高分辨三重四极杆质谱定量测定复杂基体中目标肽新方法（可编辑）

高分辨三重四极杆质谱定量测定复杂基体中目标肽新方法（可编辑） 高分辨三重四极杆质谱定量测定复杂基体中目标肽新 方法 Application 高分辨三重四极杆质谱定量测定复杂基体中目标肽的新方法 Note: 412_C Reiko Kiyonami, Scott Peterman, Rosa Viner, Amol Prakash, and Vlad Zabrouskov Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA 前言 从而提高了 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 信号的质量。大多数商品 目前一般生物标志物实验的终点是发现公认 化仪器采用单位分辨(0.7 FWHM)进行 的标志性蛋白名单,接下来的一步就应该是 母离子选择。Thermo Scientific生产的TSQ 在扩展患者群体内完成对这些靶向蛋白的定 Quantum Ultra质谱仪是唯一可以进行高分 量测定,以评价它们作为标志物的有效性。 辨(0.2 FWHM)母离子选择的三重四极杆 对这些在复杂基体中的靶向蛋白进行可靠的 质谱仪,可以采用高选择性反应监测模式 关 键 词 定量分析,其分析准确度和精密度是必需 (H-SRM)。这就极大的降低了背景化合TSQ Quantum 的。对低丰度蛋白质进行高通量检测,对于 物的干扰,并保证了高传输效率7。此外, Ultra H-SRM workflow 宽动态范围、高灵敏度和稳健易用性都有 该仪器可以监测LC运行中超过每秒300组QED-MS/MS 严格的要求。基于串连质谱的选择反应监测 H-SRM离子对,并采用定量增强数据关联Targeted 4 (SRM) 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 ,对于复杂生物基体中所研 扫描QED-MS/MS来进行肽序列鉴定 。这 Quantitative Proteomics 究蛋白的特异肽可以进行高灵敏度和高选择 些独特的优点使得TSQ Quantum Ultra质谱 性的定量,同时也可以独立进行生物标志物 仪成为定量分析蛋白质组的理想仪器。 1-4 验证 。该方法的主要优点是具有很低的检 测限,即,该方法可以在具有高化合物背景 本文验证了TSQ Quantum Ultra 质谱仪在用 的复杂基体中检测低浓度水平肽,同时保证 于人血清酶解液中待测肽的定量分析时, 良好的定量准确度和精密度。 显示出高选择性和高灵敏度的优势。研究 建立了通过高分辨率的母离子分离和目标 由于大多数标志性蛋白没有标准品可用,所 肽多碎片离子时间序列检测,同时进行目 以,为进行蛋白定量有必要对SRM实验中 标肽的鉴定和定量的测定方法。将该方法 所出现的峰进行鉴定。传统实验中,经常应 与传统的SRM模式MS/MS肽定量检测方法 用SRM模式MS/MS 全扫描,通过数据库搜 进行了对比,其中,TSQ Quantum Ultra质 5 索,对目标肽进行鉴定 。得到全扫描MS/ 谱仪采用定量增强数据关联扫描QED-MS/MS质谱图的另外一个好处是可以对选择母 MS方法,4000 Q TRAP 质谱仪Applied 离子-子离子对的方法进行改进,获得最大 Biosystems, Foster City, CA 采用多反应监 灵敏度。然而,当肽峰和基体中的同分子量 测模式增强子离子扫描(EPI MS/MS)方 干扰物产生共流出时,就影响了MS/MS扫 法。H-SRM方法的分析精密度和应用TSQ 2 描图谱的质量 。相较于SRM实验而言,该 Quantum Ultra/4000 Q TRAP质谱仪的SRM 方法的检测限也较高。另外,在一个LC运 方法分析精密度在相同的离子对和驻留时间 行周期中,该方法对肽同时进行鉴定和 条件下做了对比评价。最后对H-SRM方法 定量的循环时间过长,因而其应用受到 的定量准确度也进行了评价。 5 了限制 。 实验目标 另一个鉴定目标肽的方法是增加监测的每个 为进行复杂基体中生物标志物的验证和确 肽产生的b-或者y-型离子的数目6。该方法 认,建立一种快速、稳定的H-SRM工作方 应用三级四极杆质谱SRM模式,通过搜索 法,来准确定量分析多种靶向蛋白。 标记物来对导向肽进行可靠的鉴定,在灵敏 度、工作循环时间和选择性方面都很好,获 实验条件 得了最佳检测结果。 样品制备 将25μL人血清(Sigma Corp., St. Louis, 两种方法的成功都取决于仪器选择母离子 MO)用975μL 浓度为100mM的碳酸氢铵 的能力。二者均需要母离子通过离子中性 缓冲液40倍稀释,超滤处理(截留分子量 碰撞穿过第一级质量分析器Q1离解。这 10,000 MW),酶消化。将消化液真空干 样,干扰化合物穿过Q1时的时候被削减, 燥,并在250μL0.1%甲酸(10倍稀释)水 Q2, 1.5mTorr;驻留时间, 溶液里重组。 