双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 ISSN 100727626 中国生物化学与分子生物学报 2005 年 10 月 CN 23870? 11 Q Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 21 5 :691,694技术与方 法?? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 1 2 2 3 2 2 3 3 翁 瑜 曾群力 姜 槐 许正平 1 浙江大学生命科学学院 2 浙江大学医学院 浙江省生 物电磁学重点研究实验室 3 浙江大学医学院环境基因组学研究中心 杭州 310031 摘要 组织 或细胞 的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳 22DE 的分辨率 . 为探索建 立适用于人乳腺癌细胞株 MCF27 蛋白质提取的最佳 条件 比较目前在双向凝胶电泳中常用的 3 种 蛋白质提取方法对 MCF27 细胞总 蛋白的提取效率 . MCF27 细胞经培养后 分别采用 M2PER 试剂 、 标 准裂解液 或含硫脲裂解液提取其总蛋白质 然后进行双向凝胶电泳 并根据凝胶上蛋白质斑点 的丰 度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量 以确定 MCF27 细胞蛋白质提 取的相对最佳方法 . 结 果显示 M2PER 试剂法得到的图谱分辨率较低 蛋白质主 要集中分布在分子量 15,70 kD pH 417, 613 的范围内 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 裂解液法得到的图 谱分辨率有所提高 蛋白质分布比 M2PER 试剂法得到的图谱 广 硫脲裂解液法 得到的图谱是三者中分辨率最高的 尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果 比 前两者好 . 结果表明 在 3 种常用的蛋白质提取方法中 硫脲裂解液对细胞蛋白质 的溶解性最佳 相对更适合于提取 MCF27 细胞的蛋白质 并与双向凝胶电泳条件 更兼容 . 关键词 蛋白质提取 双向凝胶电泳 MCF27 条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Two2 Dimensional Electrophoresis 2 3 3 ZENG Qun2Li J IANG Huai XU Zheng2Ping 1 2 2 3 2 WENG Yu 1 College of Life Sciences 2 Bioelectromagnetics Laboratory 3 Research Center for Environmental Genomics Zhejiang University School of Medicine Hangzhou 310031 China Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2resolution protein separation in two dimensional electrophoresis 22DE . Three routine cellular total protein extraction methods were compared 2 in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF 7. The cultured MCF27 cells were lysed by M2PER kit standard lysis buffer or improved lysis buffer respectively. Then the extracted total proteins were subjected to 22DE and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel . Data showed that use of M2PER kit gave the lowest resolution in which most proteins were distributed in the p I ranging from 417 to 613 with molecular weight between 15 kD and 70 kD. Standard lysis buffer improved protein resolution with broader protein distribution pattern. Improved lysis buffer generated the best resolution among these three methods especially for the high2abundance and high molecular weight proteins. Based on above results we concluded that the improved lysis buffer has the best protein solubilization ability which renders it much more suitable for