表面等离子共振

表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面等离子共振的原理及在生物医学中的应用 精神卫生研究所 张瀚迪 学号：10281335 摘要：表面等离子共振技术是近年来迅速发展起来的用于 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 生物分子相互作用的一项技 术，它利用全反射时入射光可以和金属表面的等离子发生共振的原理，探测生物分子之间 是否发生作用以及反应的动力学参数。该技术目前已广泛应用于免疫学、蛋白质组学、药 物筛选、蛋白质与核酸相互作用等各个领域，并获得了许多用其它方法无法得到的动力学 数据。 导言：表面等离子共振技术是一项用于分析生物大分子之间的相互作用的技术，它可以定性 的判断两分子之间是否有相互作用，比较一种分子与其他几种分子之间相互作用的强弱，也 可以实时定量的测定分子间相互作用的亲和力参数（平衡常数）和动力学参数（速率常数）， 甚至热力学参数（反应的焓）。该技术是利用了物理光学的原理（下文详述），在研究两分子 相互作用时，将一种分子固定在传感片表面，而另一种分子的溶液流过其表面，两种分子的 结合会使传感片表面的折射率改变，因此检测两分子间的相互作用。1983 年，瑞典 LINKOPING 理工学院应用物理实验室 Liedberg 等人首先把它用于 IgG与其抗原相互作用的 检测[1]，并由 BIAcore 公司开发出 SPR 传感器。此后 SPR 传感器的研究与改进迅速发展， 其在生物医学中的应用也日益广泛。 表面等离子共振技术的基本物理光学原理：如果光波从光密介质（折射率大）射向光疏介 质（折射率小），比如由玻璃射向空气，且入射角大于临界角时，没有折射光产生，入射光 全部反射回去，这一现象称为全反射．．．。全反射时光波在两介质分界面的行为是什么样的呢？ 深入研究指出，全反射时光波将透入第二介质（光疏介质）很薄的一层表面（深度约为光波．．．．．． 波长．．），并沿界面流动约半个波长再返回第一介质（光密介质）。透入第二介质的光波称为倏． 逝波．．。如 Fig 1 所示。 Fig 1 n1 x 倏逝波 n2 < n1 倏逝波是一个沿 x 方向传播的振幅在 z 方向（垂直于两介质界面的方向）按指数衰减的 波。倏逝波最后仍返回第一介质，总的来说光的能量没有进入第二介质。 在两介质的界面镀上一层很薄的金属薄膜，薄膜厚度在倏逝波进入第二介质深度之内。 当一束单频线偏振光以大于全反射临界角的某一角度入射时，如果其频率与金属表面振荡的 自由电子（即等离子）频率一致，则金属表面的等离子就吸收入射光的能量发生共振，这一 现象就是表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR），此时的入射角称为共振角。激 发表面等离子共振的实质在于光波以倏逝波的形式将能量转移成表面等离子共振波，这时， 示。 阴影表示有能量丢失，SPR 仪器可以检测到这一变化，并给出传感图。 反射光的强度和相位均发生剧烈变化[2]。如 Fig 2 所 Fig 2. 入射光（incident light）以入射角 θ照 SPR 传感器的工作原理： 根据这一原理研制了 SPR 传感器，其工作原理如 Fig3 所示。根 Fig 3 典型的 SPR 装置图。被分 析物——“配体”溶液流过固定 有‘受体’的传感片表面，若发 生作用而相互结合则会引起表 面物质质量改变，而折射率与质 在生物医学研究中适合应用 SPR 技术的工作有以下几方面： 1、鉴定大分子 射到 玻璃（glass）与空气（air）的界面，发 生全反射，并产生倏势波（evanescent wave）. 玻璃表面镀了一层很薄的金，由于入射光与金 膜的表面等离子（振荡的表面自由电子）的频 率相匹配，因此发生共振，入射光能量被吸收， 反射光能量降低，出现一吸收峰。 据检测原理，共振角的变化就反应了结合在传感片表面的物质质量的变化。因此通过分析共 振角，我们就可以分析分子之间的相互作用了。在 SPR 中，共振角的单位规定为 RU，即反 应单位或共振单位，1RU=10-4度，根据测量的经验显示，当有 1ng/mm2的蛋白质连接到表面 时，约导致共振角增大 1000RU。