ＳＯＬｉＤ读长也较短，但测序精度 较高，特别适合ＳＮＰ检测等。 １．２　单分子测序技术 　　在第二代测序平台不断完善和广泛应用的同时， 以对单分子 ＤＮＡ进行非 ＰＣＲ测序为主要特征的更新 的测 序 技 术 也 初 显 端 倪。２００８年 ４月，Ｈｅｌｉｃｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ公司的 Ｈａｒｒｉｓ等［７］在 Ｓｃｉｅｎｃｅ上报道了他们 开发的基于全内反射显微镜（ｔｏｔａｌＩｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＩＲＭ）的测序技术—单分子测序技术。该 技术完全摒弃了上述测序平台所基于的ＰＣＲ扩增的信 号放大过程，真正达到了读取单分子荧光的能力。具 体原理为：首先，将待测 ＤＮＡ样品随机打断成小片段， 在每个小片段的末端加上 ｐｏｌｙｄＡ；然后，将小片段 ＤＮＡ模板与固定在检测芯片上的 ｐｏｌｙｄＴ引物进行杂 交并精确定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子。 在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤、成像，之后 切开荧光染料和抑制基团，洗涤、加帽，允许下一个核 苷酸的掺入。这样通过掺入、检测和切除的反复循环， 即可实时读取大量序列。随后，他们利用该技术对 Ｍ１３基因组进行重测序。Ｍ１３噬菌体是一种单链ＤＮＡ 病毒，基因组全长６４０７个核苷酸。他们共获得了２８ 万条序列，开创了单分子高通量测序的先河。这之后 不久，ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司又开发出了另一种单分子 测序技术———单分子实时技术（ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｒｅａｌ ｔｉｍｅ，ＳＭＲＴ）［８］。该技术利用单分子技术和 ＤＮＡ聚合 酶，在聚合反应的同时就可以读取测序产物。ＳＭＲＴ测 序技术在测序速度、读长和成本方面有着巨大的优势 和潜力。虽然目前的读取速度为３ｂｐ／ｓ，但他们声称将 在２０１３年前实现三ｍｉｎ测完人类基因组的目标。从而 又向１０００美元测定一个人类基因组的目标迈出了一 大步。 １．３　ＩｏｎＰＧＭ测序技术 　　与 Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序技术相比，上述测 序技术在测序速度和成本方面都有了革命性的变革。 但是，测序仪的价格非常昂贵。例如，目前 Ｈｅｌｉｃｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ公司的 ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ测序仪售价近百万美元， 这是一般实验室和科研单位所不能承受的。２０１０年年 底，ＬｉｆｅＴｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ公司推出的 ＩｏｎＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭＴＭ）测序仪价格仅为普通测序仪的 １／ １０，很好的解决了这一问题。ＩｏｎＰＧＭ测序仪的设计是 基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微孔中固定 ＤＮＡ链，随后依次掺入 ＡＣＧＴ。随着每个碱基的掺入， 释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到。 与其它新一代测序仪相比，它不需要激光、照相机或标 记，价格当然要便宜很多。这种独特的流体体系、微体 系机械设计和半导体技术的组合，使得研究人员能够 在２ｈ内获取从 １０Ｍｂ到 １Ｇｂ以上高精确度序列 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｏｎｐｇｍ／）。 １．４　高通量测序技术的优点 　　高通量测序技术有三大优点是传统 Ｓａｎｇｅｒ测序法 所不具备的。第一，它利用芯片进行测序，可以在数百 ０１１ Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 ２０１２，３２（１） 王兴春 等：高通量测序技术及其应用 万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极致， 因此也称之为大规模平行测序（ｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭＰＳＳ），这一点是大家所熟知的。 第二，高通量测序技术有完美的定量功能，这是因为样 品中某种ＤＮＡ被测序的次数反映了样品中这种 ＤＮＡ 的丰度。这一点有望取代以前的基因表达芯片技术用 于基因表达的研究。第三，成本低廉。利用传统Ｓａｎｇｅｒ 测序法完成的人类基因组计划总计耗资２７亿美元，虽 然比预计的３０亿美元节省了不少，但仍是一个耗资巨 大的工程。而现在利用高通量测序技术进行人类基因 组测序，耗资不到传统测序法的１％［９］。 ２　高通量测序技术的应用 　　高通量测序技术的迅猛发展，将基因组学水平的 研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物科学家 对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平。高通 量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用 于基因表达分析、非编码小分子 ＲＮＡ的鉴定、转录因 子靶基因的筛选和ＤＮＡ甲基化等相关研究。 ２．１　高通量测序技术在全基因组测序中的应用 　　全基因组测序对全面了解一个物种的分子进化、 基因组成和基因调控等有着非常重要的意义。