10 ms 2定量增强数据关联扫描QED-MS/MS: 根据扫描1的 液相条件母离子关联扫描;信号阀值 5,000 与 T S Q Q u a n t u m U l t r a 联 用 的 纳 流 高 效 液 相Q1和Q3, 0.7 FWHM; Q2, 1.5 mTorr; (Nano-HPLC)CE, 0.034×母体质量m/z + 3.134;动态 泵:Thermo Scientific生产的 Surveyor? MS 泵排除: 重复, 2; 持续时间, 60s;排除时 (配有MicroAS自动进样器)间, 60s;排除名单大小,50;循环时间, 色谱柱:75μm×100 mm C183.84s。 Post-split流速: 300nL/min 4000 Q TRAP*质谱仪 流动相:A:0.1% 甲酸的2%乙腈溶液NanoSpray 纳流离子源B:0.1% 甲酸的乙腈溶液 多反应监测(MRM): Q1, 0.7 FWHM;Q3, 0.7 线性梯度淋洗: 90分钟内,2% B升为50% B FWHM; 进样: 2μL,直接进样色谱柱 Q2, 高压驻留时间,20ms, 与4000 Q TRAP联用的纳流高效液相(Nano- 10ms, 5ms HPLC) EPI MS/MS: 泵:Eksigent? nanoHPLC,配有集成自动进样器 1多反应监测扫描(MRM): Q1和Q3,0.7 FWHM ; 色谱柱:100μm×100 mm C18 Q2,高压;驻留时间, 流速: 300nL/min 10 ms; 流动相:A:0.1% 甲酸的2%乙腈溶液 2增强子离子扫描EPI MS/MS: 扫描1产生的母离子质 B:0.1% 甲酸的乙腈溶液 量值DD; 信号阀值, 3000 cps Q1; 线性梯度淋洗: 90分钟内2% B~50% BQ1和Q3, 低分辨1.5 FWHM; Q2, 高 压; 进样: 2μL,直接进样色谱柱CE, 30(spread 6);动态填充, 开;重复, 1; 排 除时间,60s; 循环时间, 6.5s。 质谱条件 数据库搜索 TSQ Quantum Ultra质谱仪为方便检测结果比较,所有的数据采用Mascot 数 据 仪器:Thermo Scientific Ion ? 离子源,配有纳 软件Matrix Sciences处理,使用SwissProt数据库分 流柱接头(New Objective) 类:人类,搜索参数如下: 高选择性反应监测(H-SRM): Q1, 0.2 FWHM; Q3, 质量值:单一同位素 0.7 FWHM 蛋白质量:未受限制 选择反应监测(SRM): Q1, 0.7 FWHM;Q3, 0.7 肽质量允许误差:?1.2Da FWHM 碎片质量允许误差:?0.6DaQ2, 1.5mTorr;驻留时间: 无遗漏酶解片断 20 ms, 10 ms, 5 ms; 仪器类型:ESI-Quad 318种跃迁H-SRM实验中驻 报告最高匹配数:自动 留时间为5 ms,循环时间2.2 s *4000 Q TRAP质谱仪根据Whetton等人5的操作及4000 Q TRAP 定量增强数据关联扫描QED-MS/MS:操作手册,由独立第三方实验室中经过SCIEX 培训,具有资质 1选择反应监测扫描SRM: Q1和Q3, 0.7 FWHM; 的操作人员操作。 图1:SRM工作软件中肽选择和SRM离子对参数设置肽选择和SRM离子对参数设置 肽序列中不包含Cys、Met或者其他通常的 ? 有两种进行肽选择和SRM离子对参数设置 重组残留,其质量范围为800 2400Da(50 的基本方法3。如果靶向蛋白曾经在以前 种肽,见表1)。每种肽产生的五到七种y- 的LC-MS/MS实验中被检测过,该蛋白产 型离子,共有318组H-SRM离子对。因为 生的特异肽就被选出,用于随后的SRM实 H-SRM方法没有全扫描MS/MS数据,所以 验。相反,如果没有LC-MS/MS数据可以 有必要确定所选择的y-离子可以专一的确 用于靶向蛋白,肽选择和SRM实验设置则 认一个目标肽。我们使用Mascot Sequence 使用已知的蛋白序列(模拟方法)在电脑中 Query在SwissProt人类数据库中搜索所选 完成。我们开发了一个用于靶向蛋白定量的 择的y-离子和每种肽的一个母离子,确认 SRM工作软件,它可以用于预测候选肽, 每个目标肽是特异的,并且有很高的得分 并可以为SRM选择多碎片离子,从而建立 (peptide score)。当采用QED-MS/MS 仪器方法和序列文件,并可自动进行肽鉴定 或者EPI MS/MS方法鉴定目标肽时,触发 和定量数据处理(见图1)。本文所述所有 MS/MS采集的SRM扫描监测到每个肽产 SRM实验都使用了该软件。 生了2-4个y-型离子(共152种SRM离子 我们的第一个目标是评价H-SRM实验方法 对)。 的灵敏度优势。通过检测每个肽产生的特殊 我们的另一个目标是,在不同驻留时间下, 的多碎片离子的时间序列,可靠的检测出目 通过对比H-SRM方法(使用TSQ Quantum 标肽。该方法和传统的SRM-MS/MS全扫 U l t r a 质 谱 仪 ) 、 S R M 方 法 ( 使 用 T S Q 描用于鉴定肽的方法(TSQ Quantum Ultra Quantum Ultra)和MRM方法(使用 4000 质谱仪采用的QED-MS/MS方法和4000 Q Q TRAP)的实验结果,来评价H-SRM 实 TRAP质谱仪采用的EPI MS/MS方法)进行 验方法定量的重现性和准确度。 在这些实验 了对比。