资料马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展

资料马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展 马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展 第一组:郭保密、尹韵绮、张 岳 摘要:马铃薯茎尖脱毒技术的应用克服了马铃薯的病毒病和类病毒病的危害，是目前解决马铃薯退化最为有效的途径。文章从马铃薯茎尖脱毒的原理、过程以及影响病毒去除的因素等方面进行了综述，以期为马铃薯茎尖脱毒技术的深入研究提供一定的理论依据。 关键词:马铃薯;茎尖脱毒;病毒类型;影响因素 栽培种的马铃薯(Solanum tuberosumL.,2n=48)是双子叶种子植物，属茄科(Solanceae) [1]茄属(Solanum)的一年生草本植物，生产上绝大多数是利用块茎进行无性繁殖。马铃薯栽培种起源于南美洲秘鲁以及沿安第斯山脉智利沿岸、玻利维亚等地，在五大洲140多个国家都有种植和分布。2004年国际马铃薯中心(CIP)和国际食品政策中心(IFPRI)合作研究表明，在世界范围内，到2020年对马铃薯的需求将有望增长40%，超过水稻、小麦和玉米的增 [2]长。特别是在亚洲和非洲，对马铃薯的需求将增长更快。 随着农业产业结构的调整，我国马铃薯的种植面积和总产量也在不断的增加，到2010 2[3]年，我国马铃薯种植面积达到600万hm，产量达到1.8亿t。但在连年的栽培过程中，病毒或类病毒不断的侵染和积累，而病毒在马铃薯植株中是系统感染，能阻碍病毒增殖的药剂往往也会影响寄主植物的代谢系统，到目前为止，还没有像防治病虫害一样能有效防治植物病毒病的化学药剂。病毒的侵染及其在薯块内积累引起了马铃薯的退化，马铃薯退化后一般 [4]减产20%,30,，严重者减产80,以上。随着病情逐年加重，严重者失去发芽能力，最后失去利用价值，给我国马铃薯乃至世界马铃薯生产带来十分严重的危害，使得栽培面积及产 [5]量难以进一步提高。在我国主要侵染马铃薯的病毒有7种，它们是PVX、PVY、PVS、PVM、 [6]PAMV、PAV、PLRV，其余侵染马铃薯的病毒是来自其它寄主植物的病毒。 采用无病毒植株是解决马铃薯退化的有效途径，获得无病毒植株的途径有自然选择、物 [7]理学方法、化学药剂处理和生物学方法。其中最行之有效的方法便是生物学方法中的茎尖脱毒。文章就马铃薯茎尖脱毒培养技术中各个环节的研究进展和影响因素做出综述，以期为马铃薯茎尖脱毒技术的深入研究提供参考。 1茎尖培养脱毒的原理 马铃薯脱毒的方法有多种，其中以茎尖脱毒的效果最好，已成为最常用和经济有效的脱毒方法，其原理是利用病毒在植物体内分布的不均匀性，即根尖和芽尖的分生组织含病毒量少或不含病毒的特性，导致这一现象的原因可能由以下因素引起:(l)分生组织旺盛的新陈代谢活动。病毒的复制须利用寄主的代谢过程，无法与分生组织旺盛的代谢活动竞争;(2)分生组织缺乏真正的维管组织。大多数病毒在植株内通过韧皮部进行迁移，或在细胞间通过胞间连丝传输，因为细胞与细胞间的移动速度较慢，在快速分裂的组织中病毒浓度高峰被推 [8-9]迟;(3)高浓度的生长素。分生组织的生长素浓度通常很高，可能影响病毒的复制。 根据这些原理，Morel等人在1955年以马铃薯为材料，利用茎尖组织培养，获得了无病 [10]毒植株。这个试验的成功，为马铃薯脱毒开辟了新途径。现在几乎所有马铃薯生产国都在使用这种技术，马铃薯脱毒去除了主要病毒，恢复了原品种的特征特性，有效解决了马铃薯退化的问题。 2马铃薯脱毒过程 2.1脱毒种薯生产程序 采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种(或称脱毒小薯)。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。 2.2茎尖培养脱毒 2.2.1取材 一般多采用在室内发芽，芽经热处理(38?)2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70,的酒精浸润组织15-20秒，再用2,的次氯酸钠溶液浸泡4-5min，然后用无菌水冲洗3次。把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1-2个叶原基，0.2—0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA 、 0.2mgGA3、0.5BA，2%蔗糖，p H值5.8。 2.2.2培养条件 温度21~25?、光量2000-3000 lx(勒克斯)、光照12h/d。2-3周愈伤，4-5周绿点，3--6月长成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。 2.2.3继代和生根 培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA(试剂盒)鉴定后(试管苗应每3月检测一次，每年4次)鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。