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基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的.

基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的

老虎和大象的恋爱
2019-05-23 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的doc》,可适用于职业教育领域

基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶激动剂细胞筛选模型的建立周家安临床乙班摘要:目的建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK激动剂的细胞模型。方法将含有编码胰岛素受体(IR基因、转录激活因子B(STATB基因和STAT应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO细胞,人肝癌细胞HepG和小鼠骨骼肌成肌细胞CC,将具有较高的胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞经G筛选,获得具有胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞克隆。RTPCR检测外源基因的表达的稳定性。荧光素酶活性分析和MTr法检测胰岛素处理后荧光素酶诱导表达的量效关系,以及AG和AG处理后胰岛素诱导荧光素酶表达的特异性。并在孔板上优化荧光素酶的检测条件。结果共转染的cH细胞较HepG和CC表现出更高胰岛素诱导的荧光素酶活性,经CA筛选得到一株具有较高诱导表达率的细胞克隆。RTPCR表明,该细胞克隆表达外源胰岛素受体和STATB。该细胞中荧光素酶的诱导表达对于胰岛素具有剂量依赖性。IRTK抑制剂AG能阻断胰岛素诱导荧光素酶的表达。而Jak激酶抑制剂AG无此作用。在孔板上的荧光素酶的优化检测条件为:接种量每孔l×个细胞,受试物诱导表达h,Promega荧光素酶检测试剂按推荐量进行倍稀释使用。结论在转基因CHO细胞中,IRTK的激活能灵敏、特异地诱导荧光素酶的表达。因此,该细胞模型可用于IRTK激动剂的高通量筛选。关键词:受体,胰岛素基因,报告药物筛选细胞培养的目前,在糖尿病的治疗中,所有胰岛素依赖型糖尿病患者和口服糖尿病药物不能控制血糖水平的非胰岛素依赖型糖尿病患者需要采用胰岛素治疗。但是,由于胰岛素是一个多肽分子,口服会被消化而丧失活性,而依赖注射治疗,且长期使用胰岛素可能导致严重的胰岛素抵抗等不良反应。因此,寻找可以口服的非肽小分子胰岛素受体蛋白质酪氨酸激酶(insulinreceptorproteintyrosinekinase,IRTK激动剂备受关注。已有研究发现,一些非肽小分子物质能模拟胰岛素的作用,如Merck课题组口报道了一个有胰岛素样作用的小分子化合物:脱甲基酯化苯醌B以及它的类似物(被称为化合物,可直接激活IRTK,启动胰岛素信号通路JTelik公司的研究小组报道了另外一个不同的IR激动剂TLK,可增强受体对胰岛素的敏感性。目前,筛选IRTK激动剂的方法大多采用免疫化学检测胰岛素受体(insulinreceptor,IR的磷酸化水平,或部分分离IR,体外检测其激酶活性。不仅费用较高,操作烦琐,而且难以实现高通量筛选。因此,建立简便快捷的检测IRTK的方法,对于大规模筛选IRTK激动剂和增敏剂具有重要意义。在IR介导的信号转导通路中,信号转导与转录激活因子B(signaltransductionandactivatorsoftranscriptionB,STATSB不仅是一种IR底物,还是一种转录激活因子J。报告基因由于具有灵敏度高、检测方便以及适合大规模检测的优点,已广泛用于药物筛选,其中荧光素酶(ueiferase,Luc是最常用的报告基因之一。本研究利用由STATB响应元件调控的荧光素酶基因,试图构建STATB靶控报告基因检测IRTK活性的细胞株,为高通量低成Cn,Ph~~rmacolToxicolJun(本地筛选治疗糖尿病药物提供条件。材料与方法试剂pSVBGal由吕秋军博士惠赠(军事医学科学院放射与辐射医学研究所pBSSKSTATB由DavidAFrank和RebeccaLrnch(theDepartmentofMedicalOncology,DanaFarherCancerInstitute惠赠pCMVhIR由StephenORahilly和DrMariaSoos(DepartmentofClinicalBiochemistry,UniversityofCambridge惠赠pSTATbTKLuc由本实验室构建保存仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO细胞株、人肝癌细胞HepG细胞株与小鼠骨骼肌成肌细胞CC细胞株购自四JII大学华西公共卫生学院大肠杆菌DHcx由本实验室保存。