选择了24种血浆浓度从3.40E5pg/ 中,选择了不同浓度的13种血 清蛋白进行了 mL 玻连蛋白到1.25E9pg/mL 触珠蛋白的 检测。共设计了代表这些蛋白质 的20种特异 血清蛋白作为样品9。一到四种蛋白代表肽 肽的61组SRM离子对。 1,3,4被用于监测每种靶向蛋白。所选择的 Pr oteins of inte r estPeptide selection and H-SR M as say design. Pr evi ousl y detected i n di scover y ex peri m ent s? Yes No M S/ M S data f r om the di sc over y SRM w orkf l ow soft w are perf orms experiments are used. in silico digest of the proteinM ul t i pl e SRM t r ansition s and optimal f r agmentation condition s are created and exported to the TS Q Quantum Ultra for generatio n of sequence and i nst r umen t methods w i th SRM wo r kf l ow sof t w ar e. Highly selective reaction m onitoring H-S RM experiment is performedPeptide detection and quant itation using time alignment of the monitored multiple fra m g ent i ons from each peptid e followed by peak area/ height integration图2: 同时进行肽检测和定 量的H-SRM工作流程Multiple H-SRM QED-MS/MS EPI MS/MS TSQ Quantum Ultra TSQ Quantum Ultra* 4000 Q TRAP* 1 Alpha-1-acid-glycoprotein2 WFYIASAFR 55.24 TEDTIFLR 36.68 2 Alpha-2-antiplasmin LGNQEPGGQTALK 25.65 FDPSLTQR 29.80 X 3 Alpha-2-HS-glucoprotein HTLNQIDEVK 26.27 FSVVYAK 31.03 4 AMBP ETLLQDFR 42.73 5 Appoliprotein M AFLLTPR 36.58 X WIYHLTEGSTDLR 42.22 X 6 Apolipoprotein H ATVVYQGER 18.96 EHSSLAFWK 36.27 X 7 ApoliproteinL1 NEADELR 17.09 X VAQELEEK 17.78 8 Human coagulation TEQAAVAR 32.03 X X factor XII EQPPSLTR 24.38 9 Complement component VDFTLSSER 37.17 4A preproprotein DSSTWLTAFVLK 67.72 X DFALLSLQVPLK 68.19 VGDTLNLNLR 41.22 X 10 Complement component 1 LLDSLPSDTR 50.54 X X inhibitor precursor TNLESILSYPK 49.50 X X 11 Complement component1, TINVPLR 33.60 X X s sub component EDTPNSVWEPAK 35.87 12 Complement factor B YGLVTYATYPK 41.55 STGSWSTLK 27.77 EELLPAQDIK 38.65 13 C-type lectin domain NWETEITAQPDGGK 40.42 X X family 3, member B LDTLAQEVALLK 54.10 14 Gelsolin isoform b HVVPNEVVVQR 29.32 TGAQELLR 26.98 PALPAGTEDTAK 27.29 X X 15 Haptoglobin TEGDGVYTLNDK 30.86 VGYVSGWGR 33.55 16 Hemoglobin alpha chain VGAHAGEYGAEALER 30.58 X X 17 Hemopexin NFPSPVDAAFR 45.50 18 Histidine-rich glycoprotein DGYLFQLLR 60.97 QIGSVYR 19.16 19 Inter-alpha-trypsin AAISGENAGLVR 30.37 X inhibitor heavy EVAFDLEIPK 52.24 LDAQASFLPK 39.53 X 20 Kininogen 1 TVGSDTFYSFK 40.83 X QVVAGLNFR 37.73 DFVQPPTK 29.97 X X 21 Plasma