cellular protein extraction from MCF27 and is more compatible with the conditions of 22DE. Key words protein extraction two dimensional electrophoresis MCF27 optimization收稿日期 : 2004212203 接收日期 :2005203221国家自然科学 基金项目 No. 50137030 30170792 浙江省自然科学基金项目 No. 301524 和浙江 省卫生厅重点项目 No. 2004ZD006 资助3 联系人 :0571287217386 Fax : 0571287217410 E2mail : zpxu zju. edu. cn TelReceived : December 3 2004 Accepted : March 21 2005Supported by National Natural Science Foundation of China No. 50137030 30170792 and Natural Science Foundation of Zhejiang Province No. 301524 andKey Program of Health Bureau of Zhejiang Province No. 2004ZD0063 Corresponding author Tel : 0571287217386 Fax : 0571287217410 E2mail : zpxu zju. edu. cn 692 中国生物化学与分子生物学报 21 卷 双向凝胶电泳 two2dimensional electrophoresis 22 细胞 培 养 箱 是 Forma 公 司 产 品 分 光 光 度 计DE 是蛋白质组学研究中分离蛋白质的主要技术之 双向电泳设备 SmartSpecTM 3000 spectrophotometer 、 1 一 其原理是根据蛋白质等电点的不同在 pH 梯 一向是 PROTEAN IEF cell 二向是 PROTEAN Plus度胶内进行第一向等电聚焦分离 然后根据蛋白质 Dodeca Cell 和 GS2800 扫描仪是 Bio2Rad 公司的产的相对分子量大小利用聚丙烯酰胺凝胶进行第二向 品 超声波细胞粉碎仪购自宁波新芝科器研究所 低分离 经染色后得到二维的蛋白质分布图谱 . 双向凝 温高速离心机和混合器由 Eppendorf 公司生产 .胶电泳高分辨率分离蛋白质的关键是组织或细胞样 112 细胞培养 品的制备 即蛋白质的提取 . 蛋白质提取一般使用含 MCF27 细胞接种于含 10 胎牛血清的 DMEM 表面活性剂和还原剂等成分的裂解液 . 其变性剂 、 新鲜培养基中 37 ?常规培养于含 5 湿润 CO2 的中 变性剂如尿素使蛋白质变性并使蛋白质水解酶 细胞培养箱里 . 待单细胞层近汇合时 胰酶消化 并失活 表面活性剂如 CHAPS 促进蛋白质溶解 还原 4 2 以 3 × 细胞? 的密度接种于直径为 100 mm 的 10 cm剂如 DTT 使蛋白质内的二硫键处于还原状态 有利 3 个细胞培养皿 ORANGE USA 中 . 24 h 换液后 继于蛋白质的溶解 . 然而 目前的蛋白质样品制备方法 续培养 24 h 提取蛋白质 此时每皿细胞数为 1 × 10 7存在着一些缺陷 : ?获得的样品中往往含有干扰物 个 .质 如盐离子 、 、 核酸 脂类和多糖等 从而引起蛋白质 113 蛋白质提取电泳行为的变化 其后果是不仅在一向电泳中干扰 M2PER 试剂法 : 弃去皿中的旧培养基 用预冷蛋白质的等电聚焦 而且会影响二向中蛋白质的迁 的 PBS 洗细胞 2 次 加入 M2PER 试剂 500 μ 每 10 7 l 2 移 . ? 由于蛋白质溶解性的不同 约占细胞蛋白总 细胞 在冰上静置裂解 5 min 后 迅速用刮棒刮下量 30 的膜蛋白在常用裂解液中很难溶解 导致二 细胞 并收集到 115 ml 离心管中 . 4 ?、 000 g 离心 12 3 常用裂 8 min 后 取上清储存于 - 向图谱上出现的主要是可溶性蛋白质 . ? 70 ? 备用 .解液抽提方法步骤多 、耗时长 容易引起蛋白质丢失 标准裂解法 : 离心收集胰酶消化的细胞后 用预和降解 . 因此 为适应不同组织或细胞的特殊理化性 7 冷的 PBS 洗细胞 2 次 然后每 1 × 细胞加 1 ml 裂 10质 需要针对不同来源的样品进行蛋白质提取条件 解液 8 mol? 尿素 4 CHAPS 现加 65 mmol? DTT L L的优化 以获得足够量 、高纯度的蛋白质样品用于后 和 012 W? Bio2Lyte pH 3,10 放于冰上静置 V续实验 . 裂解 30 min 再超声 180,200 W 每次工作 10 s 间 本实验以人乳腺癌细胞株 MCF27 为对象 比较 隔 10 s 共 20 次 最后以 4 ?20 000 r? 离心 1 h min了 3 种不同的蛋白质提取方法包括 Pierce 公司的哺 取上清储存于 - 70 ? 备用 .乳动物蛋白抽提试剂 M2PER 、标准裂解液和添加硫 硫脲裂解法 : 离心收集到的细胞经预冷的 PBS脲的裂解液对 22DE 结果的影响 了解不同裂解液的 7 洗 2 次后 在 1 ×10 个细胞中加含硫脲裂解液 7提取效率以及它们与双向凝胶电泳条件的兼容性 mol? 尿素 2 mol? 