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双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用.pdf

双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用

chemidoctor
2012-10-09 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用pdf》,可适用于领域

食品与发酵工业FoodandFermentationIndustriesVo.No.双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用吕斌陈有容陈聋胜(上海水产大学.上海)摘要最木相体系在分离提纯发酵渡或细胞培养液产鳓等方面的应用不断增多。文章综进了最永相体系的基车性质、萃取酶或蛋白质的工艺流程毗及其应用。对该技术在工业应方面面临的题进行了讨论井简要舟皇召了一些最近的研究进展。关键词双水捃体系萃取生蜘活性物质双水相萃取(aqueoustwophasepatti一~ioning)是年当Beiierinck把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。年瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质J。年。Kua和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质使胞内酶的提取过程大为改善J。此后对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质方面与其他提取方法相比它是一项具有许多优势的分离新技术。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化并逐步向工业化生产迈进展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景将有力推动生物技术的发展。双水相萃取的基本特性种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互混合时最常见的现象是由于种聚合物间存在较强的斥力或空间阻碍使者无法相互渗透不能形成均一相故达到平衡后形成两相这种聚合物分别位于互不相溶的两相中即形成聚合物/聚合物双水相体系。同时某些聚合物溶液和一些无机盐溶液相混时在一定浓度下由于盐析作用也会形成两相即聚合物/无机盐双水相体第一作者:碰士讲师。收稿时间:一毗一o改回时间:一l系常用的无机盐有磷酸盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外能形成双水相体系的物质还有高分子电解质、低分子量化合物(表)。衰各种娄型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙=醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮羧甲基纤维索钠聚乙二醇i质高葡聚糖硫酸钠羧甲摹纤维索钠喜鬻低分子量葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇鬈常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高葡聚糖价格昂贵的缘故。物质在两相中的选择性分配是琉水键、氢键和离子键等相互作用的结果可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征细胞这些更大颗粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种维普资讯http:wwwcqvipcom第卷第期吕斌等:双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等l。双水相萃取主要具有如下基本特点:()体系有生物亲和性。两相中的水分含量通常高达%~O%所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害甚至还有稳定保护作用而且相界面张力比水.有机或有机一有机两相体系的界面张力要小~个数量级。由于生物活性物质在有机溶剂中易变性再加上有的生物活性物质亲水性很强不溶于有机溶剂有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。()与在提取酶等生物活性物质中常用的亲和层析相比双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外操作能够容易、精确地按比例放大非常适合大规模应用可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大.应用受到限制。()聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配所以操作容易进行控制进而达到目的产物的最佳萃取条件。()可与细胞破碎相结合即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间又避免了胞内酶的损失l。()能进行萃取性的生物转化E.。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第步相结合即生物反应在其中一相中进行同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题.而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定.活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行尤其适于连续生产。’()亲和萃取(亲和分配)可大大提高分配系数和萃取专一性“。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等粒子的提取~¨】冠水相萃取的工艺流程双水相体系在工业上主要用于从发酵液、细胞培养液中分离细胞碎片提取酶或蛋白质。图J是用PEG/无机盐体系通过步萃取从产氮短杆菌中回收延胡索酸酶的流程主要由部分组成:()目的产物的萃取()PEG的循环()无机盐的循环。.目的产物的萃取细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后.与PEG和无机盐在萃取器中混合然后进入离心机分相。通过选择合适的双水相组成。一般使目标蛋白质分配到上相(PEG相)而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相)。主要原因有:()核酸和多糖由于其亲水性易分配到富盐相目标蛋白质只有分配到富PEG相才能达到分离目的。()下相的高盐浓度易造成蛋白质失活或沉淀而PEG对蛋白质有保护作用。()细胞碎片分配在下相有利于连续式离心机分离如在上相易堵塞离心机出口。第步萃取后的上相中还含有较多杂蛋白及一些核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相)等可通过加入适量的盐.再次形成PEG/无机盐体系来进行纯化。目标蛋白质仍留在PEG相中(图)【。在第步萃取中则将蛋白质转入富盐相从而将蛋白质与PEG分离开(图)。但从经济角度考虑。一般用步萃取即在第维普资讯http:wwwcqvipcom食品与发酵工业FoodandFermentationInd~tries"Co.No.步将目标蛋白质转入富盐相。.PEG的循环在大规模双水相萃取过程中成相材料的回收和循环使用不仅可以减少废水处理的费用还可以节约化学试剂降低成本。PEG回收有种方法:一种即前面所述的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG(图)一种是将PEG通过离子交换树脂洗脱剂先洗出PEG再洗出蛋白质。现在常用的方法是将第步萃取的PEG相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用(图)。.无机盐的循环一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到℃使盐结晶析出然后用离心机分离收集另一种是用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他两相体系如水一有机溶剂体系所通用的设备商业化的混合器.沉淀器系统以及离心分离机已成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术也可提高两相分离。尽管刚开始应用时大多数双水相萃取是间歇式的但此技术更适合于错流萃取的连续生产L这样可有效利用空间和时间尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。