两种Ames试验方法在蒲葵子提取物致突变试验中灵敏度的研究

两种Ames试验方法在蒲葵子提取物致突变试验中灵敏度的研究 两种Ames试验方法在蒲葵子提取物致突变试验中 灵敏度的研究 【摘要】目的通过Ames试验与彷徨试验对蒲葵子正丁醇提取物的致突变试验 结果，比较两种试验的灵敏度。方法对蒲葵子用正丁醇浸提，用Ames试验方法 (掺入法)与彷徨试验方法，对TA100鼠伤寒沙门氏菌株进行致突变试验。结 果两种试验方法结果显示，蒲葵子正丁醇提取物在5?500 M g/ml剂量范围， 以Ames试验方法与彷徨试验均检测出阳性结果，而在0.025 p g/ml与0. 5 M g/ml剂量下，彷徨试验能检测出阳性结果，而Ames方法未检测出阳性结果。 结论在较低浓度时，彷徨试验能检测出Ames试验检测不出的陌性结果，表明彷 徨试验灵敏度较Antes试验高。 【关键词】正丁醇提取物;Ames;彷徨拭验;灵敏度 Abstract: ObjectiveTo compare the sensitivity of the Fluctuation test and Ames test for examination of the sudden change caused by Chinese fan-palm sub-normal butyl alcohol extraction. MethodsChinese fan-palm was extracted with the normal butyl alcohol, and Ames test and Fluctuation test were carried out to detect TA100 mouse salmonella typhimurium. ResultsThe results demonstrated that the extract in the range of 5?500 |J g/ml, the Ames test method and the fluctuation test method detected the positive result, and in the range of 0. 025?0. 5 |J g/ml, the Fluctuation test could examine positive result, but the Ames test could not change. Conclusionln low concentration, the Fluctuation test can examine positive result but Ames test can not, which indicated that the Fluctuation test has higher sensitivity than the Ames test. Key words: Normal butyl alcohol extraction; Ames; Fluctuation test; Sensitivity 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)，是利用一组组氨 酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突 变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现巳成为初步筛选化学物潜在致突变的首 选方法。彷徨试验也是一种细菌回复突变试验，根据营养缺陷型菌株与受试化 学物温育后在缺乏相应营养物的培养液中的生长情况判断所试化学物的诱变活 性，节省试验材料(辅酶I其需Ames平板掺入法用量的20%)。实验结果表明， Ames试验结果与动物致突变性有90%的相符率，而彷徨试验对于弱的、具有细 胞毒性和低浓度的诱变/致突变物的检测有其优超性。因此这些方法是较好的 化学物质诱变活性评价的试验方法。 蒲葵子正丁醇提取物:蒲葵子分别用95%乙醇回流提取，浓缩成浸膏后， 用正丁醇反复浸提，得到提取物的浓缩部分(以下简称蒲葵子提取物)。 1. 2实验菌株鼠伤寒沙门氏菌变异株组氨酸缺陷型TA100(由美国SIGMA公 司提供)，经鉴定为合格菌株，置于平板备用。 1.3阳性对照物?2-氨基荷，美国SIGMA公司;?叠氮钠，美国SIGMA公 司。 1.4 Ames试验培养液按文献方法[1]配制，彷徨试验培养液按美国SIGMA 公司提供方法配制，体外活化系统(S9混合液)按标准方法经多氯联苯诱导大鼠 肝微粒体酶制备而成[2]。 2方法 2.1 Ames试验用标准平板掺入法[1]，在经灭菌的45?C左右含顶层琼脂 2 ml的试管中，依次加入受试物、菌液各0.1 ml, S9混合液0.5 ml,充分混 匀后倒在底层培养基平板上铺平，37?C培养48h,每次试验同时设阴性，阳性 对照，每个浓度设两个平行平皿，每个受试物至少重复1次，计数平均每毫升 回空菌落数。 2.2彷徨试验(改进的Ames试验)[3]取含组氨酸(2 g/ml)的培养 M液5 ml加过夜培养菌液0. 