毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究

毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的研究 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 博士后士学位论文 毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究 姓名:王绍校 申请学位级别:博士后士 专业:生物技术 指导教师:张世明吴祥甫 20050401 摘要 根据不同来源的,一谷氨酰半胱氨酸连接酶基因的同源性比较，采用,,—,,,和,,,,技术，从毕赤氏甲醇酵母,,,,,中克隆了编码,一谷氨酰半胱氨酸连接酶的,,,,序列。它的全长是,,,, ,,，编码一个含有,,,个氨基酸的多肽，该多肽的计算分子量是,,(, ,,,。它的推导氨基酸序列与已知的来源于酵母、小鼠和人的,一谷氨酰半胱氨酸连接酶的氨基酸序列有较高的相似性。在毕赤氏甲醇酵母,,,,,中敲除该基因，使,,,,,成为谷胱甘肽自养型菌株。在毕赤氏甲醇酵母,,,,,中加强该基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达，可以使细胞内谷胱甘肽含量的增加。重组菌株,,在甲醇诱导过程中，胞内谷胱甘肽含量为,,,,,,,,,,,,,，为目前报道的胱甘肽含量最高的酵母菌株之一。 根据不同来源的甲硫氨酸合成酶基因保守序列，从毕赤氏甲醇酵母,,,,,中克隆了该基因的一段保守序列，应用,,,,技术进一步克隆了两端序列，得到的该基因的全序列，其推导的多肽含有,,,个氨基酸残基，分子量为,, ,,,。与酿酒酵母的甲硫氨酸合成酶基因有,,,的同一性。甲硫氨酸合成酶由两个结构域组成，活性位点在,端的结构域中。,端结构域参与酶和底物,;,,,,,、,也一,,,,,,,,。(,?,)的结合。功能互补试验表明:在酿酒酵母甲硫氨酸合成酶缺陷型菌株中引入该基因，可以使该菌株在基本培养基中恢复生长。关键词:,一谷氨酰半胱氨酸连接酶;甲硫氨酸合成酶:,,,,;基因敲除;毕赤氏甲醇酵母,,,,,,;, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,—;,,,,,,, ,,,,,,(,,,),,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,？,,,;, ,,;,,,,, ,,—,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,，,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,?,,, ,,, ,?,,,。,,,, ,,,,,,,,,(,,, ,,,,—,,,,,,,,,, ,, , ,,, ,, ,?瑁幔?,,;,,,, , ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, , ;,,;,,,,,,,,,,;,,,, ,,,, ,, ,,(, ,,,(,,, ,,,,;,, ,,,,, ,;,, ,,？,,,;, ,, ,,,(, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,(,,, ,,, ,,,,,(,,, ,,？,,,;, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,;;,,,,,, ,,(,,,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,,,,,,, ,, ,, , ,,,,,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,),,,,,,,,,,(,,,,,;,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,上,,,,,,,, ,, , , , ,,;,,,,,, ,,, ,;;,,,,,,,,,,, ,,, ;,,,,(，, ,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,(,,，,,, ,,, ;,,,,,, ,,,;,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,，,,,;, ,, ,,, ,, ,,, ,,,】,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,( ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,, ,,？,,,;,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,;,,,(,,, ;,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,,, ;,,,,, ,,,,尸,;,,, ,,,,,,,, ,,,,,,; 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,,,,,, ,,,,,,,,, ,?,,,,,,,妒,,,,,,, (,,,) , ,,—，— , ?,;灿一?州?,岫;?洲 “;?,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,( ， , ,,一,,;一,: ,?,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,鳓 ,,,,,,,,,, ,瑚 掣、,。,铀。,芒 ,,,,, ， „? ，,，,,,,,;”。,—;,一,一眦 ,，,(,(,,,,,,; ,,,,,, ;,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,, ,,,,, ,;,,,( 与其他的有硫酸盐还原能力的真核微生物一样，在酵母中硫酸盐主要用于合成含硫有机代谢产物，这其中包括了含硫的氨基酸——甲硫氨酸，半胱氨酸，高半胱氨酸和它们的衍生物腺苷甲硫氨酸(,,,,,,,,,,一卜,,,,,,,,,,，,,,)，腺苷高半胱氨酸(,—,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,，,,,)，谷胱甘肽等有经济价值的化合物。