褐藻糖胶对60Coγ射线辐射防护作用的研究

褐藻糖胶对60Coγ射线辐射防护作用的研究 褐藻糖胶对60Coγ射线辐射防护作用的研究 目 录 目 录3 中英文缩略词 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 摘要7 中文摘要 8 ABSTRACT12 前 言. 13 1 立 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 背景. 13 2 褐藻糖胶的活性研究现状 14 3 本课题研究的目的及意义 16 4 本实验主要研究内容 16 第一部分 褐藻糖胶的提取及多糖、硫酸根的含量检测. 18 1 材料和仪器18 1.1 实验材料18 1.2 实验仪器19 2 试验方法. 19 2.1 褐藻糖胶的提取19 2.2 褐藻糖胶纯化品中总糖含量的测定. 20 2.3 褐藻糖胶纯化品中硫酸根含量的测定22 3. 实验结果. 23 3.1 褐藻糖胶的提取结果23 3.2 褐藻糖胶纯化品中总糖含量的测定结果 23 3.3 褐藻糖胶纯化品中硫酸根含量的测定结果. 24 4. 讨 论 26 60 第二部分 褐藻糖胶对 Co- γ 射线照射引起的人外周血淋巴细胞微核 率的影响27 1 材料和仪器 28 1.1 试剂 28 1.2 仪器 29 1.3 血样 29 2 试验方法. 29 2.1 褐藻糖胶的制备29 2.2 细胞培养29 2.3 给药方法29 2.4 照射方法29 2.5 微核试验30 3 实验结果30 60 3.1 Co- γ射线对淋巴细胞微核率及微核细胞率的影响30 3.2 照射前加入褐藻糖胶对淋巴细胞微核率及微核细胞率的 影响30 3.3 照射后加入褐藻糖胶对淋巴细胞微核率及微核细胞率的 影响30 4 讨论 32 60 第三部分 褐藻糖胶对 Co- γ射线照射小鼠造血系统的防护作用33 1 材料和仪器33 1.1 试剂 33 1.2 仪器 33 1.3 动物 33 2 试验方法. 34 2.1 褐藻糖胶的制备34 2.2 模型建立34 2.3 实验分组34 2.4 脾、脾指数、脾组织结构及脾集落生成单位CFU-S的测 定. 34 2.5 骨髓有核细胞计数 34 2.6 外周血细胞计数35 2.7 数据分析和统计学分析35 3 实验结果. 35 3.1 照前 ip 褐藻糖胶对脾指数、脾组织结构及内源性脾结节 生成的影响35 3.2 照前 ip 褐藻糖胶对小鼠骨髓有核细胞数的影响 37 3.3 照前 ip 褐藻糖胶对小鼠外周血细胞的影响. 37 4 讨论 39 结 论. 40 参考文献43 文献综述43 致 谢. 57 附 录. 57 中英文缩略词表摘要 缩写词 全称 中文全称 FUCOINAN Fucoidan 褐藻糖胶 MN Micronucleus 微核 CFU-S Colony Formation Units of Spleen 脾结节克隆集落形成率 SOD Superoxide Dismutase 超氧化物歧化酶 SHC Hematopoietic stem cell 造血干细胞 WBC White Blood Cells 白细胞 RBC Red blood cell 红细胞 PLT Platelet 血小板 HGB Hemoglobin 血红蛋白 RPMI-1640 Culture medium 1640培养液 RT Radiotherapy 放射治疗 Gy Grey 戈瑞 RPM Revolutions per minute 每分钟转数 μl Microliter 微升 ml Milliliter 毫升 g Gram 克 D Day 天 Min Minute 分钟 SD Standard Deviation 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差 1 60 褐藻糖胶对 Co- γ 射线辐射防护作用的研究 研究生:陈 乾 导 师:吴久鸿 教授 中文摘要 目的 随着我国载人飞船的发射成功,以及太空行走和空间站的建立,航天员接 触放射线机会日益增多,遭受辐射损伤的可能性也随之增加。提高航天员对空间 特殊环境的适应能力和耐受能力,有效保障航天员健康是确保航天任务圆满完成 的重要前提,提高航天员的抗辐射能力是其中重要研究课题之一。天然辐射和人 为辐射等放射线辐射越来越多的影响着人们的身心健康。因此,研究开发辐 [1] 射防护药物和保健食品,对于国防和民用都具有不可忽略的意义 。褐藻糖胶, 又称为褐藻多糖硫酸酯Fucoidan、岩藻聚糖,是存在于所有褐藻中的细胞间多糖。 它是一种水溶性杂多糖,除了主要成分 L-岩藻糖和硫酸根外,还含有半乳糖、木 糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质等,其结构为由酯化多糖和硫酸基构成的 单元化合物形成的聚合物。本实验所用褐藻糖胶由日高昆布(Laminaria japonica Aresch)中提取。褐藻糖胶具有多种生物活性,前期的研究发现其具有抗凝血、抗 [2-6] 肿瘤、抗病毒、治疗慢性肾衰等活性 。但是,目前对于其在辐射防护方面的系 统性研究还比较少。课题首先从日高昆布中提取褐藻糖胶,并对褐藻糖胶的多 60 糖含量以及硫酸根含量进行测定;其次观察褐藻糖胶对 Co- γ 射线照射人外周 血淋巴细胞微核率和小鼠造血系统的影响,来研究褐藻糖胶的辐射防护作用。 