冬凌草甲素促进人前列腺肿瘤细胞P21表达并诱导自噬与凋亡研究（可编辑）

冬凌草甲素促进人前列腺肿瘤细胞P21表达并诱导自噬与凋亡研究（可编辑） 冬凌草甲素促进人前列腺肿瘤细胞P21表达并诱导自噬 与凋亡研究 奎凌堇里盍堡进厶煎到膣胜疸垫丝里垄呈 ? 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 作者签名: 型翌塑 指导教师签名: 论文评阅人1: 倪崖 副院长 浙江省医叠睦 评阅人2: 盘感宝 敛援 浙江太堂医堂睦 评阅人3: 虚金彪熬援 浙江太堂医堂瞳 评阅人4: 评阅人5: 答辩委员会主席: 委员1: 委员2: 委员3: 委员4: 委员5: 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝塑太堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:歹参嘭润 签字日期: 伽11年孑月y日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堑江太堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江太堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 玲芗纲 …:扩 签字日期:加l,年弓月7日 签字日期:如ff年 月、日 浙江大学硕上学位论文 致谢 致 谢 经数个日夜伏案敲打，几易其稿，论文终于付梓了。但此时的心情却是既踏 实又彷徨，复杂的很。踏实的是几年磨一剑，付出的那么多热情和辛劳终见有了 拙劣浅显的成果，彷徨的是告别学生时代，一脚踩进社会，未来有太多的不确定。 两年半的时间，很短，短得来不及细细品味就已转瞬即逝;也很长，长得似 乎足以让全然青涩的我成长为一个半成熟的社会人。记得第一次莽莽撞撞闯入李 老师办公室诉说想念研究生时的不安，记得自己踌躇满志细胞却几数污染时的焦 急，记得实验之中发现意外收获时的惊喜，记得参加学术会议获奖时的喜 悦…… 忙却充实着，痛却幸福着，一切的一切，铭留在心里。 真挚感谢我的恩师一一李继承教授。从一开始论文的选 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 、 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ，后 来实验的开展，最后论文的撰写，每一细节都凝聚了恩师的心血和思想。正因为 才有我的成长。几年里，我无时无刻都感受着李老师您有您的指引和督促， 忘我 的敬业精神、严谨的工作作风及锲而不舍的钻研精神，这将长久地影响着我的生 活和工作态度。李老师，感谢您教导我做人、做事、做学问，感谢您的诲人不倦。 感谢李冬梅老师亦师亦友地照顾，感谢实验室师兄弟师姐妹们，蒋磊、李萌、 洪盾、王萍、杨月琴、陈斐、王自彬、刘姬艳、于宁、刘佳、赵梦刘翠萍、 媛、 薛云、张甜、潘志文、曹文明、金蕾、王家雄、张星、万晓晨、马英玉、沈培、 张嫣姣、张裕翔、陈忠梁、王冲……感谢你们在无私讨论和交流中给予的实验帮 助，生活也因有你们才变得精彩纷呈。 感谢电镜室王丽老师、董耀森老师、石为老师、杨萍老师及李仲杰老师对我 实验上的帮助和生活上的关照(感谢我的室友许洁琼、钱玲玲、樊欢等( 感谢我的家人，有你们的支持和理解，我的学习和生活变得更有意义。 这一刻，有太多的人、太多的事在脑海里淡进淡出，挥之不去。请原谅我没 法一一例数亲爱的你们。 挥手既是告别时难言的不舍，也是再相逢时的欣喜。挥一挥手，道声珍重， 愿再相见时，你们都在幸福! 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 冬凌草甲素促进入前列腺肿瘤细胞P21表达并诱导 自噬与凋亡的研究 浙江大学医学院 细胞生物学 硕士研究生 李翔 导 师 李继承教授 中文摘要 从冬凌草中提取的萜类化合物冬凌草甲素 oridonin，ORI 能抑制多种肿瘤细 胞增殖，并诱导其发生凋亡，但机制尚未阐明。近年文献报道ORI是目前在临床 上广泛应用于前列腺癌治疗的PC(SPES方剂的重要活性化合物之一，本实验研究 ORI处理后前列腺癌细胞的形态学及分子生物学改变，旨在探讨其抗前列腺 癌的 机制。我们应用体外培养前列腺癌激素非依赖型PC(3、DUl45细胞及激素依赖型 LNCAP细胞，通过CCK(8试剂盒检测，发现ORI能有效抑制上述三株细胞株增 殖，并呈现显著的剂量和时间依赖性。在ORI作用细胞24h后，应用DAPI荧光 染色，未观察到DNA断裂现象;在透射电镜下观察，细胞核形态正常，但胞浆中 出现大量由双层膜包裹的自噬体及自噬前体，自噬体内含部分胞质、线粒体或高 尔基体等细胞器;通过Acridine vesicular 胞染色发现胞浆中存在大量酸性泡囊细胞器 acid organelles，AVOs 。