kallikrein VSEGNHDIALIK 30.86 X X 22 Serum amyloid VGEYSLYIGR 40.41 P-componenet IVLGQEQDSYGGK 31.70 23 Vitronectin VDTVDPPYPR 33.10 X X FEDGVLDPDYPR 42.36 24 Zinc alpha-2-glycoprotein 1 AGEVQEPELR 28.19 EIPAWVPFDPAAQITK 61.47 X X 表1:代表24种靶向蛋白的50种肽的氨基酸序列和持续时间以及三种方法 所鉴定肽的结果比较 结果和讨论 采用H-SRM 318组 H-SRM实验为2.2妙, H-SRM目标肽定量方法评价 驻留时间设为5ms缩短了工作循环时间, 所提出的H-SRM工作流程如图2所示。高 使得在一个LC流程内不仅可以同 时进行肽 分辨分离0.2FWHM的主要优势是它从复 的鉴定和定量,而且还最大程度保证了检 杂基体中选择性检测低丰度肽峰的能力3。 测灵敏度。为了评价H-SRM方法的优势, 通过监测在同一持续时间内选择的多种碎片 我们用三个不同实验分别检测了代表24种 离子,完成对肽的鉴定。该方法没有限定对 人类血清蛋白的50种肽(见表1)。前两个 每种肽可以选择的碎片离子的数目。一般而 实验使用了两个高性能的串连质谱(TSQ 言,每种肽选择4-7种y-型离子足以保证 Quantum Ultra和4000 Q TRAP质谱仪)采 实验的高度专一性。对高分辨母离子分离的 用传统的SRM全扫描MS/MS方法检测。每 增强选择性避免了费时的全扫描MS/MS。 个SRM测试使用了152组传输(每种肽2-3种离子对,每种蛋白1-4种肽)。第三个 TRAP质谱仪获得的MS/MS数据也分别使用实验没有采用数据关联全扫描MS/MS,使用 SEQUEST 和Mascot在同样的SwissProt数 了318组SRM传输(5-7)每种肽5-7种离 据库进行了搜索。ProteinPilot因为实验缺 子对,每种蛋白1-4种肽。为评价H-SRM 少电荷状态数据而给出了很差的结果;而由 方法消除血清背景离子干扰的能力,此实验 Mascot给出的结果较好一些。表2和表3分 采用了高分辨0.2 FWHM和单位分辨0.7 别总结了Mascot得到的使用TSQ Quantum FWHM两种方式。 Ultra质谱仪的QED-MS/MS实验数据和 使用4000 Q TRAP质谱仪的EPI MS/MS 图3是使用TSQ Quantum Ultra质谱仪的 实验数据的搜索结果。两个实验从24种靶 QED-MS/MS实验(上图)和使用4000 Q 向蛋白中都确认出21种蛋白(补体成分1 TRAP质谱仪的EPI MS/MS实验(下图)的 抑制剂、血浆激肽释放酶和血红蛋白α链 全离子流质谱图。TSQ Quantum Ultra质谱 P0.05没有鉴定出来)。然而,使用TSQ 仪获得的MS/MS数据分别使用SEQUEST Quantum Ultra质谱仪(共确定36种肽)比 和Mascot在SwissProt数据库进行了搜索, 4000 Q TRAP质谱仪(共32种肽)多鉴定 两种搜索引擎给出了相似的结果。4000 Q 出四种肽。 TSQ Quantum Ultra 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 4000 Q TRAP 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time min 图3:使用TSQ Quantum Ultra质谱仪的QED-MS/MS实验(上图)和使用4000 Q TRAP质谱仪的EPI MS/MS实验 (下图)中50种肽的总离子流质谱图Protein Protein Pep Pep Pep Pep Peptide Hits Protein Description Score Rank Exp m/z Exp Mr Calc Mr Score Sequence 1 CO4A_HUMAN Complement C4-A precursor 167 1 527.26 1052.51 1052.51 30 VDFTLSSER 1 557.82 1113.63 1113.61 50 VGDTLNLNLR 1 672.40 1342.79 1342.79 48 DFALLSLQVPLK 1 684.36 1366.71 1366.71 34 DSSTWLTAFVLK 2 HPT_HUMAN Haptoglobin precursor 115 1 490.75 979.49 979.49 36 VGYVSGWGR 1 656.31 1310.61 1310.60 80 TEGDGVYTLNDK 3 ITIH1_HUMAN Inter-alpha-trypsin 1 04 1 545.30 1088.59 1088.59 32 LDAQASFLPK inhibitor heavy chain H1 precursor 1 580.81 1159.61 1159.61 24 EVAFDLEIPK 1 579.32 1156.63 1156.62 48 AAISGENAGLVR 4 KNG1_HUMAN Kininogen-1 