方法 采用酸提醇沉法从日高昆布中提取褐藻糖胶,并用苯酚-硫酸比色法、硫 酸钡比浊法测定其多糖、硫酸根含量。体外人外周血淋巴细胞微核实验考察褐藻 糖胶对辐射的防护作用:抽取 4 名从未接触过有害化学物质的健康男性志愿者 的静脉血,按常规微量血培养方法体外培养外周血淋巴细胞以及微核细胞; 实验分为对照组、照射组以及加药组,观察 3 组淋巴细胞的微核变化。体内2 小鼠造血系统防护试验:以 BALB/c 小鼠进行体内照射研究,一次性全身照 射前腹腔注射给药褐藻糖胶 3d,测定脾指数、脾脏内部结构以及内源性脾结 节数(7.5Gy)、骨髓有核细胞计数6.0 Gy、外周血象5.5 Gy。 结果 所提取的褐藻糖胶中多糖含量为(42.63?0.78)%,RSD2.41%,硫酸根的 含量为20.52?0.57%,RSD2.78%。体外培养人外周血淋巴细胞的微核试验显示 60 2Gy Co- γ 照射剂量下,照射前 1h、照射后 1h 加入 20、40 μg/ml 褐藻糖胶对 淋巴细胞的微核率无显著性差异,加入 80、160、320 μg/ml 褐藻糖胶均可显 60 著降低淋巴细胞的微核率。小鼠体内造血系统实验显示 7.5Gy Co- γ 照射后各 给药组照射组的脾指数及内源性脾结节数明显较对照组增多,100mg 给药照 射组的脾脏大小以及脾脏内部组织结构均比对照组有显著的差别; 60 6.0Gy Co- γ 辐射后,各给药组照射组小鼠骨髓有核细胞数与对照组比较,均 60 明显高于对照组; 5.5Gy Co- γ照射后 30d小鼠外周血象测定中给药照射组 WBC 明显高于对照组。 60 60 结论 褐藻糖胶能明显抑制 Co- γ 射线诱发的淋巴细胞微核产生。 Co- γ 射线照 射前腹腔注射褐藻糖胶,能够有效抑制 γ 射线辐射对小鼠的脾损伤,表现在可以 逆转照射引起的脾脏指数下降,骨髓有核细胞数、造血干细胞、外周血 WBC数量 60 的减少。褐藻糖胶对 Co- γ射线辐射引起的人外周血淋巴细胞微核率以及小鼠造 血系统有显著的防护作用,且该作用与给药剂量有关。 60 关键词 褐藻糖胶;硫酸钡比浊法;苯酚-硫酸比色法; Co- γ 射线;淋巴细 胞; 造血系统 360 Study on Co- γ Radioprotection by Fucoidan ABSTRACT Objective After the launch of China’s manned spacecraft, spacewalk and space station, the issues of contacting the radiation have attracted more attention than ever before. Boosting the astronaut’s tolerance and protecting their health from the natural and artificial radiation is the key to the success of aviation task, which have fueled high [1] demands for the radiation protection drug and health food productsFucoidan, also known as fucose glycans, is a polysaccharide present in all brown algae. In addition to the main component L-fucose and sulfate, it also contains galactose, xylose, mannose, glucose, uronic acid and protein. As a water-soluble polysaccharide, it is a polymer formatted with esterified polysaccharide and sulfuric acid-based compounds. Fucoidan has a broad spectrum of biological activities, such as anti-clotting, anti-tumor, anti-virus, [2-6] and chronic renal failure therapyThe systemic research of Fucoidan on radiation protection has not been documented. In this study, for the first time, we extracted the Fucoidan from Laminaria japonica Aresch and measured the content of polysaccharide and sulfate, then observed the micronuleus rate of human peripheral blood 60 lymphocytesPBLs and effects on hematopoiesis in mice caused by Co- γ radiationThe results were presented in this thesis Methods We