在 上募集。Westernblot检测发现OR,处理导致LC3I蛋白向LC3II的泛素化修饰。 ORI上调P21蛋白表达水平，但抑制自噬能完全逆转P21蛋白水平的增加。在OR, 作用48h细胞后，细胞核出现DNA断裂，染色质凝集及细胞表面微绒毛消失，以 及自噬体和AVOs。应用AnnexinVoFITC,PI染色，流式细胞术检测到ORI作用的 文 浙江大学硕士学位论 中文摘要 PC一3及LNCaP细胞凋亡率明显提高。本研究表明，ORI作用诱导前列腺癌细胞发 生自噬及凋亡，且自噬能被3-MA抑制。MAP(LC3蛋白参与调控自噬体成熟过程， P21蛋白高表达与ORI诱导的自噬呈正相关。我们的实验结果为ORI在临床上应 用于前列腺癌的治疗提供实验依据，为ORI抗肿瘤机制研究提供新的思路。 关键词:冬凌草甲j素 oridonin ;自噬;凋亡;前列腺癌;P21 Ill 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 P21-??Related Precedes in AutophagyApoptosis Oridonin((treatedHumanProstateCancer ofMedicalSchool University Zhejiang M(D(Candidate Li Xiang Li SupervisorProf(Jicheng Abstract have that abletoinhibit studiesshownOridonin ORI was objective:Previous andinduce inseveralcell alsoisoneofcrucial proliferation apoptosis types(It in in isa formulationused PC―SPES，whichpotenteight-herb widely compounds aimof cancer mechanismisnot dear(The treatment(However’the prostate fully present for cancer( istofurtherunderstandthe ofORIasatreatment study potential prostate Methods:Human wasculturedin the vitro， andinhibitory prostatecancer HPC cells ratiooridoninonHPCcellswas CCK-3 ultrastructuresofthecells of assayedby kit，the Was under andtransmissionelectron observed light microscope andMDCwereusedtodetecte andThe ofDNAwasdetected autophagosomeschange P2 weredetectedwestern DAPI ofLC3and1 using by staining(Expressionproteins blot( Results:Inthis inhibited of andLNCaP study,ORIproliferationPC-3，DUl45 prostate cancel"linesinatime―and manner(Treatedwi?l dose―dependent ORI， characteristic featuresof aschromatin and apoptosis，such condensation，nuclearfragmentation of incellsat48 surfacemicrovilliaweredetected study disappearance bymorphologic at24 was110 of hours(Buthours，there apoptotic withdouble-membranestructureweredetectedin autophagosomes cytosol， which containedofthe and with staining portionscytosol，mitochondriaER(Specialbiological revealed AOandMDC formationofacidvesicular using organelles AVOs (By of