但是， 高通量测序技术在发展初期由于读长较短，使其在对 未知基因组从头测序（ｄｅｎｏｖｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）的应用受到 限制，只能用于基因组重测序。基因组重测序是指对 已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序， 并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。２００８年 ４月１７日的Ｎａｔｕｒｅ杂志上，美国的科学家发表了首个 利用新一代高通量测序技术得到的人类全基因组，这 个基因组正是“ＤＮＡ之父”ＪａｍｅｓＤ．Ｗａｔｓｏｎ的 ［９］。整 个测序过程在 ２个月内就完成了，花费不到 １００万 美元。 　　随着高通量测序技术的不断完善，独立应用该技 术进行全基因组从头测序成为可能。２０１０年１月２１ 日，由深圳华大基因研究院发起，中国科学院昆明动物 研究所、中国科学院动物研究所、成都大熊猫繁育研究 基地和中国保护大熊猫研究中心参与的大熊猫基因组 测序成果以封面文章的形式发表在国际权威杂志 Ｎａｔｕｒｅ上［１０］。这是全球第一个完全使用高通量测序技 术完成的基因组序列图。 ２．２　高通量ＲＮＡ测序及其在转录组和基因表达调控 研究中的应用 　　转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发 点，是全基因组测序完成后首先要面对的问题。最近 科学家们将高通量测序技术应用于转录组分析开发出 了ＲＮＡ测序技术（ＲＮＡＳｅｑ），该技术能够在全基因组 范围内检测基因表达情况，进行差异基因筛选分析。 由于ＲＮＡＳｅｑ技术具有通量高、可重复性高、检测范围 宽、定量准等特点，已经广泛应用于细菌、拟南芥、水稻 和人类等生物转录组的研究。我国在应用ＲＮＡＳｅｑ进 行水稻转录谱分析方面走在了世界的前列。王俊和韩 斌领导的研究小组利用ＲＮＡＳｅｑ技术分别对水稻的转 录组进行高分辨率的分析，发现水稻具有可变剪切模 式基因数目远远高于预期［１１１２］。 　　转录组研究是从整体水平研究基因功能以及基因 结构。但是，多数研究人员感兴趣的是某一特定的生 物过程、发育阶段或处理后的基因表达情况。基因芯 片技术曾在该领域的研究中发挥了重要的作用，但它 只能检测已知序列的特征，对于未知的序列无能为 力［１３］。而建立在高通量测序基础上的数字化基因表达 谱（ｄｉｇｉｔａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）分析无需预先针对 已知序列设计探针，即可对任何生物整体转录活动进 行检测，因此应用范围更加广泛。最近，Ｅｖｅｌａｎｄ等［１４］ 成功地将数字基因表达谱应用于玉米雌穗发育的研 究，并发现了一批调控花序结构的基因。 　　高通量 ＲＮＡ测序技术另一个广泛应用的领域是 小ＲＮＡ的研究。小ＲＮＡ在植物的生长、发育和外界胁 迫应答等方面具有重要功能。但由于小 ＲＮＡ序列短、 同源性高，因此利用基因芯片检测小 ＲＮＡ非常困难。 高通量测序技术不但能够克服这一难题，而且能够发 现新的小ＲＮＡ。目前，高通量测序技术已经成功的应 用于拟南芥［１５］、水稻［１６］和小麦［１７］等生物小 ＲＮＡ的 研究。 ２．３　ＣｈＩＰＳｅｑ技术及其在 ＤＮＡ和蛋白质相互作用 研究中的应用 　　染色质免疫共沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ＣｈＩＰ）技术是研究体内蛋白质与 ＤＮＡ之间相互作用的 强有力工具，在转录因子结合位点或组蛋白特异性修 饰位点的研究中被广泛应用［１８］。最近诞生的染色质免 疫 共 沉 淀 测 序 （ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣｈＩＰＳｅｑ）技术充分结合了 ＣｈＩＰ和高通量 测序技术的优势，能够在全基因组范围内高效地研究 １１１ Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 Administrator 波浪线 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１２０１２ 目的蛋白的结合位点。该技术的原理是：首先通过 ＣｈＩＰ技术利用抗体特异性地富集交联的目的蛋白 ＤＮＡ复合体；然后再将得到的ＤＮＡ片段进行高通量测 序；最后将获得的数百万条序列标签精确定位到基因 组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白或转录因子 等互作的ＤＮＡ区段信息。该方法克服了以往染色质 免疫共沉淀芯片（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｃｈｉｐ， ＣｈＩＰｃｈｉｐ）技术依赖于实验者选择探针的不足，可以为 任何生物测序［１９］。２００７年，应用ＣｈＩＰＳｅｑ技术获得研 究成果分别发表在 Ｓｃｉｅｎｃｅ［２０］、Ｎａｔｕｒｅ［２１］和 Ｃｅｌｌ［２２］三大 顶级刊物上。我们在体细胞胚胎发生的研究中发现了 一个ＰＧＡ３７基因，该基因编码一个 Ｒ２Ｒ３ＭＹＢ转录因 子，在植物体细胞胚胎发生和脂肪酸生物合成过程中 起着重要的调控作用［２３］。分离并鉴定 ＰＧＡ３７的靶基 因是阐明该基因生物学功能的关键。为此，我们正与 有关测序公司洽谈，利用 ＣｈＩＰＳｅｑ技术来筛选 ＰＧＡ３７ 的靶基因。 ２．４　高通量测序技术在基因组ＤＮＡ甲基化分析中的 应用 　　ＤＮＡ甲基化在维持细胞正常功能、遗传印记和胚 胎发育过程中起着极其重要的作用。新一代高通量测 序技术使得基因组整体水平高精度的甲基化检测成为 现实。目前，已经建立了至少三种依赖于高通量测序 的ＤＮＡ甲基化分析技术：甲基化ＤＮＡ免疫共沉淀测序 （ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＭｅＤＩＰＳｅｑ）［２４］、甲基结合蛋白测序（ｍｅｔｈｙｌｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＭＢＤＳｅｑ）和亚硫酸氢盐测序 （ｂｉｓｕｌｆｉｔｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＢＳＳｅｑ）［２５］。