高纯度低聚果糖生产技术的探讨

> 9且9年第三期 高纯度低聚果糖生产技术的探讨 The Investigation of the Technique to Produce High-purity Fmcto-oligosacchafide 生物反应轧 ：， 海．200237 ，『◇L 。 (生物反应器工程国家重点实验室上海- ) Kong De]i Zhang Xueqin (State Key Lab，of Bioreactor Engineering，shanghai 200237) l一苎 塑 ．．j Ab ～ *tract：F ⋯ rueto 一 - 新 oligos 礴 aec'ha~ 一 de — is a k 萄 ' nd o f phy siolog i— for special purpose must have higI．purity．The technique to 子作用、低热值、防龋齿等)、优 良的物化性质及良好的 低聚 G(NeosugarG)”和 “明治低聚 PfNeosugar P)”的低 苎 !! ! 生 = 低 聚果糖的生产主要涉及两种酶 ：果槠转移酶和具 有高果糖转移活性的畦喃果槠苷酶。进人 90年代以来， 国内外学者对低聚果糖 的生产 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 条件作 了大量的研 究工作，取得了可喜的进展。用单一的果糖转移酶或呋 喃果糖苷酶作用于蔗糖生产低聚果糖(单酶法)，即使在 最优条件下 ，由于副产物葡萄糖对呋哺果槠苷酶的抑制 作用，蔗糖不可能完全转化，所以产物中低聚果糖的含 量一般在 50％ ～6o％ ，还含有 30％左右的葡萄糖和 l0％左右的蔗糖。为了特殊的目的如供槠尿病患者食用 必颓使用高纯度的慨聚果糖挪明治低聚P。目前获得高 纯度低 聚果糖的方法有两种 ：一是用单 酶法制得含 50％ 一6o％低聚果糖的糖浆．然后用适当的方法去脒其 中的葡萄糖而得到高纯度的低聚果糖 ，可称为两步法； 一 是使用双酶法或混台酶系在蔗糖转化反应过程 中同 时消除葡萄糖的抑制作用使蔗糖充分转化，同时葡萄糖 转化为其他较易除去的形式 ，再经过简单的分离纯化得 到高纯度的低聚果糖 ，可称为一步法。其中两步法生产 高纯度低聚果糖的成本高，资料显示明治低聚 P的价格 是明治低聚 G的 2 8倍⋯。一步法还处于探索 中，但是 探索新的生产工艺、提高酶反应过程中蔗糖的转化率和 低聚果槠的含量生产高含量的低聚果糖在经济性上可 能是有益的。 本文结台作者的部分研究工作厦国内外学者 已经 进行的高纯度低聚果槠的生产技术研究情况对高 纯度 低聚果糖的可行生产工艺作一探讨。 1 低聚果糖的生物台成机制 J0ng Won YunI 综述了不同来源的呋喃果糖苷酶或 果槠转移酶催化蔗糖转化为低聚果糖的机制。不同来源 的酶的催化作用机制不同，概括起来大多数微生物果糖 转移酶的催化作用分两步进行 ：第一步形成酶 果槠复 台物 ，释出葡萄糖 ；第二步该复合物将果糖转移给水或 蔗糖生成果糖或三糖。低聚果糖的生物台成机制可 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示 如下 I： c—F+Enz≠I卜一Enz1+G ⋯⋯⋯ ⋯⋯⋯··(1) IF-Enz]+H20一 F+En2 ⋯ ⋯⋯ ⋯⋯ ⋯⋯⋯ (2) IF—Enz]+GF 一l_÷GFn+Enz ， ⋯⋯ ⋯⋯⋯ (3 J (13：2．3，4) 维普资讯 http://www.cqvip.com 其中 Enz：吱喃果槠苷酶或果糖转移酶；G—F：蔗糖； lF-EnzI：果糖 ．酶复合物 ：G：葡萄糖 ；F：果槠 ；GFn：低 聚 果糖 。 在低聚果糖的生物合成两步反应中．