confocal andWestern recruitment microscopy Blot， processed l was microtubule―associatedchain proteinlight 3-II MAP-LC3一II toautophagosomes andtheamountofLC3一IIWas observed increased(3-MA，a inhibitor, specificautophagy and could 0RI―inducedaccumulationofMDC ofLC3-II(ORI couldreverse augment inORI―treatedPC-3andLNCaP apoptosis human cancer this prostate cells，and wasrelatedtothelevel autophagy-inducingactivity ofP21(Ourstudies provide evidencefor experimental theuseofORIinclinic( cancer;P21 V 塑望盔兰堡主堂垡笙苎茎兰堕!!亘一 英文缩略语 Abbreviations ORI oridonin CCK(8 cell kit一8 counting DAPI 4’，6一diamidino一2-phenylindole PCD A叩 autophagy-relatedproteins CDK kinases dyclin-dependent AO acridine Orange 3(MA 3-methyladenine MDC mono-dansylcadervarine DMSO sulfoxide dimethyl HRP horseradish peroxidase acid EDTA diaminetetraacetic ethylene BCA bicinchoninicacid PI iodide propidium DTT DL(Dithiothreitol PMSF fluoride phenylmethanesulfonyl BSA bovineserumalbumin TBS trisbufferedsaline salt SDS sodium 浙江大学硕上学位论文 英文缩略语 PVDF fluoride polyvinylidene IC50 thehalfimal concentration inhibitory AVOs acidvesicular organelles PAS structur pre-autophagosomal mRFP--GFP????LC3 fluorescent tfLC3 tandem-tagged protein RFP redfluorescent protein GFP fluorescent green protein ER reticulum endoplasmic ERK extracellular kinase signal―regulated P13K 3-kinase phosphatidylinositol HCP Humancancer prostate VH 浙江大学硕上学位论文 目录 目 录 致 谢……………………………………………………………………………………… …………………………((I 中文摘 要………………………………………………………………………………。II 英文摘 要………………………………………………………………………………(? 英文缩略 语……………………………………………………………………………。VI 目 录………………………………………………………………………………………………………………VIII 1前言………………………………………………………………………………………………………………(1 2实验材料和方 法………………………………………………………………………5 2(1材料……………………………………………………………………………………………………………(5 2(2实验方 法……………………………………………………………………………((8 3结果……………………………………………………………………………………………………………((13 3(1ORI抑制前列腺细胞增 殖…………………………………………………………13 3(2ORI诱导前列腺癌细胞自噬体形 成………………………………………………16 3(3LC3蛋白参与调控ORI诱导的自噬体成熟过 19 程………………………………(( 3(4抑制剂3-MA减少ORI诱导的自噬……………………………………………((21 3(5 P21与ORI诱导的自噬一定程度上相 