L—肉碱制备和应用研究的概况

毕一6 《食品与发酵工业》 ／ 、 ’7壬 Food and Fermentation Industries 1996 No．2 I广肉碱制备和应用研究的概况 孙志浩 王雷 (江苏省微生物研究所，无锯，214063) 词 呲耥 ．堕．拥 仑添 j 概 述 L_肉碱(L-Camifine)又称肉毒碱，或称维 生素 Br，化学名 为 L_ 羟 基一7一三 甲铵 丁酸 ( hydroxy-7-butyrobetaine)。 域星二弛新型 能挂食 至塑 剂，是一种与动物体内脂肪酸代谢有关 的化 合物。它的主要功能是作为载体将长链脂肪 酸从线粒 体膜外输送到膜 内促进 脂肪酸 的 氧化。组织内只有具备足够浓度的 肉碱 ，长 链脂肪酸的 氧化与酯化才能顺利进行 ．否 则将严重破坏细胞能量代谢 另外 ，有一些研 究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，肉碱还在生酮作用、氮代谢等方面具 有一定 功能 。 虽在本世纪初 ．两位俄 国科 学家(Gule— witsch和 Krimberg)就从 肉浸汁中发现 肉碱。 但直至 1952年美国伊利诺斯州大学的研究 人员 Carter等人才确证了维生素 Br即肉碱。 早期的研究文献也有称肉碱为维生素 B 从 1953年开始，肉碱列在美 国化学文摘 中 Ⅵ taminB~索引栏 目下。1959年 Fritz发现肉碱 能促进脂肪代谢速率(称之 氧化)，1 973年 F．n~l报道首例 肉碱缺陷症并开始用肉碱进 行治疗 。直至 198i年才明确 1，肉碱是一种 很重要的营养剂_1]。 L_肉碱的生理功能主要是促进脂肪酸的 氧化作用，它作为载体形式以脂 酰肉碱形 64 式将长链脂肪酸从线粒体膜外运送 到膜 内。 在线粒体内将脂肪代谢并转变为能量 。并且， 还能将线粒体 内的短链 酰基运送到膜外，起 到调节线粒体内酰基 CoA／CoA比率的作用， 有利于能量代谢。同时它还参与其他酰基的 运输 、排 出，以免除机体因酰基积累而造成的 代谢毒性 ，或有利于一些支链氨基酸的正常 代谢 。 肉碱化学结构类似于胆碱，与氨基酸相 近 ，但不象氨基酸，它不用于蛋白质合成。由 于一些动物可由 自身合成来满足 肉碱的需 要 ，因此有人认为肉碱不是维生素 ，但习惯上 一 般研究者及生产厂商都称其为维生素 Br。 大多数动物体有能力 白已合成 肉碱，人 体 中的 肉碱生物台成主要在肝脏中，需要两 种氨基酸：赖氨酸和 甲硫氨酸；三种维生素 ： 烟酸、抗坏血 酸和维生素 ；不需要 Fe 和 分子氧参与 。肌肉组织中肉碱含量虽然较高， 但是肌 肉并不能合成肉碱，而要依赖来 自肝 肾的血液输送 ，一般来说 ，人体，尤其是成 人，能够 白已台成 以维持正常代谢所需 的肉 碱浓度 ．婴幼儿体 内合成能力很低 ，主要依靠 母乳供给 一，人或其他哺乳动物也有可能因 先天性或代谢性疾病引起体内肉碱缺乏．组 织内缺乏足够的肉碱，将严重破坏细胞 的能 量代谢。 外源性肉碱主要靠食物补充 ，肉类食物 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业 ≥ Food and Fermentation Industries 中 l，肉碱 含 量 较 高，每 公 斤 绵 羊 肉 中含 2100rng．牛肉中含 640rag，免肉 中含 21 0mg． 鸡肉中含 75rng．鱼肉中含 700rng．植物性食 物中则含量极低甚 至没有 ，小麦 中含 7～ 14mg，花生含 1mg，蔬菜 中为 0。一般来讲．完 全依赖食物供给是不够的，因此 I，肉碱成 了 一 种重要的机能性食品添加剂。 化学台 成的肉碱是一种 D1 型消旋体， 曾用于临床 ，作为食欲增进剂和调整 胃肠功 能的药物 ，早 期亦 曾有人用 D1 肉碱作 为添 加剂用于补充人体或者动物体 内的肉碱 后 来发现，只有 I，肉碱具有生理活性 ， 肉碱 还对肉碱乙酰转移酶(CAT)和肉碱脂肪酰转 移酶(PTC)有竞争性抑制作用 ]。