precursor 102 2 502.29 1002.57 1002.56 11 VVAGLNFR 1 626.30 1250.59 1250.58 92 TVGSDTFYSFK 5 GELS_HUMAN Gelsolin precursor 83 1 444.25 886.49 886.49 49 TGAQELLR 1 638.34 1274.67 1274.71 34 HVVPNEVVVQR 6 FETUA_HUMAN Alpha-2-HS-glycoprotein precursor 81 1 407.23 812.45 812.44 24 FSVVYAK 1 598.82 1195.63 1195.62 57 HTLNQIDEVK 7 SAMP_HUMAN Serum amyloid P-component precursor 59 1 578.80 1155.59 1155.59 10 VGEYSLYIGR 1 697.35 1392.69 1392.69 49 IVLGQEQDSYGGK 8 A1AG1_HUMAN Alpha-1-acid glycoprotein 1 precursor 55 1 497.76 993.51 993.51 43 TEDTIFLR 1 580.81 1159.61 1159.58 11 WFYIASAFR 9 CFAB_HUMAN Complement factor B precursor 54 1 483.75 965.49 965.48 10 STGSWSTLK 1 578.32 1154.63 1154.62 22 EELLPAQDIK 1 638.34 1274.67 1274.65 23 YGLVTYATYPK 10 APOL1_HUMAN Apolipoprotein-L1 precursor 37 1 473.25 944.49 944.48 37 VAQELEEK 11 HRG_HUMAN Histidine-rich glycoprotein precursor 40 1 411.73 821.45 821.44 14 QIGSVYR 2 562.81 1123.61 1123.60 26 DGYLFQLLR 12 APOH_HUMAN Apolipoprotein H 40 1 511.77 1021.53 1021.52 26 ATVVYQGER 1 552.78 1103.55 1103.54 14 EHSSLAFWK 13 HEMO_HUMAN Hemopexinprecursor 34 1 610.81 1219.61 1219.60 34 NFPSPVDAAFR 14 AMBP_HUMAN AMBP protein precursor 32 1 511.27 1020.53 1020.52 32 ETLLQDFR 15 C1S_HUMAN Complement C1s subcomponent precursor 25 1 686.82 1371.63 1371.63 25 EDTPNSVWEPAK 16 APOM_HUMAN Apolipoprotein M 24 1 409.25 816.49 816.49 24 AFLLTPR 17 ZA2G_HUMAN Zinc-alpha-2-glycoprotein precursor 19 1 564.29 1126.57 1126.56 19 AGEVQEPELR 18 VTNC_HUMAN Vitronectin precursor 1 8 1 711.83 1421.65 1421.65 18 FEDGVLDPDYPR 19 TETN_HUMAN Tetranectin precursor TN 17 1 657.39 1312.77 1312.76 17 LDTLAQEVALLK 20 A2AP_HUMAN Alpha-2-antiplasmin precursor 15 1 656.85 1311.69 1311.68 15 LGNQEPGGQTALK 21 FA12_HUMAN Coagulation factor XII precursor 15 1 464.25 926.49 926.48 15 EQPPSLTR 表2:Mascot对QED-MS/MS实验中TSQ Quantum Ultra质谱仪获得数据在 SwissProt数据库中的搜索结果。24个蛋 白中有21个被鉴定。Protein Protein Pep Pep Pep Pep Peptide Hits Protein Description Score Rank Exp m/z Exp Mr Calc Mr Score Sequence 1 CFAB_HUMAN Complement factor B precursor 137 1 483.80 965.59 965.48 43 STGSWSTLK 1 578.30 1154.59 1154.62 26 EELLPAQDIK 1 638.30 1274.59 1274.65 68 YGLVTYATYPK 2 SAMP_HUMAN Serum amyloid P-component precursor 115 1 578.80 1155.59 1155.59 53 VGEYSLYIGR 1 