关…………………………………………22 3(6ORI诱导前列腺癌细胞发生凋 亡…………………………………………………22 4讨论:…………………………………………………………………………………………………………(27 5结论……………………………………………………………………………………………………………((30 1 参考文 献:………………………………………………………………………………3 综主 楚:……………………………………………………………………………………………………………((36 作者简历及在校期间所取得的科研成 果……………………………………………(47 浙江大学硕士学位论文 前言 冬凌草甲素促进人前列腺肿瘤细胞P21表达并诱导 自噬与凋亡的研究 浙江大学医学院 细胞生物学 硕士研究生 李翔 导 师 李继承教授 1前言 前列腺癌 ProstateCancer 在西方国家是男性最常见的恶性肿瘤。据国外临 ‘ 床调查报道，50岁以上男性的发病率约为50,，在导致男性死亡的肿瘤中仅次于 肺癌，占男性癌症死因的第二位[1】。近年来日本的前列腺癌发病率明显提高。在 我国，前列腺癌正影响着我国中老年男性的生活质量和预期寿命。随着人口老龄 化及生活条件的改善，前列腺癌发病率有明显增加的趋势，在男性泌尿、生殖系 统恶性肿瘤中跃居第三位。前列腺癌是前列腺表皮细胞恶性增殖的结果，发生在 前列腺外围或过渡区域。从低分化肿瘤到高分化高转移癌，前列腺癌的诱导发生 是一个多阶段的进程【2】。然而，目前前列腺癌的发病原因和转移机制尚不清楚， 已成为泌尿外科领域一个越来越重要的课题。临床上对前列腺癌治疗多数采用激 素疗法或切除睾丸等方法，对患者身心健康伤害极大，而中草药在此方面显示出 极大的优势。 由八种中草药配制而成的方剂PC(SPES在前列腺肿瘤方面具有非常好的疗 效，目前已开始直接向患者销售。经分离提纯并检测发现冬凌草甲素 oridonin， ORI 是PC(SPES方剂两个重要活性化合物之一，且能从冬凌草叶子中大量提取。 冬凌草是中国一传统中草药，具清热解毒、消炎止痛等功效，民间用于治疗咽喉 肿痛、扁桃体炎及食管癌己有30余年的历史，疗效颇佳(单体冬凌草甲素是一种 贝壳杉烯二萜类化合物，分子式:C20H2806，相对分子量364(43，为无色棱柱状结 文 浙江大学硕士学位论 翮舌 晶，难溶于水，易溶于乙醚、二甲基亚砜等有机溶剂，这对其在药学中的应用有 一定限制，目前研究实验多将其溶解于二甲基亚砜。分子结构中 Fig(1 ，与环外 亚甲基共轭的不饱和环戊酮结构为抗癌活性中心，可与DNA聚合酶直接结合，抑 制肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白合成，裂环或甲基饱和抗癌活性消失[3】。 Thechemicalstructureoforidonin Fig(1 冬凌草甲素具有多种药理活性，如消炎、抗菌等。近十年研究发现冬凌草甲素 在体内和体外对肺癌、乳腺癌、肝癌、血癌等都有一定的抗肿瘤活性[4(8】。目前 关于ORI抗肿瘤机制研究的报道很多，但多集中在周期阻滞和凋亡相关机制。冬 MCF(7在s期[9】，艾氏腹水瘤ECA细胞在G2,M期、并抑制其钠泵活性。冬凌草 细胞对凋亡小体的吞噬作用【12]。ORI还能通过增强耐药肿瘤细胞对放射性治疗及 抗肿瘤药物的敏感性以达到抗肿瘤目的。另外，近年有文献报道ORI具有诱导细 关蛋白表达水平。尽管如此，ORI抗前列腺癌机制尚不明确。 广泛存在于真核细胞中。在自噬过程中，细胞部分胞浆及细胞器被游离于胞浆中 的双层膜延伸包裹形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(在自噬溶酶 体中，待降解的物质 如一些长寿命蛋白质和细胞器 在多种水解酶的作用下被 分解成氨基酸、核苷酸和游离脂肪酸等小分子物质，实现胞内物质和能量的回收 nIn， nm，平均500 利用[18】。在透射电子显微镜下自噬体的直径一般为300(900 其双层膜包囊泡内常见的包含物有胞浆成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过 2 浙江人学硕:上学位论文 氧化物酶体等[19】。嗜溶酶体试剂吖啶橙AO及碱性荧光染料MDC能在细胞酸性 部位积聚发出强光，指示细胞酸性自噬溶酶体。细胞的自噬过程受自噬相关蛋白 Arp autophagy-relatedproteins 调控。其中At98基因在哺乳细胞中的同源蛋白， chain3， 自噬微管相关蛋白轻链3抗原 Microtubule(associated proteinlight kD的胞浆可溶性蛋白 MAP(LC3 是自噬的一个重要标记物。它存在两种形式:18 LC3(I及16kD的膜结合蛋白LC3(II。