因而．近年 DL-肉碱已趋淘汰，而 l，肉碱的制备 、应用等 研究开发正成为热门 I，肉碱 的制备 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 由于 I，肉碱在临床上的显著效果 ．并且 作为人体必需 的营养物质、机能性食品添加 剂和饲料添加剂 ，引起 了人们的兴趣和关注。 近年来世界各 国对 I，肉碱的研 究开发非 常 热烈 ，综台其制备方法主要有下述 d种。 一 、 提取法 有 报道 说 ．1 905年 W+Gulewitsch等 已 经从 肉浸膏中分离出 L 肉碱，典型的提取方 法是 Carter等 1952年报道 的 ]．用 450g牛 肉浸膏提取 0．6g纯晶 肉碱，提取纯化的步骤 比较复杂，主要的技术关键是 肉浸汁中胆碱 组分的分离。近年仍有关于从牛 肉或牛乳处 理液 中提取 L 肉碱的专利报道 。如 吉田一 仁 因缺少作为食品添加剂的纯品 l，肉碱 为 了用于强化 肉碱的食品添加 ，从牛乳中提 取 L厂肉碱。56公斤牛乳得到含 2 I，肉碱 的 乳糖粉末 1O0g。 二、台成法 1953年就有 DL 肉碱台成的专利报道 ． 60年 代已有工业化生产，1982年我 国亦有 DL肉碱作为 胃药的生产和应用。用合成法 制各 I，肉碱的方法大致分为两类； (1)直接从 DL 肉碱或其衍生物出发 ，用 樟脑酸、 乙酰一 谷氨酸或乙苯酰-1．(一)酒 石酸为拆分剂的化学拆分法。 (2)先制备左旋前体再台成的方法 ，其中 也包括某一步过程用生物酶或微生物左旋化 的方法 如先用棒杆菌或假丝酵母的脂肪酶 不对称水解 方法 制备 a一 羟基 丁酸腈再 制备 L 肉碱。合成方法一般以环氧氯丙烷为 原料 ，或直接用 DL肉碱作原料，均能制备台 格的 l，肉碱，但因合成步骤多，收率低，成本 高， 肉碱消旋化困难，不能回收，拆分剂昂 贵或产生有害物质 (Ag十或 NaCN等)造成污 染等 ，工业化生产尚需有突破性的进展 三、微生物发酵法 已有很多研究者发现，不仅动物组织中 普遍存在肉碱 ，不少种类 的微生物 中也存在 有 I，肉碱。 日本 的中山清等 报道了酵母 、 曲霉、青霉 、根霉等许多属种的菌体中含有肉 碱 ，但 目前处于筛选菌种和摸索培养阶段 ，产 肉碱水平尚较低，液体发酵法一般含 l，肉碱 0．3～O+4mg／g干菌体。Charles．J．Sih等 筛 选了能 消耗 肉碱而 积 累 l，肉碱的微 生 物，以 2 DL-肉碱作原料 ．25(：发酵 44h，积 累 i，肉碱 0．4 。发酵法 中另一个突出的研 究 方向是用固体培养的方法生产含 I，肉碱 的微生物菌体，提取 肉碱或直接作为饲料添 加剂．目前的最好水平可达到发酵 6天．每公 斤粗培养物(干)含 肉碱 1g左右 ]．粗品作为 饲料添加剂已经成功 四、酶法转化 这是 目前研究最多 ，亦最有前途的方法． 主要 有 ： 1．DL 肉碱衍生物的酶法拆分 将 DL-肉碱进行乙酰化 ．制备成酰胺、腈 等 酯化物 ，筛选动物、微生物 中存在的酯酶、 酰 胺 酶 或 腈 水解 酶 等 进 行 生 物 转 化 ，如 Dropsy E D．等人一 用鳗鱼乙酰胆碱 酯酶水 解 乙酰 肉碱．分离得到 I，乙酰 肉碱 再水 解得到 L肉碱。河村 昌男等[ttj用柠檬 酸细 65 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Fcod and Fermentation Industries 菌、变形杆菌、假单胞菌等微生物的酯酶 ，将 甲基化、乙基化或苯基化的 DL-肉碱酯化物 中的 I，肉碱酯化物 ，选择性地水解而得到 L 肉碱 126mM 底物可水解得到 56mM 的 I， 肉碱 ，转化率为 44 中山清等。 