extracted fucoidan from Laminaria japonica Aresch by extraction with Acid and precipitation with alcohol method, and determine the content of sulfate and total polysaccharides by phenol-vitriolic colorimetry and barium sulfate turbidity. Then we studied the radioprotective activity of fucoidan through observation of the micronuleus rate of human peripheral blood lymphocytes PBLs in vitro. The venous blood used in this study was drawn from 4 healthy male volunteers who have never been exposed to harmful chemicals. PBLs were cultured in vitro by the routine small 4 volumes blood culture method. The cultures were divided into three groups: control group, irradiated group and treatment group. The changes of the lymphocytic micronucleus rate were observed in three groups. BABL/C mice was irradiated after intraperitoneal injection of fucoidan for 3 consecutive days. Spleen index 7.5Gy, the number of colony forming units-spleen 7.5Gy, peripheral hemogram 5.5Gy and nucleated cell count in bone marrow 5.5Gy were observed Results 20.52?0.57%Polysaccharide content and sulfate content of FPS was 60 42.63?0.78% and 20.52?0.57%, respectively.1h before or after 2Gy Co- γ irradiation treated with fucoidan at the doses of 80, 160, 320 μg/ml all markedly reduced the lymphocytic micronucleus rate. Mouse hematopoietic system in vivo experiments showed that for the treatment group, spleen index and the number of colony forming units-spleen of all treatment groups significantly increased compared to control group 60 after 7.5Gy Co- γradiation. Treated with 100mg fucoidan, the spleen size and structure of radiation group were significant differences from that of control group. After 6.0Gy 60 Co- γradiation, nucleated cell count in bone marrow of each treatment group was significantly higher than that of control group. 30 days after 5.5Gyradiation, fucoidan significantly increased WBC of irradiated mice compared with the control group Conclusion Fucoidan can significantly inhibit the generation of lymphocyte 60 micronuclei and micronucleated cells induced by Co- γray. Intraperitoneal injection with fucoidan before irradiation can effectively inhibit the injury to mice induced by 60 Co- γ ray, such as injury of spleen, decline of spleen index as well as reduction of the nucleated cell count in bone