后者定位在成熟的自噬体膜及胞浆中游离 的自噬水平。 在细胞饥饿、缺氧等条件下，自噬参与很多生理过程如清除损伤、衰老细胞 器以及冗余蛋白。这种合成与降解的精细调节，对维持细胞的自身稳态有重要意 义【2l】(除饥饿外，氧化应激、感染以及蛋白大量聚集等因素也可以诱导细胞发生 自噬[221。因此，长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为，是细胞生存的一种 但近年来发现，在某些条件下，细胞过渡自噬也能导致细胞死亡，临时机制。 这 celldeath， 种自噬性细胞死亡被认为是II型细胞程序化死亡方式 programmed PCD ，以电镜下出现大量自噬体为其典型的形态学特征【23】。研究表明低水平的 自噬能力有利于肿瘤的发生，致癌物质诱导的鼠胰腺细胞在发展为肿瘤细胞后， 1 自噬能力降低[24】。在人乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到自噬调控基因beclin 单等位基因缺失。在MCF(7细胞中稳定转染Beclin1可以促进细胞自噬活性，降 力[251。同时，在肿瘤治疗过程中发现一些因素 放射线、药物因低成瘤能 子等 也可以引起细胞自噬，这引起广大学者对自噬与肿瘤治疗之间关系研究的兴趣， 他们认为提高肿瘤细胞自噬水平从而抑制肿瘤细胞增殖，可能是抗肿瘤药物作用 的重要分子机制之一。尽管如此，自噬机制尚不明确，自噬是否参与ORI抗前列 腺癌细胞增殖过程也未见报道。 Cell Death，PCD ，最早在 1972 凋亡作为I型程序性死亡方式 Programmed 年由Ken"等[3]提出。细胞凋亡时，发生一系列特征性的形态学、细胞化学及分子 生物学的改变。在形态学上，凋亡细胞可见特异性细胞膜发生泡状突起，细胞微 体积缩小，核固缩变形，染色质浓缩边集，沿核膜收缩呈新月形，绒毛消失， 伴 随有完整膜性结构的凋亡小体出现。细胞化学方面，正常细胞的细胞膜磷脂分布 气 浙江大学硕上学位论文 前言 是不对称的，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面， 这一改变被认为是特异性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记，应用标记有 异硫氰荧光素的连接素v与磷脂酰丝氨酸特异结合，通过立式细胞仪可以比较准 确地检测出细胞凋亡率。凋亡在大多数恶性肿瘤形成和发展的发病学上占有重要 地位。有研究表明肿瘤细胞凋亡调控失控导致的细胞凋亡抵抗是肿瘤发生主要原 因之一。文献表明诱导凋亡是ORI抗肿瘤细胞增殖的普遍机制，在ORI处理的多 种肿瘤细胞中均能检测到凋亡相关变化。但是，ORI处理的前列腺癌细胞是否也 发生凋亡尚待研究。 p21w^F1是目前国内外研究较多的抑癌基因，编码的蛋白直接受P53调控。 P21被普遍认为是细胞周期蛋白依赖型激酶 cyclin(dependentkinases，CDK 抑制 白直接调控的两个重要下游蛋白之一，参与P53介导的细胞DNA损伤反应。P53 是个功能非常复杂的蛋白，研究发现P53作为促进剂或抑制剂，参与多种自噬过 程[26】。但是，P21蛋白与自噬，尤其是ORI诱导的自噬之间联系的研究未见报道。 因此，我们以前列腺癌激素非依赖型细胞株PC(3，DUl45和激素依赖 型细 胞株LNCaP为研究对象，检测ORI处理后细胞形态学及分子生物学变化，探讨 细胞死亡方式，初步阐述P21与ORI诱导的自噬之间的关系。本研究为ORI抗前 列腺癌研究提供了一条新思路，为其临床应用提供实验依据。 4 一型 实验材料与方法 一槲 2(1材料 2(1(1细胞株 前列腺癌细胞株PC(3、LNCaP均购于中科院上海细胞库，DUl45为浙江大学 医学院公卫系毒理研究所杨军老师所赠。 2(1(2实验药品 ORI购于中科院武汉植物园，经液相色谱分析ORI含量为98,。 2(1(3主要试剂和耗材 DMEM High F12 Gibco公司; 0(25,胰蛋白酶+0(04,EDTA Gibco公司; BovineSerum 胎牛血清 Fetal ExCell公司; 细胞培养用青霉素-链霉素溶液 100x Sangon公司; 二甲基亚砜 DMSO Sigma公司; Cell Kit(8 Counting 日本Dojindo会 社; Sigma公 司; 4,6一diamidino-2一phenyli(ndole DAPI LipofectamineTM2000转染试剂 Invitrogen公司; Trizol Invitrogen公 司; Taq酶 Sangon公 司; ECLsubstratekit Pierce公 司; Santa GAPDH抗体 