,(,(,蛋氨酸代谢 转甲基作用与蛋氨酸循环蛋氨酸中含有,甲基，可参与多种转甲基的反应生成多种含甲基的生理活性物质。在腺苷转移酶催化下与,,,反应生成,一腺苷蛋 氨酸(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,)。,,,中的甲基是高度活化的，称活性甲基，,,,称为活性蛋氨酸。 ,,?,,,;,,,,,,, ,,，,,,, ,垤? ,,,, ,， 淌协蝴 一一…一 ,,,,;刚,出, ,,,,,,日 (,,,) ?停牛裕?，,舯 ，枫帕忡? ,、，,,, ,??,,,,订、，,,,,,,,, 懈, ,耋 , 删, 忡卿 ,??,,,,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,, 一,。艇翟‰,，,舻一姗 ,,删 ,，,,, ,,,,,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,,,,,, ,, , ;,,,,,,,,,( ,,,可在不同甲基转移酶(,,,,,, ,,,,,,,,,,,)的催化下，将甲基转移给各种甲接受体而形成许多甲基化合物，如肾上腺素、胆碱、甜菜碱、肉毒碱、肌酸等都是从,,,中获得甲基的。,,,是体内最主要的甲基供体。 , ，目锵詈 一是,,一 ,募营阿越雌麟氯簟 岔 斡一 萝，,一, ,,艨馨鼍氲薹 ,,,,臻,瞳 ,,,转出甲基后形成,一腺苷同型半胱氨酸,,,,,,,,,, ,一?瞽辩戤尊赫熬瞳 篙沿, 嘲锻半腿蕾蕞 ,,,,;,,,,,,，,,,)，,,,水解释出腺苷变为同型半胱氨酸(,,,,;,,,,,,，,,,,)。同型半胱氨酸可以接受甲基再生成蛋氨酸，形成一个循环过程，称为蛋氨酸循环(,,,,,,,,,, ;,;,,)。此循环的生理意义在于蛋氨酸分子中甲基可间接由其它非必需氨基酸提供，以防蛋氨酸的大量消耗(,，,,)。 ?孽 ,，,(,( ,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,(,,,);,;,, 同型半胱氨酸甲基转移酶的辅酶是甲基,,,。维生素,,,缺乏会引起蛋氨酸循环受阻。临床上可以见到维生素,,,缺乏引起的巨幼细胞性贫血。由于维生素,,,缺乏，引起甲基,,,缺乏，使甲基转移酶活性低下，甲基转移反应受阻导致时酸以,。一,,。,地形式在体内堆积。这样，其它形式的叶酸大量消耗，以这些叶酸作辅酶的酶活力降低，影响了嘌呤碱和胸腺嘧啶的合成，因而影响核酸的合成，引起巨幼细胞性贫血。也就是说，维生素,,,对核酸合成的影响是间接地通过影响叶酸代谢而实现的。 虽蛋氨酸循环可生成蛋氨酸，但体内不能合成同型半胱氨酸，只能由蛋氨酸转变而来，所以体内实际上不能合成蛋氨酸，必须由食物供给。 同型半胱氨酸还可在胱硫醚合成酶(;,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,)催化下与丝氨酸缩合生成胱硫醚(;,,,,,,,,,,,,)，再经胱硫醚酶催化水解生成半胱氨酸，,一酮丁酸和氨。,一酮丁酸转变为琥珀酸单酰,,,，通过三羧酸循环，可以生成葡萄糖、所以蛋氨酸为生糖氨基酸。 肌酸的合成肌酸(;,,,,,,,)和磷酸肌酸(,,,,,,,, ,,,,,,,,,)在能量储存及利用中起重要作用。二者互变使体内,,,供应具有后备潜力。肌酸在肝和肾中合成，广泛分布于骨骼肌、心肌、大脑等组织中。肌酸以甘氨酸为骨架，精氨酸提供脒基、,,,供给甲基、在脒基转移酶和甲基转移酶的催化下合成。在肌酸激酶(;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,)催化下将,,,中柳转移到肌酸分子中形成磷酸肌酸(;,)储备起来(,，,(,)。 ,,,由两种亚基组成;即,亚基(肌型)与,亚基(脑型)。有三种同工酶;即删型(在骨骼肌中),,型在脑中)和,,型(在心肌中)。心肌梗塞时，血中,,型,,,活性增高，可作辅助诊断的指标之一。 ,,,,, :硼 ,，,,《 ,,捌,,,, ,,,, ,,,, 甘氨酸 严登 熙,乜 岛氮棘 ，眦 胍五魏 , ,,, ，,,肿 科。一一一乞 蛾泌帆霹 辩曩腻旋 品， 黻唆 , 一鞠静最栽囊 觏嚣, ,，,(,(,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 肌酸和磷酸肌酸代谢的终产物是肌酸酐(;,,,,,,,,,)简称肌酐。正常成人，每日尿中肌酐量恒定。肾功能障碍时，检查血或尿中肌酐含量以帮助诊断。,(,(,半胱氨酸和胱氨酸的代谢 半胱氨酸和胱氨酸的互变半胱氨酸含巯基(一,,)，胱氨酸含有二硫键(,—,一)，二者可通过氧化还原而互变。胱氨酸不参与蛋白质的合成，蛋白质中的胱氨酸由半胱氨酸残基氧化脱氢而来。在蛋白质分子中两个半胱氨酸残基间所形成的二硫键对维持蛋白质分子构象起重要作用。而蛋白分子中半胱氨酸的巯基是许多蛋白质或酶的活性基团。 掣广,, 铲?？心,„, ,×(,,(,,:音,, ,秘，?,—,,。 , ,,,, , ,,),, ， ,,,, 毕胱氮歉 旒摄教 半胱氨酸分解代谢人体中半胱氨酸主要通过两条途径降解为丙酮酸。一是加双氧酶催化的直接氧化途径，或称半胱亚磺酸途径，另一是通过转氨的,一巯基丙酮酸途径。,(,(,活性硫酸根代谢含硫氨基酸经分解代谢可生成,。,，,。,氧化成为硫酸。半胱氨酸巯基亦可先氧化生成亚磺基，然后再生成硫酸。其中一部分以无机盐形式从尿中排出，一部分经活化生成,?磷酸腺菅一,?,磷酸硫酸(,?一,,,,,,,,,,,,,,,, ,?一,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)，即活性硫酸根。 ,,,,的性质活泼，在肝脏的生物转化中有重要作用。例如类固醇激素可与,,,,结合成硫酸酯而被灭活，一些外源性酚类亦可形成硫酸酯而增加其溶解性以利于从尿于排出。此外，,,,,也可参与硫酸角质素及硫酸软骨素等分子中硫酸化氨基多糖的合成。 ,弘??,一删一,一删一一眦嘲一删, ～啡 ,„ ,,,—,,，, 帚 ,, , .