697.40 1392.79 1392.69 62 IVLGQEQDSYGGK 3 HPT_HUMAN Haptoglobin precursor 109 1 490.80 979.59 979.49 26 VGYVSGWGR 1 656.30 1310.59 1310.60 83 TEGDGVYTLNDK 4 GELS_HUMAN Gelsolin precursor 85 1 444.30 886.59 886.49 39 TGAQELLR 1 638.40 1274.79 1274.71 46 HVVPNEVVVQR 5 FETUA_HUMAN Alpha-2-HS-glycoprotein precursor 85 1 407.20 812.39 812.44 32 FSVVYAK 1 598.80 1195.59 1195.62 53 HTLNQIDEVK 6 A2AP_HUMAN Alpha-2-antiplasmin precursor 78 1 407.20 812.39 812.44 31 FDPSLTQR 1 598.80 1195.59 1195.62 48 LGNQEPGGQTALK 7 A1AG1_HUMAN Alpha-1-acid glycoprotein 1 precursor 78 1 497.80 993.59 993.51 42 TEDTIFLR 1 580.80 1159.59 1159.58 36 WFYIASAFR 8 APOL1_HUMAN Apolipoprotein-L1 precursor 77 2 423.70 845.39 845.39 39 NEADELR 1 473.30 944.59 944.48 38 VAQELEEK 9 CO4A_HUMAN Complement C4-A precursor 76 1 527.30 1052.59 1052.51 37 VDFTLSSER 1 672.40 1342.79 1342.79 30 DFALLSLQVPLK 10 AMBP_HUMAN AMBP protein precursor 59 1 511.30 1020.59 1020.52 59 ETLLQDFR 11 ITIH1_HUMAN Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H 56 1 580.80 1159.59 1159.61 56 EVAFDLEIPK 12 TETN_HUMAN Tetranectin precursor TN 55 1 657.40 1312.79 1312.76 55 LDTLAQEVALLK 13 C1S_HUMAN Complement C1s subcomponent precursor 51 1 686.80 1371.59 1371.63 51 EDTPNSVWEPAK 14 VTNC_HUMAN Vitronectin precursor 44 1 711.80 1421.59 1421.65 44 FEDGVLDPDYPR 15 ZA2G_HUMAN Zinc-alpha-2-glycoprotein precursor 39 1 564.30 1126.59 1126.56 39 AGEVQEPELR 16 HRG_HUMAN Histidine-rich glycoprotein precursor 37 1 562.80 1123.59 1123.60 37 DGYLFQLLR 17 HEMO_HUMAN Hemopexin precursor 34 1 610.80 1219.59 1219.60 34 NFPSPVDAAFR 18 APOH_HUMAN Appoliprotein H 31 1 511.80 1021.59 1021.52 31 ATVVYQGER 19 APOM_HUMAN Apolipoprotein M 29 1 531.10 1590.28 1589.78 29 WIYHLTEGSTDLR 20 FA12_HUMAN Coagulation factor XII precursor 24 1 464.30 926.59 926.48 24 EQPPSLTR 21 KNG1_HUMAN Kininogen-1 precursor 18 1 502.30 1002.59 1002.56 18 QVVAGLNFR 表3:Mascot对EPI-MS/MS实验中4000 Q TRAP质谱仪获得数据在SwissProt 数据库中的搜索结果。24个蛋白中有21 个被鉴定。 4000 Q TRAP质谱仪在Q1和Q3中都必须 宽度0.7 FWHM的QED-MS/MS谱, 图5 使用低分辨率分离1.5 FWHM,以获得灵 (b)为m/z 684.4(分离宽度1.5FWHM 的 2,5 敏的全扫描MS/MS谱 ;与之不同的是, EPI MS/MS谱。QED-MS/MS谱与Mascot TSQ Quantum Ultra质谱仪可以应用单位质 匹配很好,鉴定了导向肽 DSSTWLTAFVLK 量分辨0.7 FWHM母离子分离或者采用高 Mascot P-score为34。而4000 Q TRAP 分辨0.2 FWHM母离子分离,都可以获得 测得的EPI MS/MS谱则受到同重母体的污 灵敏的QED-MS/MS谱。