marrow, hematopoietic stem cells and peripheral WBCStudies showed that Fucoidan had a significant and dose-related protective effect on 60 Co- γ ray-induced human peripheral blood lymphocyte micronucleus and mice hemopoietic system 5 60 Key words Fucoidan/Barium sulfate turbidity/Phenol-vitriolic colorimetry/ Co- γ ray/ Lymphocyte/Hemopoietic system 6 60 褐藻糖胶对 Co- γ 射线辐射防护作用的研究 1 前 言 1.1 立题背景 随着我国载人飞船的发射成功,以及太空行走和空间站的建立,人们与放射 线接触的机会日益增多,遭受辐射损伤的可能性也随之增加。提高航天员对空间 特殊环境的适应能力和耐受能力,有效保障航天员健康是确保航空任务圆满完成 的重要前提,其中提高航天员的抗辐射能力是重要课题之一。前苏联切尔诺贝利 核电站核泄漏事故以及一年前日本地震海啸而引发的福岛核电站放射性物质泄露 事件,均对生物和环境在许多情况下造成了十分严重的辐射危害,也无形中促使 着人们加大了对辐射危害防护损伤的研究。由于许多场合不能单靠物理防护,采 用安全高效的药物提高机体对辐射的抵抗能力是积极有效的应对方法之一。因此, 研究开发辐射防护药物和保健食品,对于国防和民用都具有不可忽略的意义。 目前已有一些具有防护辐射作用的药物,其中许多药物尽管疗效较好但毒副 作用也较大,有些资源不易获得或者成本较高,人们希望从天然植物尤其是传统 食品资源中开发毒性小、具有防治辐射损伤作用的物质。 辐射致机体损伤是一种涉及多种器官,多种组织,多种细胞,甚至多种机制 [7] 之间,相互作用而又复杂的生物学过程 。造血系统和免疫系统是射线作用的靶点。 在海洋中广泛分布的海藻当中存在着对辐射损伤有一定拮抗和修复作用的活性 物质,其中多糖便是海藻当中含量较高且具有一定生物活性的物质。有研究 [8] 显示 ,海藻多糖可通过阻止机体对放射性元素的吸收,对受辐射损伤的细 胞具明显保护和修复作用以及保护造血组织、提高机体免疫功能和抗氧化等 作用来达到其抗辐射的功效。随着人类对宇宙空间的开发及对辐射源的广泛 应用,开发研究可靠有效的抗辐射药物,减少相关人群的辐射损伤已变得非 常有必要。7 1.2 褐藻糖胶的活性研究现状 褐藻糖胶又称岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯,是从褐藻中提取 的一类硫酸多糖, 主要位于褐藻的细胞壁基质中,是藻体维持体内湿度、防止体表 干燥和保护其免受损伤的一种成分,主要存在于褐藻和棘皮动物中。褐藻糖胶主 要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯,其次还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、 阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质以及K、Na、Ca、Mg 等金属离子。褐藻糖胶的分子组 成和结构复杂,其主要结构特征是1,2-联结的聚a-L-吡喃岩藻糖,硫酸酯主要发 生在C-4位的羟基上,这是它们共同的特点。文献调研发现褐藻糖胶具有较为广泛 的生物学活性。 抗凝血 褐藻糖胶的结构和肝素具有相似性,抗凝血作用是其一个突出的特点。 褐藻糖胶的抗凝血活性较肝素有其独特优点:由于褐藻糖胶多糖的分子量大、不 易吸收,故其抗凝效果比肝素弱,但其出血的风险也比肝素小,是肝素良好的替 代物。褐藻糖胶体外的抗凝血活性特别突出,它能增加凝血酶的活性;而在体 内 [9] 几乎是没有凝血活性,可能是由于肠道的吸收 。褐藻糖胶能抑制内源性和外源性 凝血过程中凝血酶的产生,对内源性凝血因子的抑制作用明显强于外源性凝血因 子。其机制是阻碍了凝血酶原 ?a因子和Xa因子的产生,并通过肝素辅助因子 [10-11] ?HC?而不是抗凝血酶?较缓慢地抑制Xa因子的活性 。 抗肿瘤 研究证实褐藻糖胶具有抗肿瘤活性,褐藻糖胶的抗肿瘤活性一般是通 过增强机体免疫细胞的活性来实现的。褐藻糖胶能明显抑制小鼠S180实体瘤的生 长,延长肿瘤负荷鼠的生存期,且呈现剂量相关性,褐藻糖胶通过免疫和抗氧化 [12-13] [14] 调节机制起一定的抗肿瘤作用 。Nagamine 等人发现褐藻多糖硫酸酯对于 Huh7肝癌细胞有明显抑制作用,其半数抑制率为2.0mg/mL。蛋白质印迹结果表明 褐藻多糖硫酸酯处理的Huh7细胞的培养基中α-胎球蛋白的含量下降,在1.0mg/mL 褐藻多糖硫酸酯作用下,Huh7细胞中趋化因子配体12mRNA表达显著下调,而趋 化因子受体4CXCR4的表达不受影响,他们认为褐藻多糖硫酸酯的抗肿瘤活性是 通过下调趋化因子配体12mRNA表达实现的。 抗病毒 实验表明褐藻糖胶具有显著的抗病毒作用。用褐藻糖胶喂养受HSV-18 感染的小鼠,可以增强小鼠巨噬细胞和B细胞的吞噬作用,同时可以增加NK细胞 的活性,连续喂养三周后,小鼠体内中性抗体显著增强,其保护作用可能是通过 [15] 直接抑制病毒复制和激活免疫防御系统实现的 。