Cruz公 司; MAP―LC3f 抗体 Sigma公司; P21抗体 SantaCruz公司; HRPGoatanti―Mouse Santa IgG Cruz公 司; HRPGoatanti―Rabbit Santa IgG Cruz公 司; 5 塑婆盔学硕士学位论文 实验材料与方法 Acryl,Bis Solution 29:1 Sangon公司: Pre―stainedProtein MolecularMarker Weight Fermentas 公司; 2000DNA bp Ladder Takara公司; Reverse Transcription System Invitrogen公司; 引物合成 Invitrogen公司; 质粒小抽试剂盒 Qiagen公司: PVDF膜 0(45岫 Millopore公司: 吖啶橙 AO Sigma公司; 3-methyladenine 3-MA Sigma公司; Mono-dansylcadervarine MDC Sigma公司: AnnexinV-FITCKit Bender MedSystems公司: 戊二醛 (M(K公司: E 锷酸 PGM Chemicals; EDTA Sangon公司; BCA Pierce公司; 碘化丙锭 PI Sigma公司: 2(1(4主要仪器 C02培养箱3111型 Forma Scientific公司: 低温高速离心机2K15C 日立: 高压灭菌锅MLS(3750型 SANYO公司; 电热恒温水浴槽DK-8D型 江苏海门公司; (80?冰箱 Forma Scientific公司; (20?冰箱 SANYO公司; 倒置荧光显微镜IX71型 OLYMPUS公司; 酶标仪 BIO-RAD公司; Master PCR仪 Cycler Eppendorf公司; 水平电泳槽DYYIII型 北京 六一仪器厂; 6 浙江大学硕上学位论文 实验材料与方法 90 电泳仪Serious E―C programmable型 apparatus公司: 凝胶图象分析系统 上海天 能科技有限公司; SDS(PAGE垂直凝胶电泳槽 BIO―RAD公司; Trans(BlotSD Cell型湿转膜装置 BIO(RAD公司; 电源PowerPacBasicPower型 BIO(RAD公司; METTLER 分析天平AB204(S型 TOLEDO公司; METTLER PH计DELTA320型 TOLEDO公司; 水平摇床 江 苏海门公司; 细菌培养箱303型 上海锦屏仪器 仪表有限公司; 恒温振荡器HZ9211K型 江苏太 仓科教器材厂; Milli(Q纯净水系统 Millopore公司; Nano Thermo公司; drop2000分光光度计 透射电子显微镜Tecnai10型 PHILIPS公司; 超净工作台 苏州净化; 流式细胞仪 BAD公司 共聚焦显微镜lsm(510型 Zeiss公司 2(1(5主要试剂配制 KCl 0(2 PBS 磷酸缓冲液 g KH2P04 0(27 g NaCl 8(5 g NaEHP04(12H20 2(85 g 三蒸水定容至1000ml，然后进行高压灭菌，4?冰箱保存备用。 胰蛋白酶液 胰蛋白酶 250 mg EDTA 20mg 胰蛋白酶完全溶于100 mlPBS，加EDTA混匀。0(45gm+0(22岬 孔径滤 器过滤除菌，置于4?冰箱保存备用。 冬凌草甲素溶液 36(44 ml mmol,L浓 mg冬凌草甲素完全溶解于lDMSO中，配制成100 7 浙江大学硕士学位论文 实验材料与方法 度储备液，置于4?冰箱保存备用。适用时，用培养液稀释至各 个终浓 度，但应保证DMSO含量 o(1,。 戊二醛固定液 ml 混 ml，加0(2mol,LPB液50ml，再加蒸馏水 40 取25,戊二醛原液10 匀，4?冰箱保存备用。 锷酸固定液 将含有1g的锷酸小瓶浸入清洁液过夜，用双蒸水冲洗数遍后，将小瓶 放在盛有50m1双蒸水的100ml棕色磨口瓶内，破裂锷酸小瓶使其内锷 酸溶解于水。1(5ml小瓶分装，避光4?冰箱保存备用。适用前在稀释 1倍成1,适用液浓度。 2(2实验方法 2(2(1细胞培养 养液。各培养基均含100U,ml青霉素和100U,ml链霉素。在37?、5,C02， 饱 和湿度的培养箱中常规培养。 2(2(2 ORI处理细胞及CCK-8检测 取对数生长期细胞接种于96孔板上，每孔5000个细胞，培养24h待细 胞完 全贴壁后，加入不同浓度的ORI 10、25、40、60、100 gmol,L 分别处理 12、 24、48、72h后，应用CCK(8法测定细胞存活率。