它们之间的区别在 于前两种方法首先通过特异性结合甲基化 ＤＮＡ的 ＭＢＤ２ｂ或５′甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的ＤＮＡ，然 后再对富集到的片段测序，而第三种方法不经过富集 直接测序。虽然 ＭｅＤＩＰＳｅｑ和 ＭＢＤＳｅｑ都是基于富 集的原理，但二者是相辅相成的策略。ＭｅＤＩＰＳｅｑ对高 度甲基化和高密度的 ＣｐＧ更加敏感，而 ＭＤＢＳｅｑ对高 度甲基化和中等ＣｐＧ密度更加敏感［２６］。目前，高通量 测序技术已经广泛应用于拟南芥［２５］、水稻［２７］、蚕［２８］和 人［２６］等生物 ＤＮＡ甲基化的研究，并取得了丰硕的 成果。 ３　高通量测序技术存在的问题及其发展趋势 　　尽管高通量测序技术有诸多的优势，但其局限性 也不容忽视。第一，测序速度提高了，但后续的海量测 序数据的分析却成为一大难题［２９］。第二，高通量测序 技术不适合小规模测序。虽然高通量测序技术的价格 不断降低，但一次反应仍需几千至数万元的花费。这 对于ＰＣＲ产物和质粒等数十到数千个碱基的测序，一 般客户将是很难接受的，这时传统 Ｓａｎｇｅｒ测序法无疑 还是最佳的选择。最后，新一代测序仪价格昂贵，动辄 几百万元，一般的小型实验室难以承受。因此，传统 Ｓａｎｇｅｒ将与高通量测序技术长期并存，在短期内还不会 被淘汰［３０］。另外，高通量测序技术只是研究的开端，现 在我们所能解释的生物学现象和机制还很有限，即使 获得了基因组信息，如何去解释和应用它，仍是一个长 远的问题。 　　测序技术的发展日新月异，本文所述的焦磷酸测 序等测序平台都依赖生物化学反应。这不但加大了测 序成本，而且浪费了时间，不利于测序速度的提升。因 此，非光学显微镜成像、纳米孔和生物孔等直接测序技 术是未来的发展方向［３０］。相信随着高通量测序成本的 进一步降低和对海量数据处理能力的不断提高，高通 量测序将成为一项常规的实验手段，并为生物学和生 物医学研究领域带来革命性的变革。 参考文献 ［１］ＭａｒｄｉｓＥＲ．ＮｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｎｕ ＲｅｖＧｅｎｏｍｉｃｓＨｕｍＧｅｎｅｔ，２００８，９：３８７４０２． ［２］ＳｕｌｔａｎＭ，ＳｃｈｕｌｚＭＨ，ＲｉｃｈａｒｄＨ，ｅｔａｌ．Ａｇｌｏｂａｌｖｉｅｗｏｆｇｅｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２１（５８９１）：９５６９６０． ［３］ＳｃｈｕｓｔｅｒＳＣ．Ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍｓｔｏｄａｙ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｙ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ，２００８，５（１）：１６１８． ［４］ ＭａｒｇｕｌｉｅｓＭ，Ｅｇｈｏｌｍ Ｍ，ＡｌｔｍａｎＷ Ｅ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｐｉｃｏｌｉｔｒｅｒｅａｃｔｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３７（７０５７）：３７６３８０． ［５］ＰｏｒｒｅｃａＧＪ，ＺｈａｎｇＫ，ＬｉＪＢ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ｌａｒｇｅｓｅｔｓｏｆｈｕｍａｎｅｘｏｎｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ，２００７，４（１１）：９３１ ９３６． ［６］ＯｎｄｏｖＢＤ，ＶａｒａｄａｒａｊａｎＡ，ＰａｓｓａｌａｃｑｕａＫＤ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｐｐｉｎｇｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳＯＬｉＤ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｔｏａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００８，２４（２３）：２７７６２７７７． ［７］ＨａｒｒｉｓＴＤ，ＢｕｚｂｙＰＲ，ＢａｂｃｏｃｋＨ，ｅｔａｌ．ＳｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆａｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２０（５８７２）：１０６ １０９． ［８］ＥｉｄＪ，ＦｅｈｒＡ，ＧｒａｙＪ，ｅｔａｌ．ＲｅａｌｔｉｍｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２３（５９１０）：１３３ ２１１ ２０１２，３２（１） 王兴春 等：高通量测序技术及其应用 １３８． ［９］ＷｈｅｅｌｅｒＤＡ，ＳｒｉｎｉｖａｓａｎＭ，ＥｇｈｏｌｍＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅｏｆａｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｂｙｍａｓｓｉｖｅｌｙｐａｒａｌｌｅｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５２（７１８９）：８７２８７６． ［１０］ＬｉＲ，ＦａｎＷ，ＴｉａｎＧ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆｔｈｅｇｉａｎｔｐａｎｄａｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６３（７２７９）：３１１３１７． ［１１］ＬｕＴＴ，ＬｕＧＪ，ＦａｎＤＬ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｃｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｔｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｓｅｑ． ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２０１０，２０（９）：１２３８１２４９． ［１２］ＺｈａｎｇＧＪ，ＧｕｏＧＷ，ＨｕＸＤ，ｅｔａｌ．ＤｅｅｐＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｔ ｓｉｎｇｌｅｂａｓｅｐａｉｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｓｈｉｇｈｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｔｈｅｒｉｃｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２０１０，２０（５）：６４６６５４． ［１３］滕晓坤，肖华胜．基因芯片与高通量 ＤＮＡ测序技术前景分 析．中国科学 Ｃ辑：生命科学，２００８，３８（１０）：８９１８９９． ＴｅｎｇＸＫ，ＸｉａｏＨＳ．ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｆＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒｙａｎｄｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＳｃｉｅｎｃｅｉｎＣｈｉｎａＳｅｒｉｅｓ ＣＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００８，３８（１０）：８９１８９９． ［１４］ＥｖｅｌａｎｄＡＬ，ＳａｔｏｈＮａｇａｓａｗａＮ，ＧｏｌｄｓｈｍｉｄｔＡ，ｅｔａｌ．Ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｆｏｒｍａｉｚｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ， ２０１０，１５４（３）：１０２４１０３９． ［１５］ＬｕＣ，ＴｅｊＳＳ，ＬｕｏＳ，ｅｔａｌ．ＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｍａｌｌＲＮＡ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，３０９（５７４０）： １５６７１５６９． ［１６］ＳｕｎｋａｒＲ，ＺｈｏｕＸ，ＺｈｅｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌａｎｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅｍｉＲＮＡｓｉｎｒｉｃｅｂｙｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ ＰｌａｎｔＢｉｏｌ，２００８，８：２５４１． ［１７］ＹａｏＹ，ＧｕｏＧ，ＮｉＺ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｆｒｏｍｗｈｅａｔ（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）．ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ， ２００７，８（６）：９６１０８． ［１８］ＳｏｌｏｍｏｎＭＪ，ＬａｒｓｅｎＰＬ，ＶａｒｓｈａｖｓｋｙＡ．ＭａｐｐｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｖｉｖｏｗｉｔｈｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｉｓ ｒｅｔａｉｎｅｄｏｎａｈｉｇｈｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ，１９８８，５３（６）：９３７ ９４７． ［１９］ＰａｒｋＰＪ．ＣｈＩＰｓｅｑ：ａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆａｍａｔｕｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ，２００９，１０（１０）：６６９６８０． ［２０］ＪｏｈｎｓｏｎＤＳ，ＭｏｒｔａｚａｖｉＡ，ＭｙｅｒｓＲＭ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇｏｆｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎＤＮＡｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１６ （５８３０）：１４９７１５０２． ［２１］ＭｉｋｋｅｌｓｅｎＴＳ，ＫｕＭ，ＪａｆｆｅＤＢ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｍａｐｓｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔａｔｅｉｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔａｎｄ ｌｉｎｅａｇｅｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４８（７１５３）：５５３５６０． ［２２］ＢａｒｓｋｉＡ，ＣｕｄｄａｐａｈＳ，ＣｕｉＫ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ，２００７，１２９ （４）：８２３８３７． ［２３］ＷａｎｇＸ，ＮｉｕＱＷ，ＴｅｎｇＣ，ｅｔａｌ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＧＡ３７／ ＭＹＢ１１８ ａｎｄ ＭＹＢ１１５ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｔｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＣｅｌｌＲｅｓ，２００９，１９（２）：２２４２３５． ［２４］ＤｏｗｎＴＡ，ＲａｋｙａｎＶＫ，ＴｕｒｎｅｒＤＪ，ｅｔａｌ．