取试管苗单节切段扦插在(或平放)固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右发育成5~10cm高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。 2.2.4驯化 为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度:白天23~27?，夜间不低于14?。炼苗的具体方法是:移植前7d左右，将长有3~5片叶、高2~3cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试管苗，在温室顶上加盖一层黑色遮阳网。 2.3脱毒苗切繁 基础苗成活进入正常后便可切繁，但切繁量的多少和质量的高低，除与前边提到的水与温湿度条件有关外，能否掌握正确的切繁方法和适宜的切繁苗龄也是非常重要的。脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段(主茎芽尖和腋芽芽尖)直接扦插。 3影响病毒去除效率的因素 3.1茎尖大小和病毒种类 马铃薯茎尖培养脱毒的效果与茎尖大小直接相关。由于病毒浓度在茎尖附近呈递减分布， [11]因此茎尖越小脱毒效果越理想，但茎尖越小就越难成活。王秀英研究表明:切取的茎尖大小对茎尖的成活率和脱毒率关系重大，茎尖越小，成活率越低，脱毒率越高;反之，茎尖越 [12]大，成活率越高，脱毒率越低，一般茎尖大小以0.2mm以下为宜。齐恩芳等以甘肃省主栽品种陇薯6号为材料，研究了茎尖大小对马铃薯茎尖培养脱毒效果的影响，结果表明，叶原基数为2的茎尖脱毒效果最好。 由于不同病毒在茎尖分布不同，脱毒的效果也与病毒种类有关。各种病毒的脱除从易到难顺序如下:PLRV、PVA、PVY、PAMV、PVM、PVX、PXS和PSIVd，但此顺序也不是绝对的，会 [13]因品种、培养条件、病毒株系不同等而有所变化。 3.2化学治疗剂的使用 化学治疗剂能提高培养基中去除病毒的能力。如在培养基中加入碱性孔雀绿、2，4-D和硫尿嘧啶等病毒抑制剂，能显著提高产生无病毒植株的百分率。在甘薯茎尖培养脱毒研究中发现，培养基中添加适量的TS制剂(一种病毒钝化剂)虽稍微抑制了茎尖的发育，但可以提 [14]高脱毒率，TS制剂对马铃薯茎尖培养脱毒是否有相同的效果，值得研究和探讨。刘华、冯[15]高采用不同浓度高锰酸钾、过氧化氢、新洁尔灭、尿素稀释液对马铃薯进行浸种处理，发 [16]现病毒钝化明显，用处理过的薯块做种薯，产量明显提高。而Cassells，A.C等将病毒唑加入培养基中，培养马铃薯的分生组织和外植体，可脱除马铃薯的X、Y、S和M病毒。 4培养条件的优化 4.1配制培养基的不同水质 [17]在生产实践中可以用自来水代替蒸馏水配制培养基和降低碳源等措施来降低成本。牛爱国等研究发现，只要pH调到5.8左右用自来水代替去离子水对幼苗生长没什么影响，适当 [18]降低碳源或者用食用白糖代替试剂蔗糖具有相同的效果。但各地自来水水质不同，因此应事先做试验。通过雨水(雪水)、自来水(开水)、蒸馏水的对比试验表明，雨水(雪水)配 [19]制的培养基更利于试管苗快繁，脱毒苗生根量大、茎粗、生长势好。 4.2碳源及其浓度 食用蔗糖与试剂蔗糖具有相同的效果，因此，完全可以用食用蔗糖代替试剂蔗糖作为培 [20]养基的碳源，为了朝着敞开培养迈进，一些研究者在培养基中只加琼脂和大量元素，在室外自然光照下培养，幼苗能够成活，并能生长，只是比有糖的要差得多。而理论推测，其自养能力是比较强的，移栽于土壤中成活率应有所提高。因此较为合理的做法应根据不同的培养条件，适当降低碳源含量。韦莹研究发现，不同蔗糖浓度对芽诱导效果不同，经过试验确 [21]定最佳蔗糖浓度为30mg/L，经此培养的植株生长旺盛，根系发达。在这方面，利用自然光源培养的马铃薯脱毒试管苗，培养基最适碳源浓度为12.5g/L，较人工灯光培养的最适碳源 [22]浓度20g/L减少了1/3，移栽成活率提高了8.91%。 4.3光照与营养元素 只要气温适宜(10?,30?)，在散射太阳光照下(遮阳)幼苗生长比室内灯光下健壮得多，提高移栽的成活率，此外碳源浓度可以较人工灯光培养降低1/3，大大降低了生产成本[23]。试验证明，培养基中除去微量元素也不影响幼苗的生长。至于继代培养，长期缺乏这种元素，是否会使幼苗产生微量元素缺乏症尚无试验证据。而对K+含量的研究表明，KH2PO4的含量在140,155mg/L，培养的试管苗株高合适、粗壮、叶片大，有利于栽培，且栽植成活 [24]率高。 4.4生长调节物质及抗生素 在马铃薯脱毒试管苗生根培养中，通常加BA作为生根诱导剂。在生产中为了缩短培养时间，降低生产成本，可以以低价的生根粉代替BA，培育出的试管苗在生根、生长等方面都优于BA。在简易MS培养基中加入浓度为10,20mg/L的生长延缓剂B9，培育出的试管苗株粗壮、 [25]叶片大，利于栽植，成活率高。而在继代培养试验中，添加适当浓度的Met对苗的增殖有促进效果，浓度以1.0mg/L比较适宜苗的生长。加入0.3mg/L的生长素NAA使苗生长好，生根速度快、条数多。韦莹发现，以6-BA浓度为1.0mg/L和NAA浓度为0.5mg/L配合使用效果比较理想，不仅使苗增殖倍数提高，而且植株比较粗壮，叶片大且浓绿。此外，在培养基中加入抗生素具有抑菌、杀菌和改善脱毒苗根系生长的