。 报道 了用 假单胞菌的酰胺酶选择性水解 DL-肉碱酰胺 或肉碱腈制备得光学纯度 99 以上的 l，肉 碱。 2． 脱 氢 肉碱 的酶 法转 化 这是较早进行酶法制备 l，肉碱的方法 ， 法国石油研究所 1980年即已报道 了这方面 的研究 。Jean—Paul V 等Ela2用恶臭假单胞菌提 取的 肉碱脱氢酶t转化 脱氢 肉碱·产物 达 4．5 ，转化率 95 。此后 Souppe Jerome及 Oatrick等相继申报 了几个专利0 。 ，最好水 平可 以 达 到 转 化 液 产 l，肉 碱 8 左 右 (o．6M)，转化率 95 ，而且可以用超滤器回 收菌 体 的方法进 行连 续生产 ，生 产率达 到 1．67g／h·L，但 由于脱氢还原过程 中需要昂 贵 的辅酶 NADH．不适宜于工业化生产。为 了解 决此 难点 ，有 人报道 了 NADH再生 方 法 ，和不用 NADH的酶法脱氢制备 l，肉碱的 研究。 3、反式巴豆甜菜碱的酶法水解 反式巴豆甜菜碱是生物合成 L肉碱 的 一 种代谢途径的前体 据研究报遭．很多微生 物 中具有这种水解酶，能够水解巴豆甜菜碱 生成 I，肉碱，其中产酶活力较高的菌株有变 形杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、柠檬酸杆菌等， 某些霉菌、酵母、放线菌亦有产此酶能力 横 关等“ 用变形 杆菌 AJ一2772湿细胞 作酶 源 转化62．5g／L巴豆甜菜 碱底物．产 物 L肉碱 含量为 40g／L，转化率 接近 50 ，认为此 酶 反 应是可逆的。河村 昌男等_ 用变形 杆菌 ATCC1253或大肠杆菌 IFO3301的菌体作酶 源，用 16g／L巴豆甜菜碱作底物，产物 I，肉 碱含量达到 6g／I ，并采用卡拉胶固定化细胞 分批转化 l 次．转化率保持在 40 ～5o 这种转化方法有其独特优点，底物便宜 - 且可利用拆分废物 D一肉碱进行脱水制备，但 66 一 般菌株均不耐巴豆甜菜碱 ，产物含量偏低， 且转化率偏低 ，仅 4o ～ o 。残余底物巴 豆甜菜碱又难以分离 回收，影响成本 ，影响产 品质量 。但瑞士 Kulla}L一 一报道 了突变菌株 改变 了此酶 特性取 得 了突破 ，用 突变 菌株 HK1331并且用分批补料法 150～155h转化 液中累积 肉碱达 61g／L，转 化率 90 以上 。 江苏省微生物研究所承担了江苏省技术储备 课题和省社会发展项 目．用变形杆菌水解巴 豆甜菜碱进行酶转化制备 I，肉碱研究。目前 研究水平为：酶转化产 l，肉碱 5g／L左右 t转 化率 40 。由于可利用拆分废物 n 肉碱作 原料 ，大大降低制造成本 ，按预测水 平估算 ， 制造成本 1000元／ 以下，为进 口肉碱 的三 分 之一 。 4、 丁基甜 菜碱 的酶法羟化 一 丁基甜菜碱是 L肉碱生物合 成的直 接前体 。动物体内由赖氨酸、甲硫氨酸等物质 生物合成 ￡-三 甲基一 羟基赖氨酸，再由醛缩 酶、醛氧化酶合成 丁 基甜菜 碱，最后 由羟 化酶转化为 L肉碱 。早在 1967年 Lindstedr G、_1 报道 了鼠肝羟化酶转化 一丁基甜菜碱 制备 肉碱的研究t并报道假单胞菌有类似的 机理 I 982年．意大利 Cavazza c 报道了用 粗糙链孢霉孢子经过超声波破碎作酶液 ，转 化 2～14rnmol的 丁基甜菜碱底物 ，转化率 达到 80 ，瑞士 Nobile S．等 】]1986年报道 了由土壤分离 的农 杆菌 [-IK47转 化 丁基 甜菜碱的研 究。1991年，瑞士 Kulla}L Eas_~报 道了其突变株 HK1349在 400L反应器 中试 规模下，细胞循环方法连续转化 丁基甜菜 碱底 物制备 L厂肉碱的结果 ，产 I一肉碱 达到 60g／L，转化率 95 以上 ，连续数周生产性不 减，此方法转化率高，产物分离容易．