ＡＢａｙｅｓｉａｎ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（７）：７７９７８５． ［２５］ＣｏｋｕｓＳＪ，ＦｅｎｇＳ，ＺｈａｎｇＸ，ｅｔａｌ．Ｓｈｏｔｇｕｎｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｏｍｅｒｅｖｅａｌｓＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５２（７１８４）：２１５２１９． ［２６］ＬｉＮ，ＹｅＭ，ＬｉＹ，ｅｔａｌ．ＷｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，５２（３）：２０３２１２． ［２７］ＹａｎＨＨ，ＫｉｋｕｃｈｉＳ，ＮｅｕｍａｎｎＰ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｍａｐｐｉｎｇ ｏｆｃｙｔｏｓｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｄｙｎａｍｉｃＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｎｅｓａｎｄｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅｓｉｎｒｉｃｅ．ＰｌａｎｔＪ， ２０１０，６３（３）：３５３３６５． ［２８］ ＸｉａｎｇＨ，ＺｈｕＪ，ＣｈｅｎＱ，ｅｔａｌ．Ｓｉｎｇｌｅｂａｓｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｏｆｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍｒｅｖｅａｌｓａｓｐａｒｓｅｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｍａｐ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，２８（５）：５１６５２０． ［２９］ＧｉｌａｄＹ，ＰｒｉｔｃｈａｒｄＪＫ，ＴｈｏｒｎｔｏｎＫ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｎａｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００９，２５（１０）：４６３４７１． ［３０］ＺｈｏｕＸ，ＲｅｎＬ，ＬｉＹｅｔａｌ．Ｔｈｅｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｒｅｖｉｅｗａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＳｃｉＣｈｉｎａ ＬｉｆｅＳｃｉ，２０１０，５３（１）：４４５７ ＨｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＡＮＧＸｉｎｇｃｈｕｎ１，２　ＹＡＮＧＺｈｉｒｏｎｇ３　ＷＡＮＧＭｉｎ１　ＬＩＷｅｉ１　ＬＩＳｈｅｎｇｃａｉ２ （１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ　０３０８０１，Ｃｈｉｎａ） （２ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ　０３０８０１，Ｃｈｉｎａ） （３ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｒｔｓａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ　０３０８０１，Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＡｓａｍｉｌｅｓｔｏｎｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１１ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１２０１２ ｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙｆｏｒｔｈｅｍｏｄｅｒｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙ４５４，ＳｏｌｅｘａａｎｄＳＯＬｉＤ），ｔｈｅｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙＨｅｌｉＳｃｏｐｅＴＩＲＭａｎｄＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳＭＡＲＴ）ａｎｄｔｈｅＩｏｎ ＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇｌｏｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｎｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． 　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＮｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ４１１