图4是两例SRM 染,图谱质量很差Mascot P-score为5, 引发的QED-MS/MS图谱和SEQUEST搜索 而无法鉴定同一种肽。过长的循环时间也 结果(a:高丰度触珠蛋白;b:低丰度玻 是EPI MS/MS方法(EPI MS/MS为6.5 s, 连蛋白)。两种目标肽(TEGDVGYTLNDK QED-MS/MS为3.8 s)的另外一个不利条 和FEDGVLDPDYPR)都得到了可靠的确 件。这就解释了为什么使用TSQ Quantum 认。当采用较高分辨率0.7 FWHM母离子 Ultra质谱仪的QED-MS/MS方法(50个中 分离时,同量异位共流出物产生的碎片对 识别36个)比使用4000 Q TRAP质谱仪的 全扫描MS/MS谱的污染较小,从而显著的 EPI MS/MS方法(50个中识别32个)识别 提高了图谱的质量。这一点在图5中得到 出更多的肽(见表2和表3)。 清楚的体现:图5(a)为m/z 684.4(分离a SRM traces of 30.86 100 m/z 656.3 2+ 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time min 202.96 100 230.96 90 753.31 80 1081.49 70 60 50 40 590.32 167.84 30 909.41 376.24 139.98 489.31 20 288.15 1024.40 541.18 442.10 340.85 647.21 10 84.13 852.56 686.55 1165.63 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z b SRM traces of m/z 711.83 2+ 43.35 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 Time min 647.08 100 90 80 249.08 70 60 50 1202.46 40 276.96 355.14 762.30 30 875.31 435.18 119.85 825.73 1146.80 20 217.04 682.11 446.34 1009.68 10 1244.02 596.62 85.77 1089.59 1315.21 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 图4:QED-MS/MS鉴定目标肽两例。插图为SEQUEST搜索结果。 a QED-MS/MS 实验获得的代表触珠蛋白1.25mg/mL,血浆中9的TEGDGVYTLNDK肽的SRM图谱 b QED-MS/MS 实验获得的代表玻连蛋白340ng/mL,血浆中9的FEDGVLDPDYPR肽的 SRM图谱 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance+1 y y 8 977.4 100 67.42 100 +1 90 y y SRM Traces of 6 80 678.4 90 m/z 684.4 2+ 70 60 50 80 a 40 30 20 70 10 QED-MS/MS of 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Time min +2 m/z 684.4 2+ +1 60 y y 4 y y 3 +1 254.0 359.5 b b 4 391.0 50 +1 +1 b b y y 7 7 40 791.2 791.2 +1 y y 10 30 +2 1165.6 y y +1 11 y y +1 4 627.0 b b 2 +1 506.5 y y 203.0 9 20 1078.5 10 0 0 200 400 600 800 1000 1200 m/z 914.1 6.9e6 2.5e4 2.3e4 MRM Traces of 6.5e6 2.1e4 1.9e4 m/z 684.4 2+ b 1.7e4 6.0e6 1.5e4 1.3e4 5.5e6 1.1e4 EPI MS/MS of 9000.0 5.0e6 7000.0 m/z 684.4 2+ 5000.0 4.5e6 3000.0 1000.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4.0e6 Time min 3.5e6 3.0e6 2.5e6 + y 685.1 8 2.0e6 977.8 + y + y 6 7 970.5 678.5 791.5 1.5e6 699.9 458.3 671.5 1194.8 373.2 756.5 1.0e6 541.3 316.2 414.2 514.2 820.9 1123.7 1082.6 1398.9 5.0e5 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 m/z 图5:使用TSQ Quantum Ultra 质谱仪测得的QED-MS/MS母离子(m/z 684.4 +2) 谱(a)和4000 Q TRAP 质 谱仪测得的EPI MS/MS谱(b)的对比。