褐藻糖胶对HIV病毒性感染也有 一定的抑制作用,其抗HIV病毒机理主要是通过阻断HIV与靶细胞上的受体CD4的 连接发挥抗病毒作用,硫酸化基团是活性必需基团,其作用强度随硫酸化的程度 [16] [17] 上升而增强 。 Mandal P 等研究表明,褐藻糖胶对单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)有抑制作用。作用机制是褐藻糖胶对病毒没有直接灭活作用而是 抑 制病毒的吸附,从而抑制合胞体病毒的形成。 对肾脏的保护作用 褐藻糖胶能减轻慢性肾衰竭大鼠肾间质纤维化并起到保护 肾的作用,可能与其部分抑制肾小管上皮-间充质细胞转化有关,而该作用机制可 能与其下调肾组织TGF-β 、MCP-1 和TSP-1 的表达,上调肾组织血管内皮生长 1 [18] [19] 因子VEGF的表达有关,但其确切机制仍需进一步研究证实 。此外临床研究 表明以褐藻多糖硫酸酯为主要成分的海昆肾喜胶囊能够增加肾脏血流量和增强免 疫,还能促进受损细胞修复,能明显改善各种原因导致的慢性肾衰竭患者的消化 道症状,具有降低肌酐SCR和尿素氮BUN,同时升高血红蛋白和血浆白蛋白, 使肾衰竭患者营养状况得到明显改善。 抗氧化 褐藻糖胶具有明显的抗氧化活性,主要通过抑制活性氧自由基的生成 [20] [21] 并促进其清除而发挥作用 。Kang 等研究表明褐藻多糖硫酸酯对CCl 所致大鼠 4 急性肝损伤有保护作用,其机制与褐藻多糖硫酸酯能对抗“氧化应激”所致的脂 质过氧化和增强抗氧化酶的活性有关。褐藻糖胶能够通过清除自由基、提高抗氧 化酶活性以及阻断脂质过氧化链式反应等作用,达到保护机体免受氧化损伤的目 的。 抗辐射 辐射作用下,褐藻糖胶具有提高存活率,降低对造血系统的损害,拮 抗因辐射免疫而造成的损伤,清除因辐射作用而产生的自由基等作用。但褐藻糖 胶抗辐射作用的有效部位、作用靶点以及作用机理等都还有待更深入的研究。有 研究发现褐藻多糖硫酸酯具有较强的抗辐射活性,其作用机理是褐藻糖胶能直接- 清除超氧阴离子自由基O 和羟基自由基?OH;随着褐藻糖胶浓度的增加,其清 2 [22-23] 除活性氧自由基的能力加强,并能提高超氧化物歧化酶SOD的活力 。Lee9 [24] 等 研究表明褐藻糖胶对 γ射线照射所致小鼠的白细胞有保护作用,其作用 机制可 能是褐藻糖胶够通过清除自由基、提高抗氧化酶活性进而起到抗氧化作用。上述 研究表明褐藻糖胶具有一定的抗辐射作用,是非常有研究开发前景的天然辐射防 护剂。 总之,褐藻糖胶的药理活性非常广泛,褐藻糖胶的生物活性联系到许多重要的 生命进程。除上述活性外,其还具有抗炎、抗氧化、保肝、补钙、提高免疫等生 [25-30] 物活性作用 。临床上目前已利用其开发出防治心、脑、肾血管疾病的药物, 并在取得了非常满意的效果。但褐藻糖胶的医用价值还远远没有得到充分挖掘, 特别是其在抗辐射方面还缺少系统的研究。我国褐藻资源十分丰富,如能简化提 纯工艺,明确结构和功效的关系,进一步阐明作用机制,褐藻糖胶必将在抗辐射 临床新药和保健品开发上具有广阔的前景。 1.3 本课题研究的目的及意义 本课题获国家自然科学基金(No.3077263)的支持。在前期工作的基础上,以 日高昆布作为研究对象,采用酸提醇沉法对褐藻糖胶进行提取和含量(多糖、 硫 60 酸根)测定,并对褐藻糖胶对 Co- γ射线辐射引起的人外周血淋巴细胞微核率的 影响以及对小鼠造血系统的辐射防护作用进行了系统性的研究。如能获得成功, 无疑可为我国辐射防护剂的研究提供新的突破口,具有重要的理论价值和应用前 景;也为我国海藻资源的开发利用提供了有价值的数据信息和参考资料。随着我 国载人飞船的发射成功,以及太空行走和空间站的建立,人们与放射线接触的机 会日益增多,遭受辐射损伤的可能性也随之增加。提高航天员对空间特殊环境的 适应能力和耐受能力,有效保障航天员健康是确保航空任务圆满完成的重要前提, 其中提高航天员的抗辐射能力是重要课题之一。天然辐射和人为辐射等放射线 辐射越来越多的影响着人们的身心健康。因此,研究开发辐射防护药物和保 健食品,对于国防和民防都具有不可忽略的意义。 1.4 本实验主要研究内容 课题前期已通过文献、数据资料搜集分析和实地重点调查完成了中国沿海药 用10 海藻资源的分布特征的初步研究,对中国辽宁沿海、秦皇岛、烟台、南麂岛、? [31] 洲岛和海南鹿回头等六处海域89种药用海藻的分布特点进行了 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf ,并对采集 到的33种药用海藻样本进行了初步的抗辐射活性筛选,确定了活性较强的海藻日 高昆布后,对之进行了细致的分离纯化,得到岩藻甾醇、褐藻糖胶等组分。 本课题以辐射较为敏感的人外周血淋巴细胞作为主要的研究对象,进行褐藻糖 60 胶体外活性实验;较低剂量 Co- γ 射线照射下,人外周血淋巴细胞即可产生较高 的微核率。人外周血淋巴细胞微核测定是细胞遗传学方法之一,是检测机体放射 性损伤的经典指标。人外周血淋巴细胞微核检测,对判断辐射损伤程度具有重要 [32] 的意义 。结果发现褐藻糖胶具有较好的抗辐射体外活性;进而选择对射线昀为 敏感的造血系统进行小鼠体内活性实验研究,造血系统的辐射损伤是骨髓型放射 [33] 病昀重要的病理变化,也是辐射损伤治疗的根本环节 ,因此本部分的研究以先 前实验中提取的对细胞和动物无急性毒性的褐藻糖胶为基础,以对辐射昀敏感的 造血系统为观察对象,研究褐藻糖胶对小鼠造血系统辐射损伤的防护效应。