[精]葡萄糖氧化脢的應用(HOME WORK)
葡萄糖氧化脢的應用:Application of Glucose Oxidase :
整理:生科碩一 陳世昌
I. 簡介葡萄糖氧化脢
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,簡稱GOD或GOX:本質上是一種需氧的脱氫脢,它能夠將β-D葡萄糖氧化成為葡萄糖酸和過氧化氫。
1928年,Muller首先從黑麴黴(Aspergillus niger)的萃取液中發現GOD。 1960年Kusai等、1964/65年Pazur/Swobodda等分别從青黴素黴和黑麴黴纯化GOD。
1995年,Petruccioli等人用青黴素黴(P. Variable)的突變株生產GOD。而 Federici等人則用Penicilium Variable 80-10突變株生產GOD。Gazillo等人應用離子交换樹脂和膠體過濾層析法將過濾液中的GOD纯化了30倍,測得天然GOD為一二聚體結構分子,分子量為126,000,其單體分子量則為62,000。
GOD的最佳反應條件為:溫度55?C,PH為6.0。其Km=6.0mM,PI=4.8-4.9。
+++而GOD的酶反應會受到Cu和Ag等重金屬離子的抑制。
葡萄糖氧化脢屬於雙體蛋白質,其每一個單體含有一個flavin adenine dinucleotide (FAD)作為其cofactor。失去cofactor的GOD apo-enzyme也就喪失了催化活性。葡萄糖氧化脢為一糖甘化:glycosylated:蛋白質,含有16,的碳水化合物,大部份是mannose type。
葡萄糖氧化脢是一個橢圓形的分子。富含蛋白質二級結構(28% helix, 18% sheet),其三級結構的特點為含有兩個不同且分開的β-sheet 系統。一個β-sheet系統形成FAD的結合領域,binding domain,,另一個β-sheet 系統含有6股反向平行的β-sheet,形成其活性位,active site,的一邊。
葡萄糖氧化脢的反應
葡萄糖氧化脢的學名為,β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase,
EC1.1.3.4,能將β-D-glucose催化成為D-glucono-1,5-lactone,同時產生過氧化氫,hydrogen peroxide,H2O2,, 其間會耗用掉一分子氧作為電子的接受者,electron acceptor,【見eq. 1】。反應的初產物D-glucono-1,5-lactone會有競爭性抑制GOD的作用,但是其本身則會自然地水解成gluconic acid【見eq. 2】,此反應速率常數與pH 有關,當pH 3.0時,反應速率慢,在pH 8.0時,反應速率則相當快。
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Eq.1 ,adapted from www-biol.paisley.ac.uk,
eq.2 ,adapted from www-biol.paisley.ac.uk,
在反應過程,氧分子為天然的電子接受者,氧分子與FAD形成中間產物4α-hydroperoxy FAD,再分解成H2O2與FAD。見fig. 3 fig. 3 ,adapted from www-biol.paisley.ac.uk,
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由葡萄糖氧化脢催化的葡萄糖氧化反應,其熱焓值,enthalpy,的變化足以由電熱調節器,thermistor,偵側到。這是許多葡萄糖生物感應器,glucose biosensor,組裝架構的根據。
由放射性標定研究,得知過氧化氫的氧是來自氧分子,而不是水分子的氧。葡萄糖氧化脢對其反應物β-D-glucose
表
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現出高度的特異性,specificity,。雖然2-deoxy-D-glucose, D-mannose 和 D-fructose也會被葡萄糖氧化脢氧化,但是其反應速率都相當緩慢。