1 ml, S9混合液0. 1 ml和待测物0. 1 ml,摇勻分 装于50支小试管中，同时做阴性对照，37?C培养20h,各管加入古溴甲酚紫 (5 p g/ml)的培养液2 ml,继续培养3 d,计数变色管数。 3结果 2. 1 Ames试验凡致突变率(MR=受试物平均回变菌落数/阴性对照回变菌落 数)大于或等于2，有剂量反应关系并有重复性的受试物为诱变阳性[4]，结 果见表1。由表1可见蒲葵子提取物对TA100(+S9/-S9)在5?500 M g/ml剂量 范围内表现出诱变阳性。进一步分析见表2，可以看出随着两种化合物浓度的 增加，致突变率均相应增高，经统计学处理，证明浓度与致突变率间呈直线相 关，表明蒲葵子提取物有一定的诱变活性。表1蒲葵子提取物Ames试验结果 受试物浓度(略)表2 Ames试验阳性结果剂量-反应关系比较(略) 3.2仿徨试验结果按公式X2=2n (t-c) 2 / (t+c) (2n-t-c) (n为50支 试管数，t为实验组变色管数，c为对照组变色管数h求P值，当P<0.05时， 判断为致突变阳性。由表3可以看出在Ames试验中蒲葵子提取物在剂量为 0. 025, 0.5 M g/ml时不显示诱变活性，在彷徨试验中对TA100在加S9时表现 诱变活性。而且在5?500 M g/ml时仍显示阳性结果。表3蒲葵子提取物彷 徨试验结果受试物浓度(略) 比较两种试验结果可知:在Ames试验只有在较高浓度时呈现阳性反应。而 彷徨试验可以在比其低数十倍甚至数百倍浓度时呈现阳性结果，说明彷徨试验 的灵敏度高于Ames试验，而且两者可以相互补充。 4讨论 Green等(1976)发明的彷徨试验(Fluctuation test)是Ames试验的一 种改良法。它用液体培养基代替固体培养基，以观察培养管浊度或pH指示剂颜 色的变化代替菌落计数，用试管代替培养皿。通过直观地对各试管中液体颜色 变化的计数，再利用公式对组间进行X 2检验，其结果判定简单、直观、明确、 可靠。其检测效力已被许多研究者所证实。1978年Gatehouse将其改进为彷徨 试验方法，通过文献了解到该方法与常用的筛选致突变物试验Ames试验(掺入 法)比较，有如下的优点:?有较高的敏感性，可以检测出诱变性较弱的致突 变物，从而避免因方法灵敏性较差而造成的假阴性结果。?样品、试剂消耗量 少，可同时进行数个样品的检测。彷徨试验所用菌株为TA100，该菌株可用来 检测点突变和移码突变[5]，该菌株在无外源性组氨酸供给的情况下不能生长 繁殖，但当发生回复突变时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖。由 •丁-一些外源性化学物需经体内代谢活化才具有诱变活性或经代谢而解毒，为了 模拟哺乳动物对外源性物质的体内代谢活化过程，提高测试的准确性，通常在 Ames试验中添加哺乳动物肝微粒体酶制剂(S9)作为外源性物质代谢活化系统 [6]。彷徨试验能够灵敏、迅速地检测到基因的突变情况，是基因突变检测的 主要方法之一。 据文献报道，应用Ames试验平扳掺入法严重不足之点是被测化学物、S9 液、组氨酸加进顶层后可能扩散到底层去，它们的浓度有随时间延长而下降的 趋势，从而影响实验结果，如要提高测试物浓度，其毒性可能威胁细菌的生存。 而彷徨试验克服了这一缺陷，由于其自发突变率和诱发突变率均从相当数量的 细胞中显示出来，且又为液体诱变，故敏感性高于平皿试验，对某些阳性诱变 物的检出浓度比Ames试验低100倍。本次实验也证明了彷徨试验的高灵敏特点， 因而适于检测低水平及很弱的诱变剂。但此法操作费时，一般可作为Ames试验 的补充方法。这两种方法对人和动物的体液监测，环境致突变因素的研究及流 行病学调查中潜在致癌物的检测具有十分重要的作用。 【参考文献】 [1]谢恩C •加德编著，范玉明，李毅民，张舒，等译.药物安全性评 价[M].北京:化学工业出版社,2006: 162. [2] 阚建全,王雅茜,陈宗道，等.甘薯活性多糖抗突变作用的体外实验研 究[J].中国粮油学报,2001, 16(1) :23. [3] 彭克军,刘杰麟.戴氏虫草多糖抗突变活性的研究[J].中药 材’ 2008, 31(1) :86. [4] 王明臣,张善锋,毛红丽,等.Ames实验对叶黄素的致突变性与抗突变 性研究[J] •癌变•畸形•突变,2006，18 (1): 65. [5] Ordaz-Pichardo C, etal. Antiamoebic and toxicity studies of a carbamic acid Derivative and its the rapeutic effect in a hamster model of hepatic amoebiasis [J] . Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3): 1160. [6] 王亚其,李宏霞，肖凯，等.两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒 性试验中活性比较[J].现代预防医学,2006, 33(4):457.