高品质的QED-MS/MS方法可靠的鉴定了补体成分4A前原蛋白产生的 DSSTWLTAFVLK肽,其Mascot P-score为34(a);而 EPI MS/MS图谱因为碎片离子的污染而没能成功鉴定,其 Mascot P-score仅为5(b)。 Intensity, cps Relative Abundance Intensity, cps Relative Abundance尽 管 采 用 Q E D - M S / M S 方 法 的 T S Q 来。H-SRM的TIC谱(上图)信号峰信噪 Quantum Ultra质谱仪比4000 Q TRAP质谱 比SRM的TIC谱(下图)相比大约高12倍。 仪多鉴定出几种目标肽,但是,仍然没有 母体通过5种y-离子的时间序列检测得到了 成功识别鉴定血清消化液中所有的50种目 可靠的鉴定;Mascot序列搜索通过这些充 标肽。这主要是由于传统方法在检测复杂 分的数据搜索SwissProt数据库,可以唯一 基体中的低丰度肽具有局限性,尤其是肽 的鉴定该肽(见图7)。该方法无需全扫描 具有共流出的同量异位干扰物时,无法对 MS/MS,具有分辨率分离能力,在低检测 2 其进行可靠鉴定 。从复杂的血清消化液中 限下快速可靠的鉴定目标肽方面具有很明显 鉴定24种蛋白产生的50种目标肽的任务, 的优势。表1总结了三种不同的方法鉴定的 只有用我们新提出的方法才可以完成,该 目标肽。使用TSQ Quantum Ultra 质谱仪 方法采用高分辨分离来检测低丰度肽,并 的QED-MS/MS方法检测出36种肽,使用 用多碎片离子的时间序列来进行肽身份鉴 4000 Q TRAP质谱仪的EPI MS/MS方法检测 定。图6是一种低丰度肽(LLDSLPSDTR代 出32种肽,而采用多碎片离子时间序列检测 表补体组分1抑制剂),传统方法没有将其 的H-SRM方法鉴定了所有的50种肽(见图 鉴定出来,H-SRM方法则将其成功鉴定出 8)。 558.80/575.28 y5 MH: 4630 558.80/688.36 y6 MH:1330 RT: 35.43 MH: 16959 SN: 342 558.80/775.39 y7 MH: 446 100 90 H-SRM 80 558.80/890.42 y8 MH: 10168 70 Q1: 0.2 FWHM, 60 558.80/1003.51 y9 MH: 385 50 5 ms dwell time 40 30 33.0 34.0 35.0 36.0 37.0 38.0 Time min 20 10 0 MH: 35364 SN: 28 100 90 SRM 80 70 Q1: 0.7 FWHM, 60 50 5 ms dwell time 40 30 20 10 0 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 Time min 图6:通过多碎片离子时间序列检测,H-SRM方法鉴定了代表补体组分1抑制 剂蛋白的 LLDSLPSDTR肽。与SRM方法相比,H-SRM方法显著提高了信噪比,降低了血清 基体非 特异性干扰,可以明确的鉴定目标肽。 图7:Mascot序列搜索目标肽LLDSLPSDTR的5种y-型碎片离子的搜索结果 Relative Abundance Relative Abundance55 50 45 50 pep ids 40 35 36 pep ids 30 32 pep ids 25 20 15 10 5 0 Multiple H-SRM QED-MS/MS EPI MS/MS TSQ Quantum Ultra TSQ Quantum Ultra 4000 Q TRAP 图8:三种不同方法鉴定的肽数目对比 较短的循环时间(H-SRM为2.2 s, QED 离子对可以使得该方法进行快速可靠 的方法 为3.9 s, EPI为6.5 s)使得H-SRM方法可 优化。通过采集多种SRM离子 对,最具选 以在一个LC-MS/MS运行过程中,同时进 择性和灵敏度的离子对的测定就变 得简单明 行肽的鉴定和定量。例如318组 H-SRM的 确,可以计算出离子率进行鉴定, 同时给出 分析,在LLDSLPSDTR肽淋洗峰获得14次 了持续时间。 扫描,足够得到重现性良好的定量结果(见 图9)。此外,与传统方法需要获得干净丰 量的全扫描产物离子谱相对照,监测多个子 35.43 100 90 35.50 80 35.36 70 60 35.29 50 35.58 40 35.22 30 35.65 20 35.15 10 0 25 30 40 45 35 Time min 图9:代表补体组分1抑制剂的肽LLDSLPSDTR,在此318 H-SRM实验中进行了14次扫描(驻留 时间5ms) Identified peptides Relative AbundanceH-SRM在不同驻留时间下的方法精密度 信号损失。当驻留时间由20ms降为5ms 在H-SRM实验精密度试验中,测定了为 时,H-SRM方法平均信号损失了12%。 代表13种蛋白的20种特异肽设计的61组离 VGEYSLYIGR肽信号强度变化最大,驻留时 子对(见表4)。使用TSQ Quantum