每孔加入lOCCK(8继续 培 gl 养3h，用酶标仪检测在450nlTl波长下的吸收值 A ，DMSO做为空白对照， 按 下列公式计算细胞存活率 cell inhibition : viability 和细胞生长抑制率 cellgrowth 存活率 实验组平均A值,对照组平均A值 x100, 生长抑制率 1一实验组平均A值,对照组平均A值 x100, 实验重复三次，每次设三个复孔。根据细胞存活率，得出药物半数抑制浓度 IC50 。 2(2(3 DAPI染色 浙江大学硕士学位论文 实验材料与方法 接种对数生长期前列腺癌PC(3细胞于96孔，每孔5000个细胞。细胞爬片 24 h后，加入ORI处理48h。再吸弃上清液，4?PBS清洗2次，4,多聚甲醛固 定10 rain，PBS冲洗三次，DAPI染料室温避光染色10min，PBS冲洗，最后在荧 光显微镜下观察。 2(2(4Annexin V-FITC,PI双染 h、48 细胞接种于6孔板，贴壁后经ORI或DMSO分别处理24h，收集细胞， PBS清洗后重悬于结合缓冲液中，调整细胞浓度为2-5x105,ml，取195 pl细胞悬 浮液，加入59lAnnexinV-FITC染液，室温孵育10rain，离心收集细胞，PBS清洗 一次，再重悬于190 30 pl的结合缓冲液中，加loplPI 20 min 以内流式 gg,m1 ， 细胞仪分析。 2(2(5透射电子显微镜观察 h、 取贴满对数生长期细胞的100ml培养瓶，经ORI或DMSO分别处理24 48 h，收集细胞后，用4?PBS清洗一次，并用4?2(5,戊二醛固定2h，再 PBS 水，每次15 812包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，PHILIPS rain，Epon TECNAI 10型透射电镜观察，加速电压80kV( 一 2(2(6 AO,MDC活细胞染色: 接种对数生长期前列腺癌PC(3细胞于96孔，每孔5000个细胞。细胞爬片 定lO rain，PBS冲洗三次，加AO 1I(tg,m1 或MDC 5mmol,L 染液避光反应10rain， PBS清洗两次后，在荧光显微镜下观察拍照。 2(2(7质粒转染 取对数生长期PC(3细胞接种于24孔板，lxl05,孔，待细胞长到80,左右融合 时，按Lipofectamine 质粒DNA 4 pg 和Lipofectamine2000 10山 分别稀释到250m无血清无双抗 的DMEM中，混匀后室温孵育5 rain，将稀释的DNA和稀释的转染试剂混合，混 匀后室温孵育20min，加入到孔板中。转染4h后，换成含血清DMEM，培养24h 、4h，在共聚焦显微镜下观察拍照。 后加ORI或DMSO分别处理lh 9 浙江大学硕士学位论文 实验材料与方法 2(2(8细胞胞浆蛋白和胞核蛋白的提取 2(2(8(1蛋白提取 细胞经ORI或溶剂DMSO处理于不同时间点收集细胞，分别提取细胞胞 浆蛋 mM 白和胞核蛋白，将收集的细胞团块重悬于裂解液A【10 7(8 ， Hepes―NaOH pH mM mM mM P-40，1mM 15 KCl、0(1mMEDTA，1 DTT，0(1,Nonidet MgCl2，1 PMSF，5 and5 min，最终漩涡 震荡 Ixg,mlleupeptinIxg,mlaprotinin]，冰上孵育20 45 min，收集上清 胞浆蛋白 一80。C储存备用。将剩 s，11000×g、4?离心10 mM mM NaCl，1(5 余细胞团块重悬于提取液B[20 7(9 ，0(42M Hepes-NaOH pH mMEDTA，0(5mM mMPMSF，5 MgCl2，0(2 D1vr，25,glycerol，0(5J_tg,ml min，期间f(q歇漩涡震荡，最终14000× leupeptin，5I(tg,mlaprotinin]，冰上孵育30 min，收集上清 胞核蛋白 一80。C储存备用。 g、4?离心10 2(2(8(2 Lowry法测蛋白含量 serumalbumin，BSA 100 取 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 牛血清白蛋白 bovine ml蒸馏 mg，溶于10 水中，从中取出250 ml蒸馏水，配成250 pl，加入9(75 rtg,ml的BSA原液。蛋白 标准品BSA做系列稀释为:250、200、150、100、50和0 rtg,ml。样本按1:50稀 释 可根据蛋白浓度调整稀释比例 。标准品和样品100肛1分别加500gl试剂甲 用 前将A液50份与B液1份混合 ，每分钟加一个样，混合后室温放置10min;再 加50“l试剂乙 即Folin酚试剂 ，每分钟加一个样，立即摇匀 否则显色 降低 ( 30min后测定在650ntll波长下的吸收值 A ，每分钟测一个样本(以A为纵坐 标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。