土壤脱氢酶活性的测定
一、实验原理
脱氢酶的正式命名是AH:B氧化还原酶,广泛存在于动植物组织和微生物细胞内,它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力
表
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现为它的酶活性。通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性,可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力,即土壤酶的活性。
已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子,根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。如无色的氯化三苯基四氮唑(TTC,俗称红四唑)接受氢后变成红色的三苯基甲瓒(TF),根据产生红色的色度进行比色定量分析,就可以判断脱氢酶的活性。通常,吸光度越大(红色越深),脱氢酶活性越大。
二、实验材料、试剂和仪器
1.材料:过0.9mm孔径筛的土壤样品,8g
2.试剂:0.36%Na2SO3溶液,15ml
Tris-HCl缓冲液(PH=7.6),45ml
0.4%TTC,7.6ml
Na2S2O4,十几粒
甲醛,10ml
丙酮,20ml
3.仪器:50ml具塞比色管,6只
比色管架,1只
1~5ml移液枪,1只(枪头3个)
100~1000ul移液枪1只(枪头1个)
药匙1个
水浴锅1个
分光光度计1台
分析天平1台
离心管4只
培养箱1台
离心机1台
三、实验步骤
1.
标准
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曲线的绘制
(1)按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。
序号
0
1
2
3
4
5
0.36%Na2SO3(ml)
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Tris-HCl(ml)
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
0.4%TTC(ml)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
配成的TTC标准溶液的浓度((g/ml)
0
8
16
24
32
48
(2)显色。
用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠(Na2S2O4),混匀,使TTC全部还原为红色的TF。用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应,摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀,37℃水浴10min。
(3)测定吸光度,绘制标准曲线。
在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A,并以A为纵坐标,TTC浓度为横坐标,绘制出TTC标准曲线。
2.土壤脱氢酶活性的测定
(1)培养并显色(此步骤由助教预先完成)。
首先,按下表向四只离心管中分别加入以下物质
对照组
土样1
土样2
土样3
过2mm筛的土样
2g
2g
2g
2g
0.4%TTC
0ml
2ml
2ml
2ml
蒸馏水
2ml
0ml
0ml
0ml
然后,将以上四只离心管避光,37℃保温培养12~24h。
(2)培养结束后,用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应,再分别加入2ml丙酮震荡并于37℃下水浴保温10min。
(3)离心。将各离心管置于离心机中,4000r/min离心5min。
(4)测吸光度。取上清液在485nm波长下测定吸光度A,在标准曲线上查出相应的TTC浓度。
3.土壤脱氢酶活性计算。
脱氢酶活性=ABC
式中,A为由标准曲线上查出的TTC浓度((g/ml);B为培养时间校正值(h);C为比色时稀释倍数(当吸光度值大于0.8时,要适当稀释,使其在0.8以下)
四、实验注意事项
1.所有操作尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应温度为30~37℃,最适pH值为7.4~8.5,因此要控制好水浴锅的温度和缓冲液的pH。
2.取用甲醛时要小心,如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。
3.加入还原剂连二亚硫酸钠时,要保证各管加入的量几乎相同,防止因加入不同量的还原剂造成差异。
4.离心管经摇晃后会在管壁上沾有土,因此离心后取上清液测吸光度时,可用吸管吸取上清液到比色皿中,避免吸入土壤颗粒。
5.用过的比色皿如果内壁沾有颜色而难以清洗,可用硝酸浸泡。
五、思考与讨论
影响脱氢酶活性的因素有哪些?
答:1.反应终止剂的选择:本实验用甲醛作为终止剂,因其能抑制酶活性而使反应终止。但终止剂不止甲醛一种,例如浓硫酸也可作终止剂。但加入浓硫酸会使培养液褪色,背景值增大,且可能长时间会发生茶色反应,影响吸光度的测定。
2.萃取剂的影响:比起其它萃取剂,丙酮的萃取效果较好,吸光度大,与水互溶,不会发生液液分层现象,TF会均匀分布在水与萃取剂的混合液中。
3.TTC浓度的影响:TTC浓度影响很大,浓度上升时,TF的产量也增大。但从已有研究来看,当TTC浓度过大时,TF产量会下降。过高的TTC浓度不仅不会促进TTC还原反应,反而会抑制酶活性,使反应终止。
4.温度和pH的影响:反应的最适温度为30~37℃,最适pH为7.4~8.5,温度较低或较高都会使酶活性受到抑制。
5.培养时间的影响:根据酶活性的测定原则,培养时间应尽量短些,以避免因基质浓度下降、产物的形成以及酶本身的变性所带来的不良影响。但培养时间过短会使得酶促反应可生成的被检测物质的量太少,难以定量检测,因此应选择合适的培养时间。
六、实验前准备工作
1.土样的采集和预处理
(1)本实验所用土壤采自大港。
(2)土壤采集后,通过风干、磨碎、过筛、混合、分装,制成满足分析要求的土壤样品。
2.器皿的清洗和溶液的配制(溶液的配制量要根据实验人数计算,避免不够和浪费)
(1)配制500ml pH 为7.6的0.5mol/l的Tris-HCl缓冲溶液:称取Tris(三羟甲基氨基甲烷,分子量121.4)30.285g溶于蒸馏水,加入1N的HCl 210ml,定容至500ml。
(2)配制100ml 0.4%的TTC溶液:称取0.4gTTC溶于0.5ml Tris-HCl缓冲溶液中,用蒸馏水定容至100ml。(注:TTC即氯化三苯基四氮唑,又称红四唑)
(3)配制500ml 0.36%的Na2SO3溶液:称取1.8gNa2SO3溶于蒸馏水,定容至500ml。
3.提前12~24h培养土样。
2011.12.20