薄层色谱-光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量

第 4卷 第 3期 2 0 0 4年 9月 中 国 食 品 学 报 Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology Vo1．4 No．3 Sep．2 0 0 4 薄层色谱一光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量 王江海 袁建平 徐世平 刘 昕 (中山大学国家教育部食品 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究中心 广州 510275) 摘 要 灵芝三萜类化合物是灵芝孢子油中的主要功效成分 本文提 出了一种测定灵芝孢子油中总三萜含量 的可靠 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，即薄层色谱 (TLC)一光度法。该测定方法能；住确测定灵芝孢子油样品中的总三萜含量，且其准 确度明显高于直接光度法。实验结果显示，直接光度法的测定结果具有明显的正偏差。 关键词 灵芝孢子油 总三萜 薄层色谱一光度法 文章编号 1oo9—7848(2004)03-0076—04 灵芝孢子油是采用先进的超临界二氧化碳流 体萃取技术从破壁的灵芝孢子中萃取得到的油状 脂质物。 目前在灵芝和灵芝孢子油 中已发现 120 多种灵芝三萜类化合物，因其化学结构的多样性 而具有广泛的药理活性【l～ol。最新的研究表明， 灵芝孢子油中的脂质活性物质具有显著的抑制肿 瘤I11．12 和抗艾滋病毒的活性【1． 。近年来，灵芝孢 子油产品已成为高档保健品中的珍品。 高效液相色谱法 (HPLC)和薄层色谱 (TLC)一 液相色谱／质谱 (LC／MS)法是测定灵芝孢子油 中三萜类化合物和总三萜含量准确有效的分析方 法 】。由于获得高纯度的灵芝孢子三萜类化合物 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品的技术难度大，目前仅为极少数研究机构 所掌握。总三萜含量的常规测定方法是以熊果酸 等三萜类化合物为对照品 ，用冰醋酸一香草醛和 高氯酸为显色剂，用光度计直接测定总三萜的含 量 】。该方法已被用于不同灵芝中总三萜含量的 测定 。然而，当采用上述方法直接测定灵芝孢 子油中总三萜含量时，由于出现较强的干扰，其 结果存在明显的正偏差。利用薄层色谱法或快速 柱层 析 (FCC)法对灵芝孢子油样 品进行预 分 离，可以基本排除其它组分对测定的干扰。为此 本文用薄层色谱一光度法测定灵芝孢子油中总三 萜的含量。 收稿 日期 ：2004—01—18 作者简介：王江海 ，男 ，1965年出生 ，教授 1 实验材料和方法 1．1 试剂和药品 熊果酸标准品由中国药品生物制品检定所提 供；薄层层析板为天津市天河医疗仪器公司产 品；高氯酸 (分析纯)为天津市西青鑫源化工厂 产品；冰醋酸 (分析纯)、二氯甲烷 (分析纯)、 甲醇 (分析纯 )、三氯甲烷 (分析纯 )和石油醚 (分析纯)等为汕头西陇化工厂产品；乙酸乙酯 (分析纯)为中国医药上海化学试剂公司产品。 1．2 灵芝孢子油样品 lI2．1 灵芝孢子油产品 萌动激活纯灵芝孢子油 (I』INGZHI MASTER)由深圳学者生物有限公司 提供 ；从国内和香港购得两个品牌的灵芝孢子油 产品；茶油为市售，作为分析对照品。 1．2-2 灵芝孢子脂质提取物 称取由中山大学国 家教育部食品工程研究中心提供的破壁灵芝孢子 原 料 l8．5543g，置 于 100mL甲 醇 一二 氯 甲烷 (1：3)混合溶剂中，超声振荡 30min后进行过 滤 ，残渣再 以 100mL混合溶剂提取 ，并按此实 验 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 重复提取 4次。 超声振荡和提取 4次后的残渣再用索氏抽提 器抽提，并以三氯甲烷为溶剂抽提 72h。合并上 述所有的提取液，在 50。C温度下减压旋转蒸馏 以除去溶剂，得到浅金黄色油状的灵芝孢子脂质 提取物。 1．3 测定方法 l_3．1 标准曲线的绘制 取熊果酸标准 1．15mg， 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4卷 第3期 薄层色谱一光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量 溶于 10．00mL乙酸乙酯中，混合均匀得标准溶 液 。分 别 吸取 O．00、O．1O、O．2O、0．40、0．60、 O．8O、1．00和 1．20mL标准溶液 ，在 100。C水浴 上蒸干后加入0．40mL 5％香草醛一冰乙酸溶液和 1．00mL高氯酸 ，于 6O。