荧光素酶检测试剂(LuciferaseAssaySystem、B半乳糖苷酶检测试剂(BGalactosidaseEnzymeAssaySystemwithReporterLysisBuffer购自Promega公司胰岛素样生长因子受IIRTK抑制剂AG,Jak蛋白酪氨酸激酶抑制剂AG,生长激素及胰岛素购自Sigma公司LipofcctamineⅢ阳离子脂质体购自Invitrogen公司。通过瞬时转染以选择用于建模的最适细胞株选择CHO细胞、HepG细胞和CC细胞分别进行瞬时转染挑选易于转染且诱导表达倍数较高的细胞株。于孑L板接种细胞,用脂质体法将重组质粒pSTATbTKLUC,pCMVhIR,pBSSKSTATb和pSVBGal共转染细胞。分别加入胰岛素~,l。和。。tool·L诱导表达,同时设置溶剂对照。诱导h后,按试剂盒说明书分别检测Lue和B半乳糖苷酶(galactosidase,Ga活性,以Gal作为转染对照。Luc活性通过在TECANF酶标仪上测定相对光强度(relativelightunit,RLU来反映,BGal活性通过在BioRad酶标仪上测定nm处的吸光度(A值来反映。并按照以下公式计算诱导表达倍数。诱导表达倍数=(给药孑L的RLU同孔的Gal的A(溶剂对照孔的RLU同孑L的BGal的A值。稳定转染细胞株的建立以CHO为受体细胞进行稳定转染细胞株的建立。将种质粒的用量(g按pCMVhIR:pSTATb一TKLUC:pBSSKSTATb=::共转染CHO细胞。转染后按:密度传代,以含Gmg·L的MEM培养基进行筛选培养,每d换液次,持续d可见阳性克隆出现。由于外源基因随机整合到宿主细胞染色体上,依据整合位点的不同,可能存在对信号刺激反应弱和背景较高的细胞株。故将所有挑出的阳性克隆细胞富集到一定程度后,接种于孔板,以~tool·L的胰岛素诱导表达,检测Luc活性。挑选出背景低而对信号刺激反应强的细胞株作为筛选模型。转染细胞中外源基因表达的稳定性的鉴定取筛选所得细胞株,经多次传代后,以未转染的CHO细胞为对照,用Trizol试剂提取总RNA,用Olig(dT引物按反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA。以eDNA为模板,采用PCR分别扩增STATb和人IR(hIR。STATB扩增引物:上游引物AGAATGTITCGAATCTGATGCCT’ITACC,下游引物TCFGTGGGTACATGITATAGTGAGCCTGhIR扩增引物:上游引物GCAACCAGCGACATCATCAAGG,下游弓f物cATCCACCGTACAGCGAGCAGACC。以GAPDH监测样品mRNA的表达丰度,GAPDH扩增引物:上游引物ACCACAGTCCATGCCATCAC,下游引物TCCACCACCCTGTTGCTGTA。转染细胞的特异性检测检测该模型的特异性,了解JakSTAT途径的信号激活是否对模型造成干扰,确保报告基因的表达是由IRTK的活性变化所调控。细胞在血清中饥饿处理h后,按以下分组处理:正常对照组单用胰岛素l‘。tool·L组,处理h单用生长激素,及mg·L组,处理h胰岛素AG及Izmol·L组,细胞先用AG处理h,再用胰岛素处理h胰岛素AG及Ixmol·L组,细胞先用AG处理h,再用胰岛素处理h。MTr法以nm检测确定细胞活力。检测Luc活性并计算诱导表达倍数,诱导表达倍数=给药孔的RLU溶剂对NfL的RLU。最佳筛选条件的确定为寻找最适的筛选条件,分别对每孑L细胞接种数目、诱导表达时间以及Lue检测试剂使用浓度进行优化。在孑L板中分别接种~的细胞,待细胞贴壁后,胰岛素分别处理~h,通过测定Luc的表达量确定最佳细胞浓度及最佳诱导时中国药理学与毒理学杂志年月(··间。同时以原液、稀释倍、稀释倍以及稀释倍的Luc检测试剂测定Luc的表达量,确定Luc检测试剂浓度。结果细胞株的确定胰岛素~~一tool·L。。分别处理种细胞,结果显示,在CHO细胞中,Luc的诱导表达率最高,在胰岛素浓度为lmol·L时,Luc最高诱导表达率为,而在一tool·LLuc诱导表达率为。而在HepG及CC细胞株中,Luc诱导表达率均不足。因此,选择CHO细胞作为构建本模型的受体细胞(图。阳性克隆细胞株的鉴定稳定转染试验后,经数月筛选共得到了个阳性克隆。如图结果所示,对这个阳性克隆细胞用胰岛素进行鉴定,其中有个克隆测不到或测出的Luc值过低,另有个克隆的诱导表达倍数<,只有个克隆即CHO克隆的诱导表达倍数达倍以上,满足进一步试验的要求,故选择该克隆为所需要的稳定转染细胞株建立模型。转染细胞中外源基因表达的稳定性RTPCR结果表明,筛选出的CHO细胞虽然经过多次传代,在以STATB,hlR和GAPDH引物进行扩增时,仍然获得bp,Ibp和bp的预期片段。而未转染的CHO细胞仅扩增卅GAPDH的预期片段,表明基因已经整合到CHO细胞染色体DNA并获得表达。胰岛素对Luc诱导表达活性及细胞活力的影响结果所示,胰岛素×~molL“诱导Luc表达率为,且在所用浓度范围内,Luc的诱导表达率与胰岛素浓度有剂量依赖性。MTr结果显示,胰岛素ד。~×~toolL“对细胞存活力的影响不随胰岛素浓度的增加而增加。说明胰岛素浓度依赖性地诱导Luc表达量的增加与胰岛素的诱导表达作用相关,与细胞数量无关。

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