第一步为快速 可逆反应 ，第 二步为不可逆反应 ，蔗糖既是果糖基的供 体叉屉果糖基的受体。在反应 (1)中，蔗糖在酶的作用 下分解成果糖基的葡萄糖 ，该反应为必须步骤 ，故酶反 应产物中葡萄糖的存在是不可避免的；另外研究者发现 葡萄糖抑制酶的果糖转移活性 ，0 9％ 一5 4％ (v．．／v}的 葡萄糖 即抑制黑 曲霉 ACT]'20611哇喃果糖苷酶的果 糖转移反应 ，Ki=0 12mol／L[ ，所以蔗糖不能完全转 化。为了提高蔗糖 的转化率和产物中低聚果糖 的古量 就必须设法消陈副产物葡萄糖的抑制作用 ，这是一步法 高纯度低聚果糖生产技术的关键。在两步反应中可EI 看出 蔗糖(I1=2】浓度较低时将主要发生反应 (2}，总的 结果是蔗糖水解为葡萄糖和果糖．所EI为了提高酶反应 产物中低聚果糖的浓度就必须提高蔗糖浓度“抑制反 应 (2)的发生 。 2 酶谒(选择和产酶工艺条件优化 一 个好的酶源是生产低聚果糖的保证 ，对产酶发酵 上 艺条件进行优化是使酶源的产酶能力得到最大程度 的发挥，从而得到大量而廉价的呋喃果糖苷酶或果糖转 移酶。 2 l 酶源的选择 一 个好的酶源应具有以下几个特征 _【lJ高的果糖 转移活 眭_【2 J果糖转移活性与蔗糖水解活性之 比 (即 Ut／Uh)太 ；(3)区域专 性高，如图 1只生成 1．蔗果三 糖 lI．kestose ；(4)产酶能力大。 neok - HO Htc k — HO 图 1 酶的专一性示意图 许多植物 、酵母、霉菌等均能产生呋哺果糖苷酶或 果糖转 移酶．但植物产生的酶的活性低且产量受季节的 限制；而酵母转化酶水解活I生较强不利于低聚果糖的积 累，故 业生产中使用的产酶菌多为霉菌，如黑曲霉 ACYf 2061l【 、臭曲霉 NRRL 4337 0、日本 曲霉 ⅡT—KJl - I等 作 首等从上壤中分离出 株具有高果糖转移活性 的菌株黑曲霉 ECBT．3．测定条件下此酶活达 0．450U／ tug湿细胞 ．Ut／Uh过 l4 2．具有严格的区域专一性 只 生成 1．蔗果__I糖系产物： 1999年第三期 览 睦 2 2 产酶工艺条件优化 对产 酶工艺进行优化的目的在于使产酶苗的产酶 能力得到最大程度的发挥 ．影响酶产宰的因素主要有培 养时间 、碳源浓度 、氮源浓度和无机盐浓度等。 2 2．1 培养时间 黑曲霉 ECBT-3在摇床培养条件 下 ，间隔 24h取样测定发酵液 中细胞密度、胞内酶活等， 结果如图 2。最佳培养时间为72h，与黑曲霉 ACTT2061l 1 5及黑 曲霉 AS 0023t I相同。 2．2．2 碳源浓度 呋喃果糖苷酶是诱导酶 ，培养基中 初始蔗糖的浓度对酶产率有较大的影响；另一方面 ，蔗 糖浓度过高会抑制苗体的生长 ，图3显示蔗糖浓度对酶 产率的影响。蔗糖最佳浓度为 15％ ～20％。蔗糖浓度太 高、渗透压太大不利于苗体生长。Wen Changehen报道 了相似的结果 I。 2 2 3 无机盐 作者发现 添加 HP 及 MgSO．- 7FI O对黑 曲霉 EC盯 一3的 酶产率 无 明显影 响 ，与 S 1-[ayashi等的结果不同。。 。孺加适量硝酸钠可 明显 提高酶产牢。 三 乜 挂 翟 1 日 搓 再 鋈_ 誊 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 蔗糖浓 度 (％ ，w／v) 图3 蔗糖浓度对酶产率 影响 3 两步法生产高纯度低聚果糖 3 l 低聚果糖的生成 在 50％ 60％的蔗糖溶液中加^ 2～5U／g蔗糖的 呋喃果糖苷酶或果糖转移酶，用缓冲溶液调节 pFI5 0— 6 0，保温 50 60℃．反应 20～24h即制得含 50％ ～ 60％的低聚果糖 ，为了重复利用酶 般采用固定化酶 (IEl或固定化细胞(IC){或苗丝体(IM))，而让高浓度的 蔗糖溶液以一定流速流过固定化酶柱或填充床式反应 器，表 2显示近年来开发的低聚果糖生产工艺。 