C水浴中加热 15min后移 入冰水浴中，再加入 5．00mL冰乙酸 ，摇匀后置 于室温。15min后用分光光度计在 548．1nm波长 下测定其吸光度。根据测定结果绘制标准曲线。 1．3．2 直接光度法测定 取灵芝孢子油样品 5．00 ～ 10．OOmg，溶于 10．00mL乙酸乙酯中。分别吸取 一 定体积的该溶液，在 100。C水浴上蒸干后加入 0．40mL 5％香草醛一冰乙酸溶液和 1．00mL高氯 酸 ，于 6O。C水浴加热 15min后移入冰水浴中 ， 再加入 5．00mL冰乙酸 ，摇匀后置于室温。15min 后用分光光度计在 548．1 nm波长下测定样 品溶 液的吸光度。 1_3．3 TLC一光度法测定 用减重法称取一定量 样品，溶于少量乙酸乙酯中。点样于活化硅胶 G 板 (20cmx2OcmxO．25cm)上，以熊果酸标准品 作参比，用石油醚一乙酸乙酯 (95：5)展开。Rf 值为0．6～1．O的部分为甘油酯，Rf值为 O～O．6的 部分为三萜类化合物。用乙酸乙酯洗脱，氮气吹 干，分别称重。 取含三萜类化合物部分 (Rf值为 O～O．6) 2．OO～10．OOmg，溶 于 2．00～2．50mL乙酸乙酯 中 。 分别吸取一定体积的该溶液，在 100。C水浴上蒸 干 后加 入 0．40mL 5％香 草醛 一冰 乙 酸 溶 液 和 1．00mL高氯酸，于6O。C水浴加热 15min后移入 冰水浴 中，再加入 5．00mL冰乙酸，摇匀后置于 室温。15min后用分光光度计在 548．1nm波长下 测定样品溶液的吸光度。 2 结果与讨论 灵芝孢子油中三萜类化合物种类超过 120 种，分离获得高纯度、具有代表性的灵芝三萜类 化合物标准品技术难度大。为建立具有普适性的 测定方法，仍以自然界广泛存在的三萜类化合物 熊果酸为对照品，采用薄层色谱分离与光度法测 定相结合的分析方法测定灵芝孢子油中的总三萜 含量，并与直接光度法测定的结果进行比较。图 1是以熊果酸为对照品，冰醋酸一香草醛及高氯 酸为显色剂，测得的标准品重量 (mg)与吸光度 值之间关系的标准曲线。从图 1看出，标准品重 量在O～O．14 mg范围内与吸光度值呈良好的线性 关系，其线性回归方程为y=O．1406x+0．0024，相 关系数 r=-O．9986。 吸光度 图 1 光度法测定三萜类化合物的标准曲线 Fig．1 Standard eulve of the triterpenoids determined by spectrophotometric me~od 表 1列出了采用两种测定方法对几种灵芝孢 子油样品中总三萜含量 (％)的测定结果。从表 1可以看出，直接光度法和 TLC一光度法的测定 结果有很大的差别。用直接光度法测出的灵芝孢 子油样品中总三萜的含量明显偏高，甚至茶油对 照品中总三萜含量的测定结果也高达 16．27％， 这显然与实际不符。采用薄层色谱法对各种灵芝 孢子油样品的组分分离实验表明，灵芝孢子油中 的甘油三脂总量一般高于 80％。因此，灵芝孢子 油中的总三萜含量不可能超过 20％。由于灵芝孢 子油中的油脂及其它组分对灵芝三萜类化合物含 量的测定产生明显的干扰，从而使直接光度法测 定灵芝孢子油中总三萜含量出现显著的正偏差， 因此表明不能直接采用光度法测定灵芝孢子油样 品中总三萜的含量，而应当在测定前将灵芝孢子 油中的甘油三脂及溶于其中的其它可能对总三萜 含量测定造成干扰的组分分离除去。 通过本实验建立了用于准确测定灵芝孢子油 中总三萜含量的 TLC一光度法 ，即在用光度法测 定灵芝孢子油中总三萜的含量前，先用薄层色谱 维普资讯 http://www.cqvip.com 78 中 国 食 品 学 报 2004年第3期 法将样品中的三萜类化合物与其它组分尽可能分 离，在排除其它组分干扰后再用光度法测定总三 萜的含量。从表 1看 出，采用 TLC一光度法所得 到的结果合理 、准确 ，该方法的回收率为 96．4％ ～ 103．8％，标准偏差小于3％。 灵芝三萜类化合物的结构非常复杂，并带有 多种功能基团，其中约50％的灵芝三萜类化合物 为带羧基的三萜酸，故灵芝孢子油的酸性比普通 食用植物油强。若采用食用油的酸价指标评价孢 子 油的品质 ，则灵 芝孢子 油的酸价 高达 15mg KOH／g以上 ，远高于国家一级食用植物油 的酸 价指标 (1．0mg KOH／g)。因此 ，酸价指标不仅 不能用来评价富含灵芝三萜等活性成分的灵芝孢 子油的品质好坏，而且也不能按食用植物油的质 量标准及工艺生产灵芝孢子油 ，否则会将其功效 降至比食用植物油更低。如在香港市场上购买的 经精炼的、色泽浅 、味道淡、酸价低的某品牌灵 芝孢 子油 ，其总三萜 含量仅为 2％左右 (见表 1)，略高于茶油中的总三萜含量，表明该灵芝孢 子油产品中的绝大部分活性成分在精炼时已被除 去，基本丧失了灵芝孢子油原有的药用价值。 分析结果还表明 (见表 1)，从萌动激活灵 芝孢子中萃取得到的纯灵芝孢子油，其总三萜含 量高达 10．