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蛋白质结晶之Tips R——还原剂.doc

蛋白质结晶之Tips R——还原剂.doc

上传者: 凯利万花筒 2017-11-17 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《蛋白质结晶之Tips R——还原剂doc》,可适用于自然科学领域,主题内容包含蛋白质结晶之TipsR还原剂R代表还原剂(ReducingAgents)还原剂是一类能使其他物质被还原或获得电子的物质。在使其他物质被还原(获得电子符等。

蛋白质结晶之TipsR还原剂R代表还原剂(ReducingAgents)还原剂是一类能使其他物质被还原或获得电子的物质。在使其他物质被还原(获得电子)的过程中还原剂本身被氧化了也就是说还原剂通过自身被氧化(失去电子)而使其他物质被还原。二硫苏糖醇DTTbeta巯基乙醇TCEP等是巯基类还原剂。还原剂可以保护蛋白质上自由的巯基不被氧化从而避免蛋白质的聚集或变性。在结晶实验中一般使用的还原剂工作浓度是,mM。beta巯基乙醇是上述三种还原剂中还原能力最差的一个因为它本身只有一个巯基。它的效果一般只能维持,天。因此在实验中要每隔,天补加一次beta巯基乙醇来维持它的作用。由于beta巯基乙醇是挥发性的因此可以在池液中加入beta巯基乙醇利用它的挥发扩散到液滴中去。二硫苏糖醇DTT有两个巯基基团其作用能维持,天。DTT的挥发性不像beta巯基乙醇那么强所以使用时应该直接加入到悬滴中去。DTT还可以通过微透析的方法加入。TCEP的还原能力比beta巯基乙醇和DTT都强它的作用可以维持,周。TCEP能使结晶用的缓冲液酸化。与DTT类似TCEP需要直接加入到悬滴中因此可以考虑微透析法。beta巯基乙醇DTT和TECP的作用机制可能不同。像其他添加剂一样如果你发现一类物质对样品的稳定性和结晶有利则可以去筛选这一类物质中最适合你的样品的一种。我们建议是最好这三种还原剂都尝试一下去发现最适合的。有报道指出还原剂作为没有自由巯基的蛋白的添加剂的情况下长出了晶体的成功案例。还原剂可以与金属离子结合金属离子其被还原而还原剂的作用被抑制。这就使得用重金属原子作同晶置换法遇到了麻烦。可以使用EDTA来避免还原剂被金属离子抑制。但是如果金属离子是你的样品蛋白维持活性所必须的就要小心使用EDTA了。碱性条件下beta巯基乙醇和TECP更稳定效果要好于DTT。酸性条件下TCEP的稳定性也要好过DTT。DTT可以使Ni被还原因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT而应该考虑beta巯基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一种还原剂。在结晶实验中半胱氨酸局限性很明显那是由于它容易形成六角形的晶体。但是半胱氨酸是一种有效的添加剂能带来明显的效果不过需要铭记它的局限性。如果预期到蛋白会被氧化从制备样品开始就要加入还原剂并且在整个流程中要不断补加保证其效果。在悬滴法中可以在池液里加入还原剂利用还原剂的挥发扩散保证悬滴中还原性的环境。在确定还原剂和样品比例时需要考虑样品上自由巯基的数目和样品浓度。自由巯基数目越多样品浓度越高还原剂的用量就越大。含砷化合物与还原剂不能共用。二甲胂和二甲胂酸钠是结晶中常使用的含砷化合物它们不能与还原剂共同使用。其他不能与还原剂一起使用的物质还包括:硝酸铵过氧化氢高氯酸钾硝酸钠。在使用某种物质之前应该先查阅MaterialSafetyDataSheet(MSDS)。附原文:ReducingagentsaresubstancesthatcauseotherchemicalspeciestobereducedorgainelectronsInorderforreducingagentstocausethegainingofelectronsonsomeotherchemicalspecies,theymustundergooxidationThereforereducingagentsundergooxidationwhentheydotheirjobDithiothreitol(DTT),betamercaptoethanol(betame),andTris(Carboxyethyl)PhosphineHydrochloride(TCEPHCl)aresulfhydrylprotectivereducingagentsReducingagentsaretypicallyusedtopreventtheoxidationoffreesulfhydrylresidues(cysteines)intheproteinSuchoxidationcanleadtononspecificaggregationofthesample,sampleheterogeneity,inactivity,ordenaturationofthesampleInatypicalcrystallizationexperiment,reducingagentsareusedintheconcentrationrangeoftomMinthecrystallizationdropBetamehasonesulfhydrylgroupandistheweakestofthethreereducingagentsdiscussedhere,lastingperhapstwotothreedaysThesupplyofbetameshouldbereplenishedeverytwotothreedaysinthecrystallizationexperimenttomaintaintheeffectivenessofthereducingagentSincebetameisvolatile,itcanbeaddedtothereservoirofvapordiffusionexperimentsfordiffusionintothecrystallizationdropDTThastwosulfhydrylgroupsandlastsaboutthreetosevendaysinatypicalcrystallizationexperimentDTTisnotastrongvolatilelikebetame(althoughitdoespossessastrongodor)andshouldbeaddeddirectlytothecrystallizationdropwhenpossibleAnotherconsiderationwhenworkingwithDTTistousethemicrodialysismethodforcrystallizationsinceDTTcanbeaddedtothedialysissolutiontoreplenishthesupplyofreducingagentTCEPHClisstrongerthanbothbetameandDTT,lastingabouttoweeksinatypicalcrystallizationexperimentTCEPhydrochloridecanacidifythecrystallizationsolutionLikeDTT,TCEPHClneedstobeaddeddirectlytothecrystallizationdrop,hence,microdialysisisaconsiderationBetame,DTT,andTCEPHClcanbehavedifferentlyLikealladditives,ifyoufindaclassofcompoundshasaneffectonsamplestabilityorcrystallization,thenscreenavarietyofcompoundsinthatclasstoseewhichoneisbestforyourapplicationWhatwearetryingtosuggestisthatlikealladditives,onemightconsiderevaluatingallthreereducingagentstoseewhichoneworksbestforyoursampleTherehavebeenreportswherereducingagentshavebeenusedassuccessfulcrystallizationadditiveswheretherewerenofreesulfhydrylsinthesampleReducingagentscanbindmetalsandtracemetalcompounds,inactivatingthereducingagentandthemetalThiscanmakeheavyatomderivatizationinthepresenceofreducingagents,difficultandfrustratingEDTAcanbeaddedtothecrystallizationexperimenttoavoidinactivationofthereducingagentbymetalsKeepinmindthatifyoursampleneedsmetalsforactivityorstabilitythatEDTAwillkeepmetalsfromyoursampleWhenworkingatanalkalinepH,betameandTCEPHClaremorestablethanDTTTCEPHClismorestableatacidpHthanDTTDTTreducesnickelionsandcancauseproblemswhenpurifyingHistaggedproteinsToavoidthiscomplication,trybetameorTCEPHClasareducingagentinsteadofDTTwhenpurifyingHistaggedproteinsLcysteineisalsoareducingagentIt’susefulnessincrystallizationislimitedsinceitlikestoformsmallhexagonalplateshapedcrystalsLcysteinecanbeausefulcrystallizationadditive,butkeepthosepeskyhexagonalplatesinthebackofyourmindwhenworkingwithLcysteineIfoxidationofthesampleisexpectedoranticipated,reducingagentsshouldbepresentduringthepreparationoftheprotein(whenpossible)andshouldbeincluded,added,orreplenishedduringthefinalpreparationofthesampleforcrystallizationInvapordiffusionexperiments,thereducingagentcanbeincludedoraddedtothecrystallizationreagentinthereservoirtominimizeorpreventdilutionofthereducingagentinthesampledropWhendecidingontheappropriateconcentrationofreducingagentforthesample,considerthenumberoffreesulfhydrylsinthesampleaswellassampleconcentrationMorefreesulfhydrylsandhighersampleconcentrationmeanthatoneshouldconsiderusinghigherconcentrationsofreducingagentArsenicalcompoundsarenotcompatiblewithreducingagentsCacodylicacid,orsodiumcacodylateisanarsenicalcompoundandpopularcrystallizationbufferandisnotcompatiblewithreducingagentsOthercompoundsnotcompatiblewithreducingagentsincludeammoniumnitrate,hydroperoxide,potassiumperchlorate,sodiumnitrateChecktheMaterialSafetyDataSheet(MSDS)forthesereagentsforspecificsabouttheincompatibilitiesofthesechemicalswithreducingagents

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