产品纯 度亦高 。 I，肉碱的应用 对于 l，肉碱的应用研究 已经相 当广泛、 深入 ，其生理生化及临床效果可以说相 当明 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 F_00d and Fermentation Industries 确。80年代 以后 ．国外已有商品，列人美国药 典 。近年国内也有含肉碱的婴儿奶粉及营养 品上市，我国卫生部也已将 I，肉碱列人营养 强化剂。I，肉碱作为一种新型的机能性 食品 添加剂已为世 界各 国普遍接受 ，从各国的研 究报道看 ，I，肉碱的应用主要是作 为机能性 食品添加剂和饲料添加剂 ，在作为治疗用药 物的临床应用上也有广泛研究 。 一 、作为机能性食品添加剂 L肉碱为人体 内存在的天然物质，在人 体能量代谢 中有明确 的生理功能，l，肉碱作 为一种人体营养强化和补充物质已经被人们 接受．作为机能性食品添加剂 的应用主要是 添加于婴儿用奶粉、运动员饮料以及减肥健 美营养食品。 1．添加 于婴 儿奶粉 周建鸿、刘冬生0 对 肉碱 与婴儿营养 的 关 系作 了详尽的综述，认为婴儿体 内肉碱生 物合成能力较弱，不能满足其正常的代谢需 要．必须从外源摄取肉碱 ．加上婴儿生长发育 较快 。不断合成新组织，因此需要的肉碱量增 加 ．每 日给婴儿补充肉碱是必需的 肉碱不仅 在能量产生和脂肪代谢 过程 中起重要作用． 而且在维持婴儿生命及促进婴幼儿发 育的一 些生理过程．如生酮作用 、氮代谢等方面均具 有一定的功能。Boom P．R．1 也对肉碱在婴 幼儿发育中的重要作用加以评述，认为新生 婴儿 口服能量物质很少 ．脂肪水解是得到能 量的一个重要过程．保持足够的体温对新生 儿的存活很重要 ，而 肉碱在生热作用 中起 了 重要作用。在完全 胃肠外营养液中添加肉碱． 既能改善脂肪酸氧化．也对供能、生热、生酮、 改善代谢平衡、降低血氨水平、有机酸分泌等 方面有益 。目前国内已有添加肉碱的母乳化 奶粉上市 。 2．添加于运动员饮抖 I)ecombaz J．等报道 ．体育运动后人体 肌肉组织中的游离 肉碱浓度下降 20 ，他们 认为不排除由补充肉碱带来功能性 的改善。 关于运动与肉碱关系的研究很多．认为补充 肉碱促进体 内脂肪氧化作为能源，对提高运 动持久力 ．提高爆发力有好处，桑 田有等 设计了一种在常规的运动员饮料中添加适量 L 肉碱，柳本行雄Ess]也报道 了一种体力增强 剂，用二 十八烷醇和 I，肉碱配伍 ，有相乘作 用，能使全身肌肉松弛。同时又提高爆发力· 提高维持长时间高运动量的耐力，还提高基 础代谢率．改善心肌层的营养状态 将它作为 机能性食品．一 日一次摄取 肉碱 7．5～10g． 有相 当好的增强体力的效果 3．添加 于减肥健美食品 早在 70年代，就有 DL-肉碱用于治疗肥 胖症的专利报道 ．由于体内肉碱缺乏 ，脂肪类 代谢紊乱 ，一方面会造成肌肉供能不足，产生 肌体疲劳及导致相关的心血管疾病，另一方 面还会造成脂类物质在肌纤维和肝脏中积聚 产生肥胖 、脂肪肝等。桑田有等认为运动不足 的肥胖类型的人蓄积脂肪多 ，体 内肉碱生物 台成能力低下，加人 L厂肉碱的运动员饮料有 效地将体 内蓄积的脂肪转变成能量 ，提高运 动的持久力，也有防止肥胖的效果一。 。据报 道，I，肉碱为主成分 的降脂健美食品在美 国 和欧洲市场上 十分受欢迎 ，产品畅销不衰·我 国卫生部也将 I，肉碱列人 营养强化剂．广州 等地也 推 出了用进 口 l，肉碱配制 的“康 丽 亭”等营养品上市。 二、作为饲料添加剂 L肉碱对于动物生长亦有相应的促进作 用，国外 已进行 了添加 肉碱于饲料、饵料 进行饲养猪、牛、鸡、鱼等试验 由于作 为食品 或饲料类的植物性作物几乎不含肉碱，因此 外源性摄人 肉碱就显得特别重要 ．