组织工程期末复习资料（完整）

07生工赵丽媛整理 组织工程 1、组织工程：将细胞① 、合成材料及处理过的天然材料②和组织、细胞因子③和基因治疗④广泛应用于体内的组织再生或体外的组织构建。 组成要素/原理：组织工程依赖于细胞、支架材料和调节因子是否能有机结合。 2、组织工程学的研究内容 ①种子细胞 ②生物支架材料 ③细胞与材料的应力场三维培养 ④体内植入研究 ⑤ 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法及检验 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ⑥临床验证研究 ⑦产业化研究 3、种子细胞的选择应满足的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ①采用非侵袭或微创手段即可获得 ②分裂增殖能力强、功能旺盛 ③无或仅有极微弱免疫排斥反应 ④能连续传代，并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。 4、弹性模量：固体材料为抵抗外力产生拉伸或压缩弹性变形的能力，是材料原料问题在工程技术中常用的参数。 5、二倍体细胞培养法：即始终维持培养的细胞染色体倍数为二倍体的方法。 6、二倍体细胞培养的主要原则 ⑴稳定培养条件 ①营养条件 选用高质量培养基和血清，营养条件建立后宜保持不变。 换液时间间隔勿太长，半量更换，以利细胞对换液的适应。 ②酸碱度：尽量减少变化。 ⑵减少传代次数 ①选择合理的接种密度。 ②细胞接种数量、培养条件（培养液量、培养空间）一样。 ⑶冷冻保存 ①保种：原代或传代培养前几代的二倍体细胞。 ②复苏：细胞复苏后再传代1-3次，使细胞生长稳定，然后一部分用于实验，一部分用于冷冻保存。 7、上皮组织细胞体外生长的特殊条件 ①防范微生物污染 ②生长基质的支持 ③特殊培养基 ④去除成纤维细胞 8、成熟表皮角质形成细胞的体外培养 （气-液界面培养法：培养技术的方向 ①采用真皮或真皮样底物培养，并制备成复合皮片或双层皮肤类似物。 ②将复合皮片进行气-液界面培养，即将角质形成细胞层暴露于空气中，促使细胞分化。） ⑴在人去表皮真皮上培养角质形成细胞 ①人去表皮真皮（无细胞真皮）的制备 ②真、表皮组织的分离（酒精浸泡除脂肪、结缔组织——中性蛋白酶消化） ③角质形成细胞的分离培养（胰蛋白酶+EDTA） ④复合培养法 ⑵在人工真皮上培养角质形成细胞 ①胶原网架的制备 ②真、表皮组织的分离 ③表皮角质形成细胞的分离 ④真皮成纤维细胞的分离培养（胶原酶消化） ⑤接种角质形成细胞 ⑥气—液界面培养 9、成骨细胞培养 ⑴骨内成骨细胞的培养 ·方法：①植块培养法（细胞移行生长法）②分离细胞培养法 ·体外培养的成骨细胞依次进入： ①增殖期：Ⅰ型胶原开始表达 ②基质合成期：Ⅰ型胶原达高峰；ALP出现——成骨细胞分化的早期标志 ③钙化期：ALP达高峰；OC表达——成骨细胞分化成熟的标志，钙结节成熟后达高峰。 ·培养成骨细胞的鉴定 主要指标：Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素OC ①碱性磷酸酶染色 体外培养的成骨细胞融合后，胞质内ALP活性增强，并分泌于基质中。 组织化学钙-钴法，进行细胞内或基质中ALP染色，呈阳性反应。 ②骨钙素免疫组织化学染色 　用抗-骨钙素特异性抗体进行免疫组化染色，成骨细胞胞质呈阳性反应。 ⑵骨膜内成骨细胞培养 10、软骨细胞的培养 ·培养方法：取材—机械分离—酶分离—离心收集细胞，PBS洗涤，过滤，计数，接种 ·软骨细胞的反分化现象： ①形态：单层培养传代后，失去原有形态，出现成纤维细胞样变。 ②功能：PGs合成、分泌减少，硫酸化程度降低；标记性蛋白Ⅱ型胶原的合成、分泌减少。 ·细胞鉴定： 软骨细胞的特征性分泌产物： ①Ⅱ型胶原检测：用其抗体作免疫细胞化学染色 ②酸性糖胺多糖检测—甲苯胺蓝染色：若细胞外基质中存在酸性糖胺多糖，则呈异染性（红色）。 11、神经组织的体外培养 ⑴大鼠小脑皮质神经元的体外培养 ·培养方法：细胞悬液的制备——生长基质盖片的制作——接种培养 加入抗有丝分裂剂：抑制非神经元细胞增生（DNA合成抑制剂） 神经元细胞的体外培养只是短期培养。 ·影响神经元体外培养存活率的因素： ①取材动物年龄：出生后6天内大鼠。 ②接种密度：2-4×104个／cm2存活率较高。 ③培养：对谷氨酸毒性敏感，使用条件培养液。 ④减少体外处理神经元的时间和步骤。 ·神经元类型的鉴别方法：逆行示踪法、免疫细胞化学法、电子显微镜观察、电生理检测（根据动作电位的特征来鉴定兴奋性或抑制性神经元） ⑵大鼠星形胶质细胞的体外培养 ·原代培养：取材—分离—初细胞悬液—孵育—次细胞悬液—混合细胞培养物 ·神经胶质细胞的分离和纯化: ①分离原理 a.星形胶质细胞增殖速度大于其他神经细胞 b.星形胶质细胞与其他胶质细胞分层生长，星形胶质细胞在底层 c.振荡法：分层生长的细胞以一定力度摇动，可选择性脱壁 ②胶质细胞分离、纯化流程 ·污染细胞的去除： ①成纤维细胞（主要污染细胞） 原因——取材时脑膜未去干净 消除方法：提高接种密度；D-缬氨酸取代培养基中L-缬氨酸 （FB缺乏D-缬氨酸氧化酶，无法利用D-缬氨酸合成L－缬氨酸） ②神经元的污染：神经元细胞对谷氨酸浓度敏感，培养液中15μmol/L谷氨酸的浓度足以对神经元产生毒性作用；神经元对机械干扰敏感，经过振荡将失去活力 ⑶大鼠雪旺细胞的体外培养： 1)常规分离细胞培养法 ·培养方法：取材—机械分离与酶分离—制备细胞悬液，计数，接种培养—培养24h后：加阿糖胞苷作用48h，换正常培养液持续培养。 ·污染细胞：成纤维细胞 ·消除方法： ①糖胞苷等抗有丝分裂剂 ②差速贴壁法：雪旺细胞接种后30分钟，收集上清液离心培养。优点：不需应用细胞毒性药物。 ·细胞鉴定：雪旺细胞具有的特异性抗原 ①S-100蛋白：一种酸性钙结合蛋白，存在于胞液中。用其抗体进行免疫细胞化学染色，90％细胞呈阳性反应。 ②大鼠神经抗原1（Ran－1 ）：雪旺细胞表面标志物，用抗Ran－1抗体识别雪旺细胞。 2)反复植块法 ①原理：神经组织植块在体外培养时，不同种类的非神经元细胞从植块迁移出来的高峰期不同。 ②方法： a.切取外周神经小段，种植于预涂胶原培养器表面，常规培养。 b.待植块四周长出细胞汇合后，将植块再种植到新培养器表面，继续培养。 c.待植块四周长出细胞相互汇合后，将细胞进行传代培养。 ③结果：种植早期长出的是成纤维细胞。可联合应用选择性细胞毒性药物，在植块原代种植的前五天，抑制FB生长而直接获得纯净的雪旺细胞。 3)免疫选择法 原理： 雪旺细胞具有的特异性抗原：大鼠神经抗原1（ Ran－1 抗原） 成纤维细胞具有的特异性抗原：Thy-1抗原 用Thy-1抗原的抗体特异性与成纤维细胞结合而杀死成纤维细胞。 12、生长因子：通过在细胞之间传递信息，对细胞生长和活性具有调节功能的多肽类物质。 生物学特点：半衰期短；水存在及室温环境下易失去生物活性；以自分泌或旁分泌形式作用于分泌细胞本身或邻近的其他细胞。 13、BMP的生物活性 ⑴诱骨活性 ①能诱导间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞。 ②可异位诱导新骨形成。 ③BMP可强化和保持软骨细胞表征。 ④BMP7可促进软骨细胞增殖、肥大，蛋白多糖、Ⅱ型胶原合成增加，ＡＬＰ活性增强。 ⑤BMP可在体内启动软骨形成，因此是治疗全层关节软骨缺损的重要因子。 ⑥BMP的作用是剂量依赖型，剂量不同，其效应不同。 ⑵在胚胎发生中的作用（BMP在胚胎发育期间高表达） ⑶诱导细胞凋亡 ⑷促进肝细胞增殖 14、FGF的生物学作用 ①促血管生长作用 ②创伤愈合与组织修复、再生 ③在胚胎发育早期和组织分化过程中起作用；在中枢神经系统发育过程中亦有表达。 ④调节内分泌的作用（bFGF在局部起维持垂体功能的作用）。 ⑤神经营养作用 15、IGF-I的生物学功能 ⑴促进细胞有丝分裂作用 ⑵细胞转化 ①对转化细胞的影响（可介导肿瘤的发生） ②使肿瘤侵袭性增强 ⑶抗调亡作用 16、TGF -β的生物学功能 ①促进细胞增殖 ②调节细胞分化 ③促进细胞外基质合成 ④协调诸多细胞因子，是局部细胞活动的协调者 ⑤免疫调节作用 17、VEGF的生物学特性 ①增加微血管的通透性，特异性地与血管内皮细胞受体结合。 ②促进血管内皮细胞的分裂和增殖，进 而导致新生血管的生成。 18、EGF的生物学作用 ①EGF可以刺激角膜上皮增殖,从而促进角膜损伤的修复 ②EGF可以加快皮肤创伤的愈合，减少瘢痕形成 ③EGF与胃肠道溃疡的防治（抑制胃酸分泌；防止胃溃疡的发生，促进胃黏膜DNA、RNA和蛋白质合成，从而对胃黏膜损伤具有防护作用；促进胃溃疡及胃切除手术切口的愈合） ④EGF在生长、发育过程中起重要作用 19、细胞寿命与细胞周期调控——调节细胞周期的直接因素 · 周期素（cyclin，又称周期蛋白）——正调控作用 · 周期素依赖性激酶（ CDKs）——调节中心 · 周期素依赖性激酶抑制因子（CKIs）——负调控作用 ⑴周期素依赖性激酶CDKs ①与细胞周期素结合才具有激酶的活性 ②作用：CDK又被称作细胞周期引擎。图示 例如：CDK对抑癌蛋白pRB的调节 pRB是由视网膜母细胞瘤基因编码的蛋白，在G1期处于低磷酸化状态并定位于核基质中，通过结合、抑制一组E2Fs的转录因子来阻止S期相关基因的转录，使细胞滞留于G1期。 当细胞处于G1/S交界时， cyclin D通过与pRB结合，随后 CDK4/6使pRB磷酸化，失去对E2Fs的结合功能，导致E2Fs游离并启动S期相关基因的转录，细胞进入S期，引起细胞分裂或发生转化。 ③CDK的数量在细胞周期中保持恒定，但其活性在细胞周期蛋白的调控作用下具有较大变化。 ⑵cyclin（周期素）：含量随细胞周期而变化。 ⑶周期素依赖性激酶抑制因子CKIs：在细胞周期的适当时相抑制CDK活性。 20、掌握延长细胞增殖寿命的方法 ⑴导入病毒癌基因延长细胞寿命 机制：使pRB磷酸化，F2F游离，启动转录；与p53结合，减少CKI表达 ⑵端粒酶重建延长细胞寿命 机制：M1期前和M1期导入hTERT基因 ①重建端粒酶活性，延长或维持端粒的长度，避免或消除M1 期的触发机制，使细胞增殖。 ②通过激活原癌基因c-myc等基因的表达促进细胞周期进程，从而使细胞无限增殖。 应用：单一hTERT基因导入使细胞永生化；hTERT协同病毒癌基因转染使细胞永生化 21、细胞形态学观察 活细胞常规检查：肉眼观察（培养基颜色） 光镜下观察 微生物污染 活细胞染色（结晶紫、台盼蓝） 固定细胞染色：一般染色、特殊染色 免疫细胞化学： 电镜观察（透射电镜、扫描电镜） 细胞骨架观察： 22、固定染色观察法 固定的目的：迅速终止组织内各种酶的活性，防止细胞自溶并保持组织细胞的形态结构，使细胞内化学物质和酶能准确定位。 优点：比活细胞观察更清楚显示细胞形态和微细结构，标本可长期保存，反复观察分析。 23、免疫细胞化学 定义：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对细胞或组织中的抗原进行定位测定的技术。 原理：抗原：待测结构或化学物质；抗体：标记物标记。二者特异性结合后，在原位产生不溶、有色的反应产物，显微镜观察。 方法： 1、直接法：标记抗体-抗原直接结合，操作简便，但灵敏度不够。 2、间接法：将第一抗体作为抗原给另一动物，制备出第二抗体，再以标记物标记二抗；然后用一抗二抗处理样品，最终形成抗原-一抗-标记二抗复合物。