硫脲 4 CHAPS 现加 65 mmol? L L从而 建 立 了 MCF27 细 胞 总 蛋 白 的 相 对 最 佳 提 取 L DTT 和 012 W? Bio2Lyte pH 3 , 10 约 1 ml . V方 法 . 后续步骤同标准裂解法 . 114 蛋白质定量1 材料与方法 参考文献 4 采用 Bradford 法定量 以牛血清白111 材料 蛋白为标准蛋白 . 人乳 腺 癌 细 胞 株 MCF27 购 自 ATCC 公 司 115 双向凝胶电泳Number : HTB222 取含 250 μ 蛋白质的上述蛋白质提取液 用上 g 胎牛 血 清 和 改 良 型 Eagle 培 养 基 Dulbeccoπs 样水 化 缓 冲 液 7 mol? 尿 素 2 mol? 硫 脲 4 L Lmodified Eagleπs medium DMEM 购自 Hyclone 公司 CHAPS 65 mmol? DTT 012 W? Bio2Lyte pH 3, L V胰酶为 Invitrogen 公司固相 pH 梯度胶条 、 二硫 10 01001 溴酚蓝 补充体积到 300 μ 后 将 17 cm 、 l CHAPS 、苏糖醇 dithiothreitol DTT 、 丙烯酰胺 、 甲叉 pH 4,7 的固相 pH 梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶双丙烯酰胺和尿素等购自 Bio2Rad 公司 M2PER 试 液上方 被动水化 12 h 然后进行等电聚焦 17 ?剂为 Pierce 公司产品 硫脲购自 Sigma 公司 牛血清 250 V 30 min 1000 V 3 h 10 000 V 5 h 10 000 V 白蛋白为生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司产品 . 60 000 Vh . 聚焦结束后 分别用含 2 DTT 和 215 第5期 翁 瑜等 : 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 693 碘乙 酰 胺 的 胶 条 平 衡 缓 冲 液 6 mol? 尿 素 2 L 后两种方法好 .SDS 01375 mol? Tris2Cl pH 818 20 甘油 平衡胶条 L 212 双向凝胶电泳所检测蛋白质的数量各 15 min. DTT 是为了还原蛋白质的二硫键 而碘乙 利用 PDQuest 软件自动统计 22DE 图谱上的蛋酰胺是为了去除多余的 DTT. 平衡完毕后 将胶条紧 白质斑点数量 . 蛋白质斑点选定标准是 : 斑点个体独贴在 12 的聚丙烯酰胺凝荷戏? 进行第二向电泳 立 形态明显 3 次实验重复出现 . 结果显示 :M2PER 恒压 200 V 615 , 7 h . 电泳结束后采用改进的银 试剂法胶上蛋白点平均有 1350 ? 个 标准裂解法 12染方法对凝胶进行染色 然后用 Bio2Rad 的 GS2800 4 胶上蛋白点平均为 1326 ? 个 硫脲裂解法胶上的 10扫描仪扫描图像 所获图象用 PDQuest 711 分析软件 蛋白点平均为 1368 ? 个 . 以上结果说明 3 种提取 9进行分析 . 实验重复 3 次 . 方法对蛋白质的检出数量影响不大 . 213 双向凝胶电泳图谱上蛋白质的分布2 结果 Fig11A 显示 M2PER 试剂法得到的双向电泳图211 蛋白质定量 谱横纹多而明显 高丰度的蛋白点区域分辨率偏低 M2PER 试 剂 法 提 取 的 总 蛋 白 浓 度 为 41018 椭圆 1 区域 高分子量蛋白点 方框 2 区域 分离mg? 体积为 015 ml 总蛋白量为 21009 mg 标准裂 ml 效果较差 独立蛋白点少 . 但在分子量为 15,70 kD 、解法提取的总蛋白浓度为 31762 mg? 体积为 1 ml pH417,613 的范围内 方框 3 所示 M2PER 试剂法ml 总蛋白量为 31762 mg 硫脲裂解法提取的总蛋白 提呈的蛋白点多而集中 并存在很多只在本法中清浓度是 315 mg? 体积为 1 ml 总蛋白量为 315 mg. ml 楚显现的点 如箭头所指的椭圆区域 4 、 和 6 说明 5从以上结果可以看出 Pierce 试剂提取的蛋白量与 该法适于提取偏酸性的 70 kD 以下蛋白质 .两种裂解液相比有较大差距 蛋白质提取效率没有 标准裂解法的图谱 Fig11B 横纹较少 高丰度 Fig. 1 Silver stained gel of two dimensional electrophoresis The proteins were separated in the pI range between 417 and 619 and molecular weight between 15 kD and 130 kD A Proteins were extracted by using Pierce M2PER kit B Proteins were extracted by using standard lysis buffer C Proteins were extracted by using improved lysis buffer蛋白点区域的分辨率比 M2PER 试剂法有所提高 蛋 分子量为 15,70 kD 、 417 , 613 的区域中蛋白点 pH白点个体独 立 形态清楚 同时蛋白质分布更广 . 在 比 M2PER 法少 .高分子量区域 gt 70 kD 蛋白点分离效果明显增 硫脲裂解法的图谱 Fig11C 与标准裂解法分布强 显 现了一些新蛋白点 如箭头所指区域 7 但在 .