可 明显地 促进素食类 、食草类 动物的生长，故 可用于 猪、鸡饲料、鱼饵料 等 。 三、作为治疗用药物 I，肉碱不仅是 机能性食品饲料添加剂· 在临床应用上作为药物对许多病症有效。早 在 60年代．合成生产的 DI，肉碱即作为胃药 应用于临床．我国 1982年也有商品名为“康 胃素”的 D1，肉碱盐酸盐作为消化药．其临床 67 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 应用主要是助消化 ，促进食欲。后来发现只有 Ir肉碱起作用， 肉碱反而有拮抗作用 ，因此 逐渐为 I，肉碱所替代。L肉碱的临床研究是 从 1973年 Engel报道 了首例 肉碱缺 乏症开 始的。可用于 肉碱缺乏症的治疗 ，降血脂、减 肥和治疗血管疾病，作为营养剂．治疗急性氨 中毒、昏迷及神经系统疾病 。 结 语 I，肉碱作为新型机能性食品添加剂已经 得到广泛应用，有相当大的市场需求 ，而 且作 为饲料添加剂及临床用药 ．也有潜在的广阔 市场。目前 l，肉碱还仅有瑞士、意大利、日本 等少数 国家能够生产，国内需求全靠进 口，价 格昂贵 (3000元／ )，国内对该产品的研究 开发甚少。数年前曾有合成法削备 I，肉碱的 报道 ，由于成本及安全性等方面原因．离产业 化 尚有距离，国内尚未见用生物技术制备 【， 肉碱的研究报道。江苏省微生物研究所正致 力于开展酶法制备 I，肉碱的研究．可望在菌 种、底物制备、产酶及转化条件、产物分离纯 化等方面有所进展 ，这将对 I，肉碱 的产业化 及大量廉价供应以及在食品、营养、饲料 以及 医药等领域广泛应用产生一定影响。 参 考 文 献 [1]杨 能，张惟杰 ：生物 化学与 生物物 理进 展 1992，l9(2)：8l一 8s [2]BurdeG．J et a1．：WO 91 205554．]987 [3]周 建 鸿 ，刘 冬 生：国外 医 学 卫 生 学 丹 册 1992，6：347 [4]Qvaxea C ，DE，3，123，975，1982 Is]Carter}L E et a1．：Arch．Biophys，l 952—38 405 [6]吉田一仁等 ：昭 62—63553—1987 [7]中山清等 ：平 2--69189．1 990 [8]C~arlm J． h，et a1．：WO 85-04900·1985 [9]上 山贞夫等：平 5—123196，1993 [10]Dropsy E P ．K]ibanov．A N．：Biotech．， o- eng·1984·26：911— 915 [11]诃村昌男等 ：昭 62—118899，1 987 [18]中 山清等：平 1—222796，1989 [13]Jean—paul et a1．：App1．Microbio1．，1980， 39(2)：32 一 334 [14]Souppe Jerome et a1．：FR 2623520，1988 [15]s。uppe Jeron~et a1．：FR2623520，1989 [16]Ken~o YokceeM，et a1．：,％rio．Pio1．．1988，52 (10)：241 5— 2421 17]河村 昌男等 ，昭 61—23494，1986 118]Kulla|L，el a1．：口 ．457．436，1991 [19]Idndstedt G． Biochemistry．1967．6(5)：1271 — 128l [20]Nobile S．，n∞husses J：J Bact．．1986，168 (2)：78O一 78{ [21]Kulla HarL~G ：Ohimia，1991．45：81～85 [22]Bonm~．P R．：Can．J．Phy~o1．Ph~rumco1．． 1985，63：571— 576 - 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