一个抗原分子可与数个一抗结合，后者又可与多个二抗结合，这种放大作用使抗原上的标记物大大增多，灵敏度更高。 亲和素-生物素－过氧化物酶复合物ABC法： Avidin：亲和素 、Biotin：生物素、Peroxidase ：过氧(化)物酶 优点：一个亲和素可桥联多个酶标生物素，经过依次相互作用连接，从而形成一种较大的、具多级放大作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。因此，应用ABC法可极大提高酶在抗原—抗体反应场所的浓度，使该法的检测敏感性明显提高，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。 放射免疫分析（ RIA ）： 特点：同位素的敏感性 + 抗原-抗体反应特异性 基本原理： ①Ag*和 Ag（待测抗原）与特异性 Ab竞争性结合，二者结合能力相同； ②Ag*和 Ag之和多于特异性抗体结合位点； ③反应达平衡时，Ag*- Ab生成量受Ag数量的制约。 ④随Ag增加，Ag*被稀释程度增加，形成的Ag*Ab减少，放射性强度减低，通过与标准曲线比对计算抗原量。 22、细胞生长能力检测技术 ⑴细胞生长曲线的测定方法：细胞计数法（将对数生长期细胞消化、计数后定量接种于24孔板内，接种7-8组，每组3孔。每天检查一组并重复计数一次，连续7-8d，最后取平均值绘成曲线）、四唑盐比色法（MTT法） 细胞培增时间：细胞数量增加一倍的时间。 ⑵细胞克隆形成率测定 细胞克隆：单个细胞在体外持续增殖6代以上所组成的、含有50个细胞以上、大小在0.3-1.0 mm之间的细胞群体。 克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞)×100% 通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力作定量分析。 方法：①平板克隆形成率——贴壁细胞 ②软琼脂克隆形成率——悬浮细胞 ⑶流式细胞仪检测细胞周期和DNA合成 23、细胞遗传性状检测技术 染色体核型分析：染色体核型是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。 染色体显带：中期染色体经特殊处理后， 沿整个染色体长轴显现的着色深浅不同的横纹。 （含A-T多的染色节段：易着色，阳性带；含G-C多的染色节段：不易着色，阴性带，多数已被定位的正常基因和异常基因在阴性带） 细胞成瘤性分析 ⑴软琼脂培养法——对转化细胞是否具有成瘤性进行初步筛选。 在软琼脂上形成克隆，成瘤可能性较大； 不能在软琼脂上形成克隆，基本排除成瘤可能性 ⑵裸鼠成瘤性实验——权威方法 将细胞接种到裸鼠体内，若能成瘤，即具成瘤性。 在裸鼠体内移植的转化细胞仍保留其原有的细胞形态、免疫学特点及特有的染色体组型。 24、细胞功能检测——特异性指标检测 成纤维细胞：波形蛋白 成骨细胞： ⑴I型胶原 ①组织化学法：Masson染色观察胶原分布。胶原染为蓝色，胞质呈蓝褐色。 ②免疫组化法： ③ I型前胶原羧端肽PICP：是I型胶原聚合成纤维前从分子羧端切下的片段，可在血液中检测到，其含量反映了I型胶原的合成情况，用放射免疫技术检验血清或体外培养细胞上清液中PICP的浓度来衡量I型胶原的合成。 ⑵碱性磷酸酶（ALP） ①钙钴法（金属沉淀法）②偶氮偶联法 ③酶组织化学法： ALP ↓ 底物PNPP →PNP (对硝基苯酚)+酚酸盐 （对硝基苯酚酸盐） （黄色） 根据颜色的深浅来反映活性程度(测OD值) ⑶骨钙素：酶联免疫或放射免疫法测定培养细胞上清液中骨钙素的含量，也可用 RT-PCR方法测定细胞中骨钙素基因的mRNA表达。 ⑷成骨细胞特异转录因子 CBFAI基因表达高度受限：仅在骨和成骨细胞中被检出，其他组织中未被发现。 