年.Hustedt等人证明在工业生产规模上可将双水相体系用于连续错流萃取延胡索酸酶和青霉素配基转移酶。圉用双水相萃取法提纯酵的流程图。。一谳莉‘⋯⋯一图连续错流萃取回收酶的流程图工业上一般先用超滤等方法浓缩发酵液再用双水相萃取酶和蛋白质这样能提高对生物活性物质的萃取效率。最后用层析等技术进一步提纯以得到产品。所以双水相萃取技术是对层析等高度专一性提纯方法的补充而不是代替。双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面:()提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面.对发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取(表)。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶.绝大多数是用PEG作上相成相聚合钧葡橐馘嘞争:垮维普资讯http:wwwcqvipcom第卷第期吕斌等:双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质【。()进行萃取性生物转化。应用实例有:利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为一氨基青霉烷酸等。()食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。在生物技术方面可用来提取DNA。主要目的有:①分离提纯②分级分离③探测体内反应或体外处理时颗粒表面的变化④研究颗粒表面结构与生物学功能的相互关系⑤研究细胞与细胞或细胞与生物大分子间相互作用⑥探测种属关系十分接近的细胞表面细微的差别。大多数都是用亲和萃取方法来达到目的的J。()应用于液一液分配层析(LLPc)。将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物)上另一种聚合物的溶液作为流动相这种柱层析技()萃取细胞、细胞器、膜等粒子(表)术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。衰双水相体系提取酶和蛋白质的实例括号内的数字表示萃取缎数。衰双水相萃取细胞细胞器和囊的种类动物细胞血红细胞淋巴细胞、精子细胞真菌细胞纯绿青霉细菌细胞杀蛙气单胞苗(鱼的一种病原体)篓体二业应赝所面临的问题双水相萃取技术目前仍不是十分成熟理论及技术均存在一定的问题。尽管双水相体系的分配机制已成为研究重点但并未彻底清楚体系的物理、化学性质还未完全了解导致难以达到最佳萃取条件因而应用有限。有关高聚物溶液的理论目前最好的是Flory和Huggins的阿格学说能很好地预测高聚物溶液的一般性质但其主要缺点在于没有考虑溶剂结构的影响。成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品价格很高用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高使分离困难f。研究应用最多的PEG并不是双水相体系最适和的聚合物磷酸盐又会带来环境问题故开发新的聚合物是该技术应用急需解决的问题。dextran可被改性淀粉(reppaleEs)、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素(EHEc)等代替。聚乙烯醇(PvA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)已作为PEG的替代品。磷酸盐已被硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐取代。不断有新的体系被开发研究出来如双水相胶束体系(twophaseaqueousmicellarsystems)”一J、去污剂形成的双水相体系(detergentbasedaqueoustwophasesitstem)。还有一种新的体系是只有一种成相聚合物的双水相体系上相几乎%是维普资讯http:wwwcqvipcom食品与发酵工业FoodandFermentafionIndustriesvo.N。.水聚合物位于下相【J。这些体系不仅操作成本低萃取效果好还为生物活性物质提供了更温和良好的环境。今后研究的焦点应该是:进一步认识双水相萃取的基础理论。寻找更为廉价的成相物质提高萃取专一性.扩大该技术在发酵工业上所能提取的酶和蛋白质的种类及范围。参考文献tAtbercsmnPA.PartitionofCellParticlesandMacromoleculesNewYork}WieyIntersclence俞俊棠主编.生物工艺学上海:华东化工学院出版社.周晓云傅美景.浙江农业大学学报。。():~OHustedtH。KronKH.MengeUela】TrendsBiotechno..:~周晓云编.酶技术北京:石油工业出版社.刘国诠等编.生物工程下游技术北京:化学工业出版社.zhiGucsLlXiaoLi.Feng.J.ChumTech.oI.Biotechno..():~YunJKRajniKoM.Biotechno.Bineng...:~MatsLVasanthyA.oM.BiotecllnBioeng.:~GethrdKGerdB.Bio~eparation..(/):~IlCheAnKuJc~sephDHJam船BB.Biotechno.Bioeng..:t~JohaDs$onGela.J.Cbromatogr...():~lSchustolaDetaI.DECHEMABiotechn【.Conf..:~tⅥataKisGeta.J.Chromatogr...f):tt~FlygareS.WikstromP.JohanssonGeta.EnzymeMicrob.Technol:~JoshJBSawantSBalBi~arat.ont。(/):~TanujaS.Sriniva.sNDeta.Prcc~~Biocllem..。().~李艳主编.发酵工业概论北京:中国轻工业出版社.SrlnivasNDRashmiKRelaI.ProcessBiochem.(/)~VliterH.Bice,eparation.t.t(/){~golandMJ.Boseparation.(/)~StanburyP.WhitakerA.PfindpI~ofFerme~tationTechnologyOxfrd:P~gamon.SikdarSK。ColeKD.StewartRMetalBin/Techndogy.():~HartyW.CoteJ.DonaldEB.Ana.Biochem..t。:~MOilerW.Bic~separationt(/):~BrooksDESharpKA.FisherD.Part~一tinninginAqueousTw~phaseSystems:Th∞ry.Methods.UsesandApplicationstoBiotechnologyOrland。:AcademicPrc~s.扬基础.沈忠耀.汪家鼎.清华大学学报.【)~NissonHKjellenGLingTGIetalProc.thEur.Gong.onBiotechno.。:~LiuCLNikasYJBhnkscllteinDBioteeh.no.Bioeng.。.:~NikasYJ.LCL.SrivastavaT.Macmml船..:~lMinutllT.GierenH.PapeU.RathsHC.Biotechno.B/oeng..:HansOlofJohanssonfoiefinePFolkeT.Biotechnd.Bioeng.():AqueousTwophasePartitioningandApplicationsLuBinChenYourongChenShunsheng(ShanghaiFishari~University.Shanghai)ABSTRACTAqueoustwophasesystemsarebecomingincreasinglywildlyusedtoextractandpurifyproductsfmmfermentationsandcellculturebroths.ThispaperreviewedthebasicpropertiesenzyTneandproteinextractionprocessandapplicationsofaqueoustwophasesystems.Theproblemsencounteredintheindustrywerediscussedandsomerecentresearcheswereintmduted.Keywordsaqueoustwophasesystemextractbioactivematerial维普资讯http:wwwcqvipcom

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