查标准曲线，求蛋白含量乘以稀释倍数， 即为样品的蛋白含量。 2(2(9Westernblot检测 2(2(9(1试剂 8(8 :18(2 M 1 1(5 Tris溶于适量去离子水中，加入1 M"Iris―HCI缓冲液 pHg HCl24ml混匀，再用1MHCI调至PH8(8，定容至100 ml，过滤后，4?储存备 用。 2 O(5MTris(HCl缓冲液 PH6(8 :6(0 M gTris溶于适量去离子水中，加入1 10 浙江大学硕士学位论文 实验材料与方法 HCl48 M ml混匀，再用lHCl调至PH8(8，定容至100ml，过滤后，4"C储存 备 用。 3 封闭液:1×TBS，含0(05,Tween(20，5,脱脂奶粉。 L :"Iris(base3(03 ml10, SDS 。 4 电泳缓冲液 1 g，甘氨酸14(49，O(1,SDS 10 L :Tris―base3(03 ml。 5 转膜缓冲液 1 g，甘氨酸14(4g，甲醇150 2(2(9(2步骤 1 SDS(PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 子水封口，室温放置30min凝固后加入4,的浓缩胶，再室温放置30min。 将样 6(8， 本 含35嵋总蛋白 与5×SDS凝胶上样缓冲液 250mmol,L"Iris(HCLpH min，上 25,D(巯基乙醇，10,SDS，0(25,溴酚兰，50,甘油 混合，水浴煮沸5 样。浓缩胶电泳程序:80V、30min，分离胶电泳程序:100V、60min。 75V、90min。 3 封闭:取出PVDF后，于室温在封闭液 1 mlTBS-T g脱脂奶粉溶解于20 中封闭过夜，以阻断非特异结合。 GAPDH抗体l:5000稀释 ，室温2 min ×3;与二抗杂交 1:4000稀释 ，室温1 min×3。 膜，10 5 化学发光法曝光，显色:将化学发光液等量混合后加至膜上，室温1(5min， 吸去膜上液体，置于暗盒中，立即于暗室装入Kodak胶片，曝光1(5min，进行显 影、定影。 6 结果观察:标记胶片目的条带，扫描保存、分析( 2(2(10细胞周期检测: 细胞接种于6孔板中培养，不同浓度的ORl分别处理细胞24h，胰酶消化， 70,酒精固定后，50 A 染色后，流式细胞 I_tg,ml的PI溶液 含1001(tg,mlRNase 仪 BectonDickinson 检测DNA含量。 ll ―――――――_?_--_?―_-I-――??―--??____-?――――-_____?__I-__-__-_-______---_-_――-?_l___-?____?――――――--―――_――――――――――――一浙江大学硕:竺丝堕皇 塞墼丝型皇查鲨一 2(2(11统计分析 实验数据以一X?S(D(表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用 One-wayANOVA post 差异非常明显。 浙江大学硕士学位论文 结果 3结果 3(1ORI抑制前列腺细胞增殖 用不同浓度 10、25、40、60、100 h、24 LNCaP细胞株12h、48h和72 h，CCK-8试剂盒检测细胞存活率。ORI能 并呈显著的时间和浓度依赖性，而相同有效减少三株株细胞的细胞存活率， 剂量 h的 IC50约为25 gmoVL，作用DUl45细胞的IC50约为40pmol,L。因此，我们选择 下游研究对象，以251(tmol,L为作用浓度，研究ORI处理前后前列腺癌细胞的生 物学变化。 25 pmol,LORI作用PC(3和LNCaP细胞，光学显微镜下定时观察细胞形态。 我们发现作用时间为24h时，细胞密度较对照组小，但形态未发生显著变化;ORI 作用时间延长至48h后，不但细胞数量明显减少，且大部分细胞形态变圆，体积 缩小，部分细胞漂浮于培养基qa Fig(3 。本实验结果表明ORI抑制前列腺癌细胞 株增殖。PI染色流式细胞仪检测细胞周期发现，在PC(3细胞中，25 ORI Iamol,L 21(044-3(76,to 处理24h导致G2,M期的细胞数量增加 from 37(50-a:7(43, ，相似 的结果在ORI处理的LNCaP细胞中也可以观察到 from11(88士0(64,to 提示ORI处理24 h细胞尚未发生晚期凋亡 Fig(4 (这些结果表明，ORI处理能 显著抑制前列腺癌增殖，并诱导其发生G2,M期周期阻滞。 浙江人兰堡!:兰垡笙茎―――生 ――――――_―――――――-――――――――――――――――ll――――――――――-?――――――――――――――――――一一一- 一 A