11 第一部分 褐藻糖胶的提取及多糖、硫酸根的含量检测 多糖是所有生物体的重要组成成分,广泛存在于动植物和微生物细胞壁及细胞 膜,是生物体内除核酸和蛋白质外的另一种重要的生物大分子。目前多糖提取工 艺中常用六种提取方法,包括:水提法,碱提法,酸提法,超声提取法,微波提 取法和超滤提取法等。其中水提法是多糖的常用提取方法,适用于大多数多糖的 提取;碱提法和酸提法主要针对含有糖醛酸的多糖及酸性多糖且有助于提高某些 多糖的得率;超声提取法和微波提取法则属于物理方法,分别应用物理学中的空 化作用和微射线辐射,使多糖从细胞内释放,可避免多糖结构破坏对实验结果的 影响;超滤法对仪器设备的要求较高。总之,各种方法各有利弊,需要根据实 验 条件等选择。本实验选择酸提醇沉法提取昆布中的褐藻糖胶。该方法根据不同多 糖组分在不同浓度低级醇和酮中具有不同溶解度的性质,按浓度从小到大加入甲 醇、乙醇或丙酮分级沉淀,昀终获得所需 多糖成分,其中乙醇分级沉淀法简单易 行,适于本实验室的条件及用量需要。本实验即采用该法并选用 Sevag 法除去提 [34] 取物中的蛋白质,简便易行,对多糖的污染和损失较小 。在提取物的多糖含量 测定方面,采用苯酚-硫酸比色法检测,该法中浓硫酸可将多糖水解成不同的单糖, 单糖迅速脱水生成糖醛衍生物,与苯酚结合生成有紫外光吸收度的有色物质通过 比色测定计算出样品总糖含量。硫酸根的存在对褐藻糖胶的物理化学性质及生物 活性都有重要影响。因此,定性、定量测定褐藻糖胶的硫酸根,对于鉴定褐藻糖 胶样品及分析构效关系都有重要意义。常用的分析方法有硫酸钡-比浊法、硫酸钡- 重量法、离子色谱法、联苯胺法等;这些方法中硫酸钡-比浊法、硫酸钡-重量法是 昀常用、昀经典的方法;硫酸钡 -重量法操作比较复杂而硫酸钡-比浊法操作简单, 在普通实验室就可进行且测定结果可靠稳定;故而本实验选择硫酸钡-比浊法测定 日高昆布中褐藻糖胶硫酸根含量。 1 材料和仪器 1.1 实验材料12 干燥日高昆布Laminaria japonica Aresch,上海市自然博物馆杭金欣副研究员鉴定, 购于日本北海道 硫酸钾批号:20100917,分析纯,北京化工厂 三氯乙酸批号:20101027,分析纯,北京化工厂 氯化钡批号:20101118,分析纯,北京化工厂 明胶批号:20100128,分析纯,北京化工厂 浓盐酸批号:20100706,分析纯,北京化工厂 葡萄糖标准品(批号:20091111) ,分析纯,北京化工厂 苯酚(批号:20100212),分析纯,北京化工厂 乙醇批号 20100907,分析纯,北京化工厂 甲醇(批号:20091022),分析纯,北京化工厂 冰醋酸(批号:20090907),分析纯,北京化工厂 氯化钾(批号:20080802),分析纯,北京化工厂 氯化钠(批号:20100127),分析纯,北京化工厂 1.2 实验仪器 BS110S型电子天平,德国赛多利斯集团 BS323S型电子天平,德国赛多利斯集团 台式离心机,上海安亭科学仪器厂 UV-2000 型紫外分光光度计,上海洪富仪器仪表有限公司 DZF-6020 型真空干燥箱,上海一恒科技有限公司 RE-52AA 旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂 UVS-1型涡旋振荡器,北京优晟联合科技有限公司 2 试验方法 2.1 褐藻糖胶的提取取日高昆布,清水洗净,风干后磨成粉末过 20 目筛。用石油醚 1500ml,90? 回流 1h,脱脂 2 次,离心4000r/min,10min分离,沉淀挥发溶剂后,加入昆布 15倍质量的氯化钙溶液(浓度为 15 g/L,pH值为 2),60?浸提 1.5h。取上清液13 浓缩加乙醇至体积分数为 65%沉淀,沉淀用乙醇和丙酮浸洗再离心、40?干 燥,得褐藻糖胶粗多糖;粗多糖配制成 2%多糖水溶液,用 Sevag 法去除粗多糖 中的蛋白质,离心除去不溶物,加乙醇至体积分数为 20%,离心除去沉淀,清液 继续加乙醇至 60%浓度,离心,得沉淀;然后对 60%乙醇沉淀物进行重新沉淀, 先加乙醇至体积分数为 30%,留上清液去除沉淀,再加乙醇至体积分数为 70%, 溶液呈半胶体,加入 1ml10%氯化钠溶液后,迅速有白色絮状沉淀产生,沉淀用无 [35-36] 水乙醇及丙酮浸洗,40?真空干燥得纯化的褐藻糖胶 。 2.2 褐藻糖胶纯化品中总糖含量的测定 2.2.1 对照品溶液的配制: 精密称取105?干燥至恒重的无水葡萄糖对照品100mg,置100ml容量瓶中。用 蒸馏水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为1mg/ml的对照品溶液,于低温处保 存备用。 2.2.2 供试品溶液的配制: 精密称取干燥至恒重的纯化褐藻糖胶样品150mg,置10ml容量瓶中,用蒸馏水 溶解并稀释至刻度,摇匀,即得15mg/ml的供试品溶液。 2.2.3 苯酚试液的配制: 取苯酚100g,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,蒸馏,收集182?的馏分。称取5g 馏分,加蒸馏水溶解,定容于100ml棕色容量瓶中临用前新配,于低温处避光保 存。 2.2.4 测定波长的选择 精密移取葡萄糖对照品溶液1.0ml,置10ml具塞试管中,加入苯酚试液1.0ml, 混匀;迅速加入浓硫酸5.0ml,混匀。