36％，因而具有很高的药理活性。在 实验室条件下从新鲜破壁灵芝孢子中提取的灵芝 孢子脂质，其总三萜的含量达 9．57％，略低于萌 动激活纯灵芝孢子油。上述实验结果表明，将休 眠的灵芝孢子进行萌动激活可显著提升其药理活 性 参 考 文 献 1．El—Mekkawy S．．Meselhy M．R．．Nakamura N．et a1．Anti—HIV—l and anti—HIV—l—protease substances from Ganoder— ma lucidum 【J1．Phytochemistry，1998，49(6)：1651-1657 2．Min B．S．，Nakamura N．，Miyashiro H．et a1．Tfiterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their inhibitoR" activity against HtV-1 protease IJ1．Chemical& Pharmaceutical Bulletin，1998，46：1607-1612 3．Su C．Y．．Shiao M．S．．W ang C．T．Potentiation of ganoderm ic acid S on prostaglandin E l—induced cyclic AMP elevation in human platelets『J】．Thrombosis Research，2000，99 (2)：l35-l45 4．“n S．B．．“ C．H．． Lee S．S．et a1．Tfiterpene-enfiched extracts from Ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase C，activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest 『J】．Life Sciences，2o03，72 (21)：238l～2390 、 5．Zhu 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determ inate the content of total triterpenoids in ganoderma spore lipid samples． The accuracy of this method is better than that of the direct spectrophotometry．Th e latter may generate an evidently pos— itive eFror compared with t}le certified values Key words Ganoderma spore lipid Total triterpenoids TLC—spectrophotometry 【政策法规】 2006年美国食品营养标签须注TFAS含量 据海外媒体报道 ，美 国食品和药物管理局近 日又出 台了一项新规定 ，要求在传统食品和膳食补充品的营养 标签上，注明反式脂肪酸 (简称 “TFAS”)的含量。 TFAS存在于植物性奶油、马铃薯片、沙拉酱、饼干 以及薯条等食物中，可以通过氢化过程合成。它和饱和 脂肪酸一样，都会提高人体胆固醇含量，特别是低密度 脂蛋白胆 固醇含量 。以往一般食品包装 上都被要求注明 饱和脂肪酸含量 ，但一直 没有要求注明反式脂肪酸的含 量。 新规定将于 20o6年 1月 1日生效。 此次美国要求 食品营养标签中必须标注饱和脂肪 酸 及 TFAS的含量，被认为是美国自建立食品营养标签 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 以来的一次重大改动。 多年来科学界已经就反式脂肪酸的潜在危害进行 了 比较系统 的研究 。此前 ，丹麦营养委员会 曾得 出结 论 ： TFAS对心血管疾病 的病情发展有着极大的影 响。此外 ， 丹麦食品、农业 和渔业部还报告 ，rI’FAS对胎儿体重 和 II 型糖尿病有不利影响。鉴 于这些确凿的证据 ，2003年 6 月，丹麦政府对TFAS制定了严格的规定，成为世界上第 一 个对食品工业生产 TFAS立法进行限制的国家。从 2003年6月 1日起，丹麦市场上任何含TFAS超过 2％的 油脂都被禁售。 我国台湾地区曾对市场上快餐业 的 25种烹饪食品进 行过检验 ，发现其中 19个样品中或多或少都含有 rI’FAS， 范 围在 0．8％～33．9％之 间 ，以人造奶油 、起酥 油所含 的 TFAS较 多 。这 一调查 结 果 与欧美 等 国家 的调 查数 据 (0．2％～60％)相比，差异不大。 维普资讯 http://www.cqvip.com