RT-PCR的方法检测成骨细胞中CBFAI基因的表达。 ⑸矿化结节染色：成骨细胞具有体外矿化的特征。培养细胞可形成肉眼可见白色矿化结节。常用茜素红法 、von Kassa法及四环素标记法染色显示。 ①茜素红法：矿化结节呈现不同的红色 ②von Kossa改良法：矿化结节呈黑色 ③四环素标记法：矿化结节呈金黄色。 ⑹相关基因mRNA表达测定：用分子生物学RT-PCR技术检测成骨细胞骨钙素(BGP)、I型胶原(Col I )、碱性磷酸酶(ALP)、成骨细胞特异转录因子(CBFAI)等mRNA表达水平，可反映其功能状态。 软骨细胞： ①酸性黏多糖(GAG) 细胞爬片培养后阿新蓝染色，观察细胞GAG分泌。细胞周围被阿新蓝染成蓝色，颜色较深，随着代次的增加染色逐渐变浅。 ②胶原 应用Masson三色染色，观察细胞体外胶原分泌情况，软骨细胞分泌的胶原可被染成绿色。 ③S-100：鉴别软骨细胞与成纤维细胞 S-100蛋白首先在神经组织内发现，后来发现软骨细胞内也有表达，但未发现成纤维细胞有S-100蛋白表达。可用S-100鉴定软骨细胞内是否有成纤维细胞污染。 25、细胞包埋的意义：解决免疫排斥的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ——将外源性细胞或器官包埋在半透性人工膜中进行隔离，进而移植至体内，从而起到免疫隔离的作用。 26、影响细胞微包囊的主要因素 ⑴微包囊材料的生物相容性 生物相容性：当生物材料应用于一个特定用途时，此材料对应用主体所产生的特有反应的能力。 ⑵微包囊的制备 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 （条件温和，避免有毒单体残留，避免使用有机溶剂） ⑶微包囊膜对细胞的免疫保护和选择透过性 免疫保护：无需免疫抑制，对主体无副作用；实现同种异体或异种细胞移植，有利于解决供体细胞不足。 膜对细胞选择通透性的原理——体积排除， 膜上特定尺寸的微孔。 衡量标准——截留分子量：即不能透过微包囊膜的蛋白质的最低分子量。 ⑷微包囊的粒径及粒径分布 保证尽可能多地包埋细胞、尽量减小微包囊的体积 ⑸微包囊的尺寸稳定性 微包囊材料多为凝胶，易发生吸水膨胀，包囊的体积变大变形，影响细胞发挥正常的功能和体内的稳定性。涂覆聚赖氨酸膜等。 ⑹微包囊膜强度 决定了微胶囊在生物环境停留期间能否保持基本完整，从而保证囊内细胞或物质活性。 27、细胞包埋过程 ①将细胞混入可形成凝胶或能够成膜的液状物质中 ②分散成小液滴 ③使其凝胶化或固化成膜，形成包含有细胞的微包囊 28、药物的控制释放：将天然或合成的高分子化合物作为药物的载体或介质，使药物按设计的剂量，在要求的时间范围内以一定速度在体内缓慢释放，并在一段时间内使药物浓度维持在一定水平，以达到治疗某种疾病的目的。 29、生长因子的控制释放原理 采用生物降解性高分子材料作为保护载体，防止生长因子直接和机体的生理环境相接触，从而达到保护生长因子在机体内仍保持生物活性的目的。 高分子材料对药物有选择通透性，使生长因子以一定速度在高分子保护层溶解，扩散，而后进入机体发挥生物功能，使之能在较长时间内保持生长因子的生物效应。 30、ECM（细胞外基质）的功能 ①ECM和其介导的信号受体 ②维持组织特异性基因表达 ③ECM与细胞分化和细胞分裂的关系 ④ECM调控生长因子、细胞因子和转录因子 ⑤ECM与异分化 ⑥ECM是形态调节子 ⑦凋亡 ⑧ECM和 DNA 31、组织工程细胞外基质的分类： ⑴按材料的降解性来分： 非降解性细胞外基质 可降解性细胞外基质 ⑵按材料的来源来分： 天然细胞外基质：胶原 人工合成细胞外基质：PLA 32、组织工程对细胞外基质材料的要求 ①．具有良好的生物相容性（即无毒性、无致癌性、无致畸性、无热源反应；另外，还应对细胞和周围组织无刺激性，不干扰机体的免疫机制，不引起免疫排斥反应；植入体内不引起溶血、凝血反应等）； ②．