由于将分子直接固定到金膜表面很难达到有效的密度使检 测信号足够强，因此发展了 一种方法，即先在金表面铺 一层 100-200nm 厚的葡聚糖 基质，再将，两种反应分子 中的一种作为“受体”固定 在其表面，这样大大提高了 “受体”的密度，但也带来 一些不足，本文不详细讨论。 量成正比，所以折射率改变，欲 保证 SPR 发生，共振角也得随折 射率改变，改变大小与结合的 “配体”质量成正比。反射光中的 左图为共振角大小随传感片表面的分子质量改变而从Ⅰ移到Ⅱ；右图为实时监测共振角的变化，随时间延 长，结合在表面的“配体”-“受体”复合物增多，共振角也随之增大。 ：许多实验室需要生产重组蛋白，很重要的一项工作是确定重组蛋白与作为 模本的原始蛋白结构保持一致，这可以通过验证模本蛋白与原始蛋白的配体是否能够结合来 2、平衡反应的测量（测定反应亲和力与焓） 确定（酶蛋白除外）。配体可以是天然配体，也可以是单克隆抗体。SPR 仪器正适合这项工 作。 [3]（如 Fig 4） 亲和力通常用结合常数（KA）或解离常数（KD）表示，多数人喜欢用 KD。测定亲和力需要 准备一系列浓度的被测物，通过实时分析所得的数据，可以计算得到反应的结合常数或解离 常数。焓的测定：SPR 测定亲和力具有很高的可信度。根据这一点以及某些 SPR 仪器可以精 确控制温度的特点，我们可以根据 van’t Hoff analysis 规则计算反应的焓。 3、动力学参数测量[3] Fig 4. SPR 传感器的一次典型的分析过程。“配体”固定在传感片表面（经适当的化合物修饰的金薄膜表 面），在 0 秒时，缓冲液流入微流小室与传感片接触。在 100 秒时，“受体”溶液流入，“受体”—“配体” 结合，传感片表面分子质量增加，使介质折射率升高，导致共振角增加。反应达到平衡时，结合与解离 由于 SPR 仪器可以实时获得数据，因此可以分析反应动力学。然而，由于仪器本身的原因 限制。粗略来说，由于样品输送量的限制，SPR 仪器难于准确测定 K <10-5s-1 或 K >1s-1 时）不能准确测得。 。若制备几组已知浓度的“受体”，进行该分析过 程，则可计算得到平衡常数（Ka）。在 320 秒时，停止注入受体，流入缓冲液，“受体”—“配体”解离。 SPR 传感器在生物医学研究中的应用：如今，SPR 技术已被广泛地用于研究蛋白质-蛋白质、 核酸-蛋白质、核酸-核酸以及药物-蛋白质之间相互作用的反应动力学、亲和力，还有其他一 些检测生物分子相互作用的技术，比如酶联免疫标记（ELISA）、平衡透析（equilibrium dialysis）、亲和层析（affinity chromatography）等，与这些技术相比较，SPR 主要有两大优 点：1、实时监测生物分子的相互作用。2、不需要作标记。 1983 年 SPR 被首次应用与抗原-抗体的检测后，SPR 应用领域逐渐扩大。主要有免 疫学、蛋白质相互作用（信号转导、肽库和抗体库筛选、分析蛋白质的突变等）、蛋白质- 核酸相互作用（修复、转录等），还有药物-蛋白质作用（药物筛选等）。 动力学分析受到一定的 较高的结合速率常数 Kon(当 Kon>106M-1s-1 时)，而由于其它原因解离速率常数 Koff（当 off off 速率相等，共振角升高的程度与“受体”的浓度正相关 Association 称为连接相，Dissociation 称为解离相，分析两相数据，可以得到结合速率常数（Kon）和 解离速率常数（Koff）。平衡常数也可以由速率常数计算得到（Ka= Koff / Kon）。在 380 秒时，加入 NaOH 洗去“表面分子”，使得传感片再生，然后在注入“配体”，进行新的一轮分析。 自 在免疫学中，SPR 技术可以识别抗原的种类，获得抗原-抗体结合的动力学常数与亲和 力常数。T 淋巴细胞的激活是由 T 细胞受体（TCR）与 MHC 分子和抗原递呈细胞递呈的抗 Ag 的 相互作用而启动 。Margulies 等用该方法研究了 MHC 与 Ag，TC 与 MHC/Ag，TCR 与超抗原相互作用的动力学常数，结果发现 MHC-抗原与 TCR 相互作用 的亲和力低、半衰期短，超抗原与 TCR 比它略高，说明短暂而低亲和力的相互作用即可激 在蛋白质研究中，目前采用二维电泳来分离复杂的蛋白质并采用质谱法鉴定蛋白质，这 些研究获得了丰富的数据，同时也给进一步研究蛋白质结构和功能的关系提出了许多问题。 