,,實際應用上,在食品製造和加工業,主要是利用GOD的催化反應會消耗氧氣同時產生過氧化氫,而在葡萄糖生物檢測方面,則是以選擇性的人工試劑,artificial reagent ,取代天然的氧分子作為電子的接受體,electronic
acceptor,,或改造FAD使其與電子媒介物,electronic mediator,偶合
,coupling,,再經由所選用人工試劑或電子媒介物的下游反應來偵測葡萄糖的
濃度。
II. 葡萄糖生物感應器:glucose biosensor:
量測原理 :
電流式酵素電極利用酵素之特性,將其反應速率轉換成電流,供後續電路之檢測。
在第一代的電極設計中,係利用酵素之自然反應完成偵測:
加入GOD催化下列反應
Glucose + O2 ------> Gluconolactone + H2O2
必需利用氧電極或過氧化氫電極配合葡萄糖氧化脢(Glucose Oxidase, GOD)
來量測;其電極設計較複雜也易受週遭氧氣濃度之影響。
在第二代電極的設計中,則是針對上述方法加以改進,利用中間步驟產物作為電子媒介物:electronic mediator::
Glucose + GOD/FAD ---> Gluconolactone + GOD/FADH2
+GOD/FADH2 +2M -------> GOD/FAD+2M' +2H
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再利用電極配合電子媒介物(M,mediator)來偵測。
-2M' ------> 2M + 2e
3-+‘可以是ferrocene/ferrocinium couples或Fe[(CN)6]或NMP等加以其中M/M
選擇。其電極通常是金(Au),鉑(Pt),或石墨(Graphite Carbon),因為電子媒介物之氧化還原電位較低(+100至400 mV Vs. SCE),故可避免受到維生素C (Ascorbic Acid) 等干擾物之影響。
作用原理如下二圖:
fig 1.人工偶合FAD-Fc
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Fig. 2 偶合FAD-mediator 的生物化學電池漕
:adapted from www-biol.paisley.ac.uk:
儀器的組裝可利用微機電系統(MEMS)與半導體技術:積體化電極電路:,系統則包含了微感測器(Microsensor)、單晶片微處理器以及液晶顯示器(LCD)這些可攜帶元件。微感測器包含有兩電極(WE, RE)、電流電壓轉換和OP放大器。微
2,2感測器的大小約為1. mm電極的面積可為0.5 mm。
III. 葡萄糖氧化脢在醫藥上的應用
GOD和過氧化物酶可配製成測定葡萄糖的酶類套裝試劑,這種
試劑Fehlin試劑更準確,簡便和快速。分别含有GOD,醇氧化酶,
吡喃糖氧化酶,L-氨基酸氧化酶和L-乳酸脱氫酶的FIA系统可用於監
測發酵過程中培養基组成分的變化。
含GOD,LPO和乳鐵蛋白的飼料添加劑可用於預防牲畜胃腸道
感染和腹瀉。
含GOD和溶菌酶的植物噴灑劑可誘導植物抗毒素的生成,有利
於植物生長。
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防治口腔疾病:
GOD和乳酸過氧化物酶(LPO),溶菌酶等酶製劑可除去或缓解牙斑,牙垢和龋齒的形成;含有GOD的牙科藥劑其穩定性提高三倍。含有GOD,LPO和含碘化合物等成分的製劑,可用預防口腔滋生口臭。GOD,LPO和硫氰酸钾等用於製造药物牙膏和配製爽口液。有一商品名為Biotene的牙膏也含有相似成分。含GOD和LPO的双酶口香糖,在咀嚼時有96-99%的抑菌效果。
物的抗氧化劑。把一些對氧敏感的電子装置保於含GOD可用作藥
護性小氣候有GOD和觸酶的密封箱内使氧降低到1.2-2.4%。這種保(micro-climate ,micro-enviroment)可维持一年以上。