具有良好的表面活性，这不仅利于细胞的粘附，更为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境； ③．具有良好的生物稳定性（非吸收材料耐腐蚀、不降解；可吸收材料具有一定的降解性和化学结合性）； ④．具有足够的力学性能和良好的生物机械性能； ⑤．具有良好的可塑性； ⑥．具有一定的三维空间结构。 ⑦．溶出物及可渗出物含量低； ⑧．便于加工、灭菌和消毒等。 33、鼠尾胶原的制备方法 34、戊二醛交联法 原理：在相邻胶原单体的赖氨酸残基上引起交联。 作用：减轻免疫反应、降低其体内降解速率、具有一定灭菌作用、明显改变力学性能 不足：易于钙化、易导致纤维囊化、不易降解、释放有毒的副产物 35、几丁质的性质 无毒、无味、无刺激性、无免疫原性、无致突变性、无热原反应、不溶血、不致敏；具有良好的生物力学性能、组织相容性、生物降解性，另外，还具有抑菌、消炎、促进创伤愈合等作用。 36、组织工程对人工合成细胞外基质的要求 结构上： ①具有良好的表面性质，有利于种子细胞的黏连、 迁移、增殖和分化。 ②具有特定的三维孔隙结构与特性，适于细胞长入、血管化、利于营养物质和代谢产物的传递，以及基因表达。 功能上： ①组织相容性好，使人体识别为自体或其一部分，并与周围组织整合，具有促进组织愈合的功效 ②防止免疫分子或免疫细胞激活，基本上无或极小的免疫排斥性 ③防止炎症和纤维化 ④适于信号分子控制或表达它们的质粒DNA的控制释放 ⑤提供合适的力学支撑，与自体组织的力学性能相适应 ⑥降解或吸收速率与新组织形成速率相匹配，保持体系力学性能的动态平衡。 37、组织工程再生修复的途径： ①仅仅使用细胞体系，进行原位修复。将细胞分离、纯化、培养、扩增后，再回植患者体内，细胞分泌细胞外基质，新组织生成。 ②仅仅使用生物材料，植入体内后经生物过程与自体细胞整合，形成新组织。 ③生物材料与因子混合物植入体内进行再生修复，生物材料逐渐降解，最终使组织重建。 ④细胞+生物支架材料+因子复合物——组织工程构件，移植修复。 综上所述，生物材料在组织修复中是不可缺的。 38、设计人工合成细胞外基质遵循的原则 ⑴生物相容性设计原则 ⑵生物可吸收性设计原则 ⑶生物力学设计原则 ⑷生物活性分子载体设计原则 39、HAP（羟基磷灰石）的生物学特性 ①羟基磷灰石的骨传导性 ②羟基磷灰石的骨诱导作用 40、生物活性玻璃的临床应用 ①口腔颌面外科：临床应用最早也最广，如人工牙根、牙冠、人工颌骨、牙槽嵴再造、面部整容（颌、颧骨增高）等。 ②骨科：目前研究最多的是用其作表面涂层材料来诱导骨组织长入。 ③耳鼻喉科：如听小骨、人工喉管支架、隆鼻等。 ④心脏外科：如人工心瓣膜。 ⑤脑外科：如人工颅骨。 ⑥眼科：如人工水晶体。 41、复合材料的几种类型 ⑴不同种类有机材料的复合 典型例子是将PLA和PGA共聚，得到降解速度可调的无规共聚物PLGA。 ⑵有机材料与无机材料的复合 复合树脂、陶瓷材料与聚合物复合、陶瓷材料与壳聚糖复合 ⑶基质材料与生物活性物质的复合 在支架材料表面结合生物活性物质，既能保留支架材料基质的力学强度，又具有良好的生物相容性及抗凝血性。表面肝素化是这类材料的代表。 ⑷基质材料与细胞因子、生长因子的复合 支架材料与酶、抗体、抗原、激素、生长因子等复合后，其表面结构特异性地影响细胞的粘附、增殖和分化等一系列功能，这就有可能制成新一代有特定修复功能的“智能”支架材料。 ⑸支架材料与细胞的复合 如将PLA、凝胶等材料与软骨细胞或骨细胞复合后直接注入软骨（或骨）缺损部位，进行原位再生修复。 