置60?水浴中,加热30min,取出,冰水浴中 迅速冷却停止反应。以蒸馏水同法操作为空白,在400~700nm范围内进行扫描, 葡萄糖对照品溶液在486nm处有昀大吸收。 以相同方法对褐藻糖胶供试品溶液进行 显色、扫描在486nm处亦有昀大吸收、且无其他干扰,故选择 486nm作为测定波长 [37] 。如图1-2所示14 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 400 500 600 700 800 波长图1 葡萄糖标准溶液紫外扫描图谱 Fig.1 UV scanning spectrum of Glucose standard solution 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 400 450 500 550 600 650 700 750 800 波长图2 褐藻糖胶溶液紫外扫描图谱 Fig.2 UV scanning spectrum of Fucoidan 2.2.5 标准曲线的制作: 精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、 0.09、0.1ml至10ml具塞试管中,分别用蒸馏水补充至1.0ml。按照确定的昀佳显色 及测定条件,以1.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白,测定吸光值。将所得结果制 成表,以葡萄糖的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线,并得 出标准曲线的回归方程。2.2.6 褐藻糖胶纯化品中总糖含量的测定: 精密吸取供试品溶液1ml,置10ml具塞试管中,加入苯酚试液1.0ml,混匀;迅15 吸光度 吸光度 速加入浓硫酸5.0ml,混匀,置60?水浴中加热30min,取出,冰水浴中迅速冷却停 止反应;在486nm处侧其吸光值n6。 2.3 褐藻糖胶纯化品中硫酸根含量的测定 2.3.1 褐藻糖胶样品的处理 称取褐藻糖胶样品 l0mg,于具塞试管,加入 1mol/L 盐酸溶液 5ml 于 110?加 热水解 8h,冷却后,8000r/min离心 20min,过滤,保存备用。 2.3.2 紫外光谱的测定 精密称取 105?干燥至恒重的硫酸钾 108.75mg,以 1mol/L的盐酸溶解,定容 2- 至 100ml 容量瓶中,摇匀,即得硫酸根标准贮备液SO 0.60mg/ml;取硫酸盐标 4 准溶液 0.2ml,加三氯乙酸 3.8ml 和氯化钡溶液 lml,混匀,进行紫外光谱测定; 结果硫酸钾在 360nm处显昀大吸收峰。如图 3所示: 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 220 270 320 370 波长(nm)图 3 硫酸盐的紫外光谱图 Fig.3 UV scanning spectrum of Sulfate 2.3.3 标准曲线绘制 分别精密吸取硫酸盐标准溶液 0、0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20ml 于试 管,各以盐酸溶液补至 0.2ml;以 0.2ml 盐酸溶液作为空白,加三氯乙酸 3.8ml 和 氯化钡溶液 lml,混匀,室温静置 25min,于 360nm测吸收度 A ;以 5%的明胶溶 1 液 1.0ml 代替氯化钡溶液依法操作,测吸收度 A ,以硫酸根 mg数为横坐标,纵坐 2 标为吸收度A -A 值,得标准曲线,确定线性范围。其中每点做三个平行样品, 1 2 取平均值。 2.3.4 硫酸根含量的测定16 吸光度 吸取样品溶液 0.2ml,按标准曲线的制作方法,测吸收度A -A 值,根据标准 1 2 曲线回归方程计算硫酸根含量。 3实验结果 3.1 褐藻糖胶的提取结果 运用酸提醇沉法 40?真空干燥得纯化的褐藻糖胶 2.13g,得率为 0.994%。 3.2 褐藻糖胶纯化品中总糖含量的测定结果 3.2.1 标准曲线的制作标准曲线吸光度值见表1。以吸光度值(A)对葡萄糖 浓度(C)进行线性回归, 2 得回归方程:A10.223C+0.0001,R 0.9999,结果表明葡萄糖浓度在 10-100ug/ml 范围内线性关系良好。如图4 表1 葡萄糖标准样品溶液在486nm的吸光度值(n3) Tab.1 Absorbance values of Glucose standard sample solution at 486nm n 3 葡萄糖浓度 吸光光度值 0.01mg 0.104 0.02mg 0.206 0.03mg 0.309 0.04mg 0.411 0.05mg 0.513 0.06mg 0.615 0.07mg 0.717 0.08mg 0.819 0.09mg 0.921 0.10mg 1.023 17葡萄糖标准样品溶液在486nm的标准曲线1.2 y 10.223x + 0.0001 2 1 R 0.99990.8 0.6 0.40.20 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 葡糖糖浓度图4 葡萄糖标准样品溶液在486nm的标准曲线 Fig.4 Standard curve of Glucose at 486nm 3.2.2 样品多糖含量的测定 精密吸取供试品溶液连续测定6次,平均含量为42.63?,见表2。 