,LPO和NaSCN的凝膠配方對單純性疱疹病毒(HSV-1),含有GOD
人類免疫不全病毒(HIV)和生殖器疱疹有緩解作用。GOD能增加某些淋巴腫瘤的血 管渗透性,也許,GOD可用於對HO敏感的淋巴瘤的目標導向22
性治療。
IV. 葡萄糖氧化脢在食品加工上的應用
1. 蛋白的脱糖
蛋白是製造糖果和糕餅的發泡劑。新鲜的蛋白含有少量的葡萄糖,製造後的蛋白储藏久了會變成褐色。用GOD脱糖可,提高品質。在全蛋液中GOD/葡萄糖系统具有抗菌作用,可延緩细菌的滋生期達6天。 2. 食品的除氧
罐頭食品的殘留的氧氣會腐蝕罐壁,影響產品的色香味。經過GOD處理後可去氧保鲜,改善食品和飲料的品質。
如用GOD可使醬油淡色,降低色素(450-570 nm)的吸光度。
豆漿用GOD和觸酶處理可消除豆腥味。
炸花生容易變成褐色,如油炸前將花生浸在GOD溶液中,可减少花生中的葡萄糖,增加其保存期。
烘培麵包時,加入木聚糖酶和GOD可以改善麵包的品質、結構、體積和外觀。
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將含有GOD、溶菌素、維生素C等製劑加入麵條中,經煮熟,密封在PVC袋中,30?C保存5天,不產生腐敗現象。
用GOD和SOD可除去肉類製品罐頭頂部的氧氣,可防止油脂的氧化作用。
將GOD和糖固定在包装紙上,用這種纸包装油脂和乳酪,能防止油脂的氧化和腐敗。
食品經GOD和觸酶處理後,可延長其上架的時間。
將含GOD和觸酶的葡萄糖漿塗在焙烤的食物上 ,可以在4?C,100%CO下保存25天,氧含量幾乎為0%。 2
氧氣和光不利於蛋黄酱(美乃茲,Mayonnaise)的穩定性。不加抗氧化劑,在室温下貨架保存期只有一天。若油相中含檸檬酸鈉鹽;水相含有EDTA和維生素C,其保存期可延長49天;如加在冰箱保存,可放置89天;再應用氧清除系统GOD/觸酶/葡萄糖,則可延長貨架保存期到132天。
3. 非酒精飲料,soft drink,品質的改善
(a) 榨的鮮果汁、檸檬汁很快會失原有的香味,用GOD/觸
酶製劑處理後,可使鲜果汁的殘氧量降低到,1ppm,可
以保鮮。
(b) 葡萄汁先用GOD和觸酶處理後,再發酵,可製成味好
的低度葡萄酒。
(c) 把GOD和觸酶一起固定化,可用於啤酒的脱氧處理。
(d) GOD/過氧化物酶系統具有穩定貨架上果汁色香味的作
用。經過處理的果汁,其葡萄糖含量可减少約60%,減
少褐色變性率。
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(e) GOD/過氧化物酶系統具有穩定貨架上果汁色香味的作
用。經過處理的果汁,其葡萄糖含量可减少約60%,減
少褐色變性率。
4. 海鲜保鲜
GOD和觸酶溶液可用於防止水產海鮮的腐敗,可延長微生物
的生長停滞期達5天,减少褐變80%和抑制NH和氮氣的生成。3
用適量GOD溶液處理魚類可防止魚肉變色,抑制氧化作用。用
GOD保存魚肉可抑制脂肪的氧化。用0.5U/mLGOD加上1-4mg/mL
葡萄糖既能维持抑菌效果又不至於因PH值過低而使魚蛋白發生
沉澱現象。
5. 葡萄糖酸鈣的生產:利用固定化GOD可生產葡萄糖酸鈣。 6. 用GOD和轉化酶可以製備不含葡萄糖的果糖漿。
7. 含有GOD和硅藻土等的LDPE模具有吸氧作用,用來包装香腸,可
抑制微生物,防止腐敗。
8. 用GOD處理新鲜红花瓣,再分離得到的红花胺(Carthamin)。可提高
收穫率三倍。
9. 癒創素(Guaiazulene)溶液經GOD處理後在光照下可貯存183天,
無光分解發生,而對照組很快便被光解。
10. 將GOD與澱粉酶共同固定化後,可用來測定支鏈粉酶。 11. GOD試劑可用來測定發酵罐的通氣能力。
V. 葡萄糖氧化脢在環境上的應用
用GOD和觸酶可以漂白木材。這種漂白作用對木材無害。 VI. 結論
目前,GOD主要應用在食品加工上的脫氧及脱糖作用,以及作為葡萄糖檢測套裝試劑( reagent kit)的主要原料。如進一步改變其分子結構、或改良其反應進行的模式,那麼GOD將有更廣泛的應用價值。
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