42、研究细胞与细胞外基质联合培养的目的： ①评价支架材料对细胞的毒性作用； ②考察细胞对支架材料的选择性； ③研究细胞与支架材料的相互作用关系及其机制； ④研究细胞在支架材料上的接种方法、数量、密度； ⑤研究适合细胞生长、进行新陈代谢的最佳材料结构（材料的组成、孔隙率、孔径、孔间交通情况、表面形貌特征等）； ⑥构建工程化组织新材料。 43、体外构建工程化组织的两条技术路线： ⑴种子细胞与支架材料（预先塑形）在体外经过长时间联合培养，使其发育成为具有一定形态的成熟组织，然后植入体内，修复组织缺损。 优点：在体外已形成成熟、有一定功能的组织，且形态已按需要预制，植入体内与被修复的组织形态匹配，一旦与受区组织愈合，即能发挥形态修复及功能修复。 缺点： ①体外培养难以获得体内正常的营养条件及生物力学环境，使形成的组织与体内正常组织存在一定差距； ②植入受区后，需有较长时间在体内重新获得营养，建立血液循环，进行正常的物质交换及新陈代谢。这就有可能使部分细胞因营养条件改变或生存环境发生改变而导致死亡，影响工程化组织的质量； ③体外长期培养时间越长，可能出现的污染机会就越多，增加了整个研究失败的机会。 ⑵种子细胞与非定形、体积较小的支架材料在体外经过短时间联合培养后，即植入体内，在体内正常的营养环境及生物力学条件下，继续生长发育。 优点：由于体积较小，容易从组织液中获取营养，也易于与周围组织建立血循环，在体内逐渐发育为成熟组织，在这一过程中，完成病损组织的替代及功能修复。 缺点： ①在体外难以成形，需在体内发育过程中逐渐成形； ②早期生物力学强度不足，常需辅助装置提高力学强度。 44、细胞与支架的接种技术 ⑴浸渍法 预先制备好高密度细胞悬液，将已经过预湿处理的材料置入细胞悬液中，由于材料对细胞有良好的相容性，细胞逐渐向材料迁移，并附着在材料上。适用于非贴壁生长细胞，对细胞具有趋化性的生物材料及采用玻璃培养皿进行细胞培养。 优点：操作简单，不易导致污染，对设备、仪器的要求不高。 缺点：接种细胞的数量有限，接种率低，很多细胞被浪费掉。如果采用动态悬浮培养系统，则可大幅度提高细胞的接种率及细胞接种的均匀度，更有利于工程化组织的形成。 ⑵沉淀法 又称接种法，是最为常用的方法。包括一次沉淀法、二次沉淀法、多次沉淀法。 一次沉淀法：将已预湿的支架材料置于培养皿中，制备高密度细胞悬液，用吸管将细胞悬液缓慢逐滴滴加于材料上，不使细胞从材料上溢出，放置培养箱中2～4h，待细胞充分黏附于材料后，缓慢加入培养液进行复合培养。 二次沉淀法：采用上述方法，先沉积部分细胞到三维支架中，孵育一段时间（1～2h），使细胞黏附到材料中，然后再加入剩下的部分细胞，在37℃条件下孵育（1～2h），产生种子细胞的第二次沉淀，以增加种子细胞沉积黏附的数量。 多次沉淀法 优点：操作简便，可提高细胞的接种数量。 缺点：接种的细胞分布不均匀。如果支架材料为筛网状，接种的细胞有可能从网孔中漏出，影响接种细胞的有效率。如果接种细胞速度过快或者细胞数量过多，细胞可从支架材料上溢出，影响细胞的接种数量。 ⑶吸附法 这是近几年才采用的一种接种细胞的新技术。一般采用负压吸附法，将已预湿的支架材料置于培养皿中，用吸管将高密度细胞悬液逐滴滴加于材料上或将支架材料置于细胞悬液中，将整个培养皿置于负压容器中，施加一定的负压吸引力，细胞被负压吸附在支架材料上。 优点：细胞接种较为均匀，数量较多，不导致细胞浪费。 缺点：一是负压吸引的压力不易掌握，负压力太大，有使细胞死亡的可能；负压力太小，又不能使细胞吸附在材料上，这需要针对不同的支架材料及细胞种类，反复试验，寻找一种吸附率高，不导致细胞破坏的最佳方法。二是容易污染。 ⑷凝胶法 将高密度细胞悬液与多种物质如胶原、藻酸钠几丁质，玻璃酸钠等按一定工艺复合，形成凝胶，凝胶所具有的三维孔隙结构为细胞提供了生存空间及代谢活动场所，细胞能较均匀地分布在凝胶内。这是一种较常用的细胞接种技术。 ⑸动态培养系统 将支架材料浸没在高密度细胞悬液中，采用旋转培养系统，可使细胞更均匀，更多地附着在支架材料上。 