表2 褐藻糖胶中总糖含量测定结果 Tab.2 Determination results of total sugar content in fucoidan多 糖含量? 平均含量? RSD ? 1 41.82 2 41.78 3 43.87 42.63? 2.41? 4 42.78 5 41.67 6 43.82 3.3 褐藻糖胶纯化品中硫酸根含量的测定结果 3.3.1 标准曲线的制作标准曲线吸光度值 见表 3。以吸光度吸收度A -A 值对硫酸根含量mg进行线 1 2 2 2- 性回归,得回归方程 A0.8774C-0.004500 R 0.9909;SO 在 60~120μg 范 围 4 内线性关系良好,如图 5。18 吸光光度值 表 3 硫酸盐标准样品溶液的吸光度值 Tab.3 absorbance of Sulfate standard solution1 2 3 4 5 6 7 2- SO 0 0.024 0.048 0.060 0.072 0.096 0.120 4 BaCl A 0 0.035 0.052 0.066 0.078 0.098 0.123 2 1 明胶 A 0 0.020 0.021 0.018 0.018 0.017 0.021 2 A -A 0 0.015 0.031 0.048 0.060 0.081 0.102 1 2硫酸盐标准样品溶液在360nm的标准曲线0.12y 0.8774x - 0.0045 0.1 2 R 0.99090.080.060.040.020 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 -0.02SO42-含量图 5 硫酸盐标准样品溶液在 360nm的标准曲线 Fig .5 Standard curve of Sulfate at 360nm 2- 3.3.2 样品SO 含量的测定 4 吸取样品液 0.2ml,按标准曲线的制作方法,测吸收度A -A 值,根据标准曲 1 2 线回归方程计算硫酸根含量。其中,每个样品测 3 次,取平均值。硫酸根含 量 %[ C/0.2×V/W]×100%,其中 C为样品测定值mg,V样品水解液总体积,W 为初始样品质量,结果见表 4。19 吸光光度值 表 4 褐藻糖胶的硫酸根含量测定结果 Tab.4 Determination results of Sulfate content in fucoidan 2- A -A 样品 SO 的含量 ?X?S RSD 1 2 4 2- SOmg % % % 4 0.066 0.0807 20.57 0.064 0.0781 19.92 20.52?0.57 2.78 0.068 0.0826 21.06 4. 讨 论 褐藻通常作为一种食用藻类,有着丰富的营养价值,蛋白质含量约占藻体干 重 的 6.9-16%,包括 19 种氨基酸,其中,含 8 种人体必需的氨基酸,富含维生 素及 各种微量元素。褐藻多糖在天然活性产物的开发和药用价值的研究中具有广 阔的 前景。虽然昆布中多糖含量很高,但作为主要生物活性成分的褐藻糖胶含量 较低, 因而,批量生产对分离纯化技术的要求较高,目前,市售的具有较高纯度的褐藻 糖胶样品价格比较昂贵。褐藻糖胶的主要成分为 L-岩藻糖和硫酸根,还含有半乳 糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸等成分。其结构为由酯化多糖和硫酸基构成 的单元化合物形成的聚合物。 4.1 本实验组对昆布中褐藻糖胶的提取方法进行了优化:首先采用 15倍昆布质 量的氯化钙溶液(浓度为 15 g/L,pH 值为 2)60?浸提 1.5h,醇沉 5 次,获得了 较高的得率和纯度。其次采用 5 种浓度乙醇分级沉淀的方法,则能较好地除去褐 藻糖胶中的褐藻淀粉和褐藻酸钠。 4.2 多糖广泛存在于自然界,是多种中草药的有效成分之一,具有多种生物活 性,本文运用酸提醇沉法从日高昆布中提取褐藻糖胶,并运用苯酚-硫酸比色法对 其多糖含量进行了测定,苯酚-硫酸比色法为多糖含量测定的经典方法,本实验中 该方法的原理是褐藻糖胶在浓硫酸的作用下,先水解为单糖,单糖迅速脱水 形成 糖醛衍生物,糖醛衍生物再与苯酚缩合为有色化合物。该有色物质在 486 nm处有 昀大吸收,可在该波长处进行测定算得褐藻糖胶中多糖的含量(以葡萄糖计) 。应 用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量时应该注意:苯酚溶液易被氧化,实验时应现配20 现用;制备标准曲线时,葡萄糖浓度不应过高,加入浓硫酸不应过多,否则容易 碳化;特别是加浓硫酸时,迅速加入和慢慢加入、直接滴到液面和沿管壁流入对 昀后的结果都会存在差异,需特别注意;操作的一致性,注意反应时间的一致性, 以及在加入浓硫酸95%-98%之后、水浴加热之前一定要摇匀。本试验采用沿管壁 慢慢滴加浓硫酸,冰水浴控制显色反应时间的一致性,漩涡混合器实现快速混匀, 然后同时在 60?水浴中加热 30min,保证了显色反应的均匀一致,确保了试验数 据的可靠性和重现性。 4.3 明胶中含有微量杂质,当加入氯化钡配制 l%氯化钡-0.5%明胶溶液时,溶 液成轻微乳浊液状,可能是明胶中含有微量杂质与钡离子形成沉淀所致。因 此, 采