3 2 两步法生产高纯度低聚 果糖 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 2 近年来哥发的低聚果糖兰_立工艺 如表 2所示 ，由于副产物葡萄糖的抑制作用 ，产物 中低 聚果糖的含量仅为 50—60％。要提高低聚果糖的 含量，可以对上述 50％ 一60％的低聚果糖进行分离纯 化去除其中的单糖(葡萄糖和果糖 )，方法是用碳柱层析 或碳拄层析和制备性 HPLC串 ，可得到 95％的低聚 果糖。但几种使用市售离子交换树脂柱层析分离过程 的回收率都很低而不适于大生产 。。 另一种两步法生产高纯度低聚果糖的工艺是用葡 萄糖氧化酶 (GOD)(或葡萄糖 氧化酶和过氧化氢酶 fCAT)协同作用)将单酶法制得的低聚果糖糖浆中的葡 萄糖转化为葡萄糖酸，然后用离子交换洼将葡萄糖酸分 离除去 ，可得 87％左右的低聚果糖。该法的工艺过程 是 ：由单酶洼得到的5O％ 一60％低聚果糖沸水捂 酶 5min，调节总糖浓度至 20％ (w／v)，加人 GOD．GOD用 量为 50U／g总糖 ，水措保持温度 35 ，反应过程中连 续搅拌，通气，并滴加 Jmol／LhaOH溶液中和释放出的 葡萄糖酸 使 pH保持 5 0左右，反应 2011后，加热灭酶 活 。或调节 总糖浓度为 30％ 1w／v)，按 50U／g总糖和 725U／g总糖的比例加人 GOD和 CAT 水浴保温 30 ， 搅拌并通气 ，滴加 NaOH控制 pH5 0．定时取样用 HPLC 分析反应体系中的总低聚果糖 、葡萄糖和蔗糖的变化 。 反应过程 中低聚果糖的含量不断上升 ，葡萄糖的浓 度不断下降 ，而蔗糖的浓度基本不变 ，反应至 16h葡萄 糖的浓度降至 0．表 3显示单酶法、GOD、GOD+CAT去 陈葡萄糖后产品中成分的比较 。 表 3 单酶法、GOD、GOD十CAT 隙击葡萄糖后的威分比较 【％ ，w／v 方 击 C GF C G c G 单酶浩 31 40 】】96 27．79 24 47 4 38 56．64 COD 26 11 l2 63 30．02 25 56 5 68 6】26 GOD+CAT采检 出 】3．08 42 43 37 52 6 97 86 92 GOD和 CAT 同作用去除葡萄糖后．产品中 泺 聚果糖的古量比单酶法提高了 53 5％ ，但谖诖尚洋在 不少问题 ，如 GOD和CAT的最佳用量 、最适 DH、最造厦 应温度等有待研究，特别是 GOD和 CAT的用量直接 )乏 系到该过程的经济性。另一方 面最终产物 中蔗糖的浓 度并投有降低，原因是第 步单酶法生产l抵聚果糖的过 程中产生 的葡萄糖抑制 了果糖转移酶使蔗糖币能进 一 步转化 ，但该法的优点是两步均可在最优条件 F操作 4 一步法生产高纯度低聚果糖 该法叉可以称为双酶法或混台酶系法 ．指在反应悼 系中同时加人果糖转移酶 (FTase J f或呋哺果塘苷酶 (FFase1I和另一种或两种能把葡萄糖转化为其它形式的 酶使其协同作用，部分或全部消去葡萄糖的抑制作州 ． 而提高蔗糖的转化率得到高纯度的低聚果糖 =转化葡萄 糖的酶一般是葡萄糖氧化酶和葡萄糖异掏酶 (Gl】．表4 显示 ～步法生产高纯度低聚果糖的研究现状。 4 J FFaseI或 FTase)和 GOD协同作用 由表 4可知 ，FFase(或 F[ase)和 GOD协同作 艽 其 FFase同 GOD协同作用是生产高纯 度低聚果糖的有 表 4 一步法生产高纯度低聚果糖的研究现状 ·对晖 表示去植出 维普资讯 http://www.cqvip.com 效途径。产物中低聚果糖的含量达 90％左右，最高选 98 32％。其过程如下：在 0．