要解决这些问题需要有能研究生物分子识别及相互作用的高特异性方法，SPR 技术正逐渐成 为解决这一问题的主要手段。 apolipophorinⅢ是无脊椎动物血淋巴中的一种载脂蛋白，它有重要的运输功能，而且与 物的载脂蛋白有很大相似性，因此它与脂的相互作用很受关注。Soulages 等通过 SPR 技术发现了这种蛋白质与类脂反应需要两个步骤，即两步反应机理。 ter SC[6]运用 SP 技术研究了 E.coli 中控制趋向性的信号通 路中一个复合物，通过分析相互作用发现了一种以前没有认识到的蛋白激酶与底物的相互作 用。 原（ ）组成 复合物 的 [4] R 活 T 淋巴细胞。 脊椎动 [5] 在信号转导研究中，Schus Bartly[7 表性的工作，他们在 用配体垂钓方法筛选和确定了孤儿受体的未知配体时，将 ECK 受体偶连与传感片上，然后用 不同细胞株的上清液通过传感片表面，以测定培养液中有无生物分子能和 ECK 受体结合。一 旦得到阳性结果，再进一步纯化该上清液，最后得到足够的 ECK 配体用于分析，确定此配体 是 B61。 由于使用 SPR 技术可以直接从粗提液中将欲被分析的蛋白质连接到传感片上，因此很方 便用来分析蛋白的位点突变。在研究 CD22 分子的唾液酸识别位点的结构中，将侯选 domains 中的某些残基突变，使用 SPR 技术测定突变后的亲和力等参数，确定连接位点的基序 。目 前对蛋白质识别的特异结构的认识主要来自具有高亲和力的作用，如抗体、激素受体、蛋白 酶等，而对亲和力较低的作用则研究很少，如细胞黏附与识别。采用 SPR 技术研究了具有弱 SPR 技术在肽库和抗体库的筛选上具有很大的优越性。不仅可以给出结合与否的信息， 还可以给出动力学数据进行结合力大小的比较，结合物还可以回收进行下一步研究。Schie ]等进行了一项快速鉴定、筛选未知受体和配体的比较有代 [8] 相互作用的鼠的 CD2 分子的识别位点，证实了 CD2 的识别位点的结构特性决定了其所具有的 低亲和力和高特异性[9]。 [ 等在利用抗体库筛选抗肿瘤抗体时使用了 SPR 技术，他们测定了利用 ELISA 筛选得到的阳 性克隆与特定抗原的亲和力，SPR 法比传统方法节省了时间，减轻了工作量。 在 DNA 与蛋白质的相互作用的研究中，特别是反应动力学一直没有简捷的方法。目前采 用 SPR 技术，将含目的基因的 DNA 片段偶连与传感片表面上，使不同浓度的蛋白流过传感片 表面，从 SPR 谱就可以计算出反应动力学常数和结合亲和力。Galio 10、 11] [12]等研究了转录因子 huGATA-3 和 HIV-1 长末端三个 GATA 调节元件之间的相互作用，并检测出了它们之间相对亲 和力的大小，并且首次实时分析了原始的在核提取液中的转录因子的连接作用。 SPR 技术的另一个热点是药物筛选。在反义核酸与基因药物开发方面，肽核酸（PNA） 正引起越来越广泛的关注。Jense 等测定了 PNA 与 DNA 和 RNA 的作用，结果显示 PNA-RNA 复合物的稳定性比 PNA-DNA 高。 多肽 T22 具有和 AZT 相似的很强的抗 HIV 的活性，但其作 [13] 用机制一直不知。Hirokazu Tamamura[14]等使用 SPR 技术证实 T22 通过同时连接到 T 细胞的 CD4 分子和 HIV 的 gp120 分子，抑制病毒与细胞的融合过程而起到抗病毒的作用。 参考文献 1. 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Biochinica et biophysica Acta 1298(1996) 37-44 总之，SPR 技术在生命科学领域的应用十分广泛，它为分析生物大分子之间的特异相互 作用提供了一把钥匙，使得实时、免标记、动态分析生物分子的相互作用成为可能，为我们 探索生命的奥秘又开辟了一条途径。 263 (4): 551~556 Regulatory Elements of HIV-1 Long Terminal Repeat by Surface Plasmon Resonance. Anal. Biochem. 1997, Hirokazu Tamamura, et al. Analysis of the interaction of an anti-HIV peptide, T22, with gp120 and CD4 by