45、影响细胞与支架材料复合的因素 ⑴支架材料的影响 ①材料含水量的影响 ②材料表面物理性质的影响 ③材料表面化学性质的影响 ④材料表面改性处理的影响 ⑤材料表面几何性质的影响 ⑥材料特化结构的影响 ⑵细胞的影响 ⑶培养方法的影响 二维培养：通常情况下，将细胞植于孔板、培养瓶、培养管或将细胞接种于不具有三维结构的膜性结构上培养。 三维培养：将高密度细胞接种于具有一定空间结构的三维支架中，细胞在模拟体内的物理化学和生物学条件下进行培养。 ⑷应力应变的影响 46、实验动物：是指经人工培育或人工改造；遗传背景明确，来源清楚；对其携带的微生物实行控制；用于科学实验、药品、生物制品的生产和检定及其它科学研究的动物。 47、实验动物按微生物学控制方法分类 ⑴无菌动物（germ free, GF）：用现有的实验手段检测，动物体表、体内不携带其它生命体（包括一切微生物和寄生虫）的实验动物。 ⑵悉生动物（gnotobiote animals, GA）：又称已知菌动物，是指动物体内携带有已知的微生物，其来源是无菌动物。按照预定目标，人为地将某种已知的微生物植入其体内。 ⑶无特定病原微生物（specific pathogen free, SPF）：无特定的微生物和寄生虫存在，允许有非特定的微生物存在于体内的实验动物，实际上一般是指无传染病的健康动物。 ⑷清洁级普通动物（clean conventional animals,CCV）：体内、外不携带人畜共患病或动物传染病病原体的动物。 ⑸普通动物（conventional animals, CV）：未经积极的微生物控制，可能带有微生物和寄生虫，但不带有严重危害动物自身健康和人畜共患病病原体的动物。 48、实验动物的选择 选择原则： （1）通过动物实验能获得足够的科学资料； （2）考虑动物种属特性及饲养条件、经费等。 选择方法： （1）根据动物进化特点进行选择； （2）根据动物质量进行选择； （3）根据动物解剖生理特点及生物力学功能进行选择； （4）根据动物对实验目的的反应进行选择； （5）根据检测指标选择。 49、移植物的标记 ①缝线标记：肌肉内、皮下植入； ②金属标记：骨移植； ③银夹标记：肌腱、神经、血管移植； ④颜料标记：短期实验； ⑤组织反应标记； ⑥骨性标记。 50、组织工程材料植入后的主要组织反应 ①炎症反应；(手术操作、材料刺激) ②免疫排斥反应；(细胞或材料所携带抗原) ③宿主对植入体的营养供应； ④宿主同类细胞对植入体细胞的作用； ⑤宿主对植入体基质材料的作用； ⑥植入体细胞对本身基质材料的改建和重塑。 51、组织工程材料植入后的检测内容 ①组织相容性：工程化组织与受体组织结合部的组织反应、细胞类型、细胞外基质的连续性。 ②细胞：工程化组织内部细胞的存活状况、细胞的功能状况，以及有无宿主细胞的浸润或爬行。 ③支架：工程化组织内部支架结构的降解与新支架结构的形成 。 ④营养：工程化组织的营养状况、血管化过程。 ⑤功能：工程化组织的自主代谢功能等。 52、组织工程化组织植入的检测方法 ⑴大体观察; ⑵组织学检查; ⑶超微结构观察（透射电镜、扫描电镜） ⑷影像学检查; ⑸血循环观察（动态观察、静态观察） ⑹电生理检查（神经的传导功能、肌肉的收缩功能、皮肤的感觉功能 ） ⑺免疫组织化学检查 ⑻原位杂交检查（原理：两条具有一定互补性的核苷酸单链片段，在适宜条件下，可以形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子。应用带有标记的（放射性同位素、荧光素、生物素等）DNA或RNA片段为核酸探针，与组织切片内待测核酸片段进行杂交，然后通过放射自显影等方式予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。） 53、开放性试题：组织工程应用于临床还存在哪些障碍，如何解决？（上网查，无固定答案）