7L通气搅拌反应器中加^ 浓度400g／L的蔗糖溶液，再以 lOU／g蔗糖和 l5／E蔗 糖的用量加人 FFase和 GOD，最适反应条件 ：pH：5 5、 温度40℃、搅拌转速 55Of／rain、通气 lvvm，反应过程中 滴加氨水控制 pH5．5，反应 25h后蔗糖和葡萄糖基本上 设转化 。研究结果表明将来无须冒很大风险用这种 协同酶系进行大规模 的工业化生产是很有可能的。它 有效地去除了葡萄糖对 FFase的抑制作用 。 GOD的用量、反应温度 、蔗糖浓度、搅拌转速都显 著影响反应产物中低聚果糖的含量 ，从而对该过程的 经济性产生影响 研究结果显示 FOS的含量 随 GOD用 量的增加而增加，其合适用量应视反应速率和 GOD的 成本而定。果糖转移酶和 GOD的最适温度不同，由于温 度高干 40℃时 GOD迅速失活 、而且氧气 的溶解度下 降，所 以最适温度的选择必须考虑 FTase与 GOD的此 例、GO D的活力 、蔗糖浓度、供氧速率等因素。单酶体系 下蔗糖浓度升高，FOS的含量升高，但在混合酶系下蔗 糖浓度过高使传氧速率下降，GOD的活力不能充分发 挥，故 FOS的含量会下降。搅拌速 率增大，传氧速率增 大，FOS的含量增加。 该过程的优点是效率高 ，产物去除葡萄糖酸后 FOS 的含量可达 98％。其缺点是：FFase的活力不能充分发 挥 (40℃时，其活力仅为其最大活力的60％ 】；反应过 程中产生葡萄糖酸 ，需要加碱或 CaC03控制 pH；产物的 纯化涉及到酶蛋 白的分离 ；酶不能回收重复利用 江波 等 删 尝试了黑曲霉菌体和葡萄糖氧化酶 GOD共包埋 生产高含量低聚果糖 ，结果如表 4。结果虽不及液相酶 系，但其酶 回收方便。 4．2 固定化黑曲霉增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶 GI协同作用 该法的工艺流程如下： 斜面袍子一海藻醢钠混夸_÷氯化钙 中目定_+固定化 增殖细胞_+耳定化葡萄糖异构酶_+填充式反应拄_+ 50％ ～60％蔗 糖溶 液 活性碳脱 色_+高子交换树脂拄脱盐_+高纯度低聚果糖 将海藻酸钙包埋的黑曲霉孢子培养得固定化增殖 细胞 ，将固定化增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶 GI混 合装人柱 中，50％ ～60％的蔗糖溶液在50～60℃通人 ， 利用酶转移反应生产低聚果糖 ，Gl将反应中产生的葡 萄糖转化为果糖。而后经脱色、离子交换脱盐和浓缩等 工艺 。不经特殊精制低聚果糖的含量达 75％ ：在上述条 件'F，固定化酶连续 ．间歇操作 35dI8h／d)．活性保持 不变。该法的缺点是两种催化剂的最佳反应条件不同 ． 两种固定 化催化剂在操作过程中会囡 比重不同『flj造成 1999年第三期 童 孟 ik 轻者上浮。 5 展 望 对产酶发酵工艺进行优化保证高活性果糖转移酶 的充足供应，无论是对普通低聚果糖 (50％ 一60％ )的生 产还是对高纯度低聚果糖的生产均很重要。用两步法 生产高纯度低聚果糖由于回收率太低及原料 的浪费故 在经济性上是不可取的。由葡萄糖氧化酶和呋喃果糖 苷酶协同作用一步法生产高纯度低聚果糖 ，副产物葡萄 酸可 以方便地用离子交换树脂除去 ，低聚果糖可达相 当 高的纯度。为了重复利用酶，发展呋喃果糖苷酶 (或菌 体)和葡萄糖氧化酶 的共固定化技术具有很好的前景。 另外 ，将固定化呋喃果糖苷酶和固定化葡萄糖氧化酶分 别装柱交替反应。由于两种酶均可在最优条件下操作 ． 可能会收到良好的效果。 参考文献： 1 胨瑞娟 ．新型低聚糖的舟绍 ．食品与发酵工业， 1993(2)：82～90 2 Jong Won Yun．Enzyme and Microbial Technology 】996．】9：107～117 3 许喜肄，林度生，赖风英 ．食品工业科技 ，1997(4)： 34 —37 4 Nishizama Koji．Nakajima Mitsutoshi．明治制果研究 年报 (日文 )，1993，32，52—57 5 Hidemasa HMaka．Ma8a0 Himyama．Naomi Sumi A c Bio1．Chem．，1998，52 c5)：1 181—1815 6 Y．D Hang，E E．Woodaras，K J．Jang．B o echnolo~, Letters．1995+17 c3)：295～298 7 Kow—Jen Duan，Dey-ehyi shen，Jen—shin Chen，Biosci Biotech．Bioehem．．1993，57(11)：1811～I8】5 8 彭志莫，曹劲松，王若峰，赵谋明．华南理工大学学 报l自然科 学版】，1996，24{10】：128～133 9 Weng Chang Chan Bioteehnology Letters，1996，18 (1)：69～72 10 Kyung Hoon Jung．Lai Yun Lim，Seung Jong Yoo．Jae Heung Le e．M∞ Yotmg Yoo Biotechnology Letters． 1987，9(10)：703～708 11 江波，王璋 无拐轻工大学学报 ，1996，15(1】： l2～ l8 12 Jong Won Yun，Sun 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h后 通八 丁二烯 ．并 继续 电解 一 段时问后移出电解槽。减压蒸馏回收未反应的醋酸后 ， 再加入 乙醚和水进行萃取，移去水层，用无水硫酸镁干 燥油层 ，油层经蒸馏回收乙醚后，可得山梨酸的前体乙 酰氡基 己烯酸 (茼称 AA)。再将其和浓盐酸加热至 9o 回流 5h，水解生成 山梨酸。把混合物除去黑色油状物 后．抽滤、干燥可得黄色或白色针状结晶 ．经色质联检 ． 确认产 品 为山梨酸 。 l 3 工艺流程图 一 陪击 黑色 曲 状 精 反 、反 已二 持 酸 (山粟醢 ) 4 产品检测 产品经中国科学院广州化学测试所进行色质联检 】990．24／25：299～3o8 5 Chung—Jen Chiang，Liang-Tzung Hislau．Wen—Chien 19 【 Bitechnolo~,Techniques,[997，l】(2)：121～125 6 Chung-Jon Chiang，Won—Chien Lee Bioteehnolog3' 20 Progress，j997，(13)：577～582 7 Rubens Cruz，Vinicius，D Cruz，Maroia Z．Belini．Ju— liana G．Belole．Clandia R Viera Bioresource Teeh一 2I nology、I998．(65)：l39～I43 8 Lamia L’Hocine．江波，王璋 食品科学，1997，l 8 22 ★率项目为广基省自然鞴堂基金诗 礞巨 (91：24～27 Jong wI]n Yun．Seung Koo Song．Bioteehnolo~'let— ters．1993．15(6)：573～576 ung Hoon Jung．Jeong]{wan Kim，Yeong Joong Jeon．Jae Heung Lee．Biotechnolog3／Le tters．[993．15 J】)65—70 Yung J．W．，Lee M G．，So ng S K．，J．Ferment Bioeng，l994，77(2) I59～163 江谴，王璋 ，丁霄霖 ．食品与发醇工业，1996，lI) l～7 ～ 一 醚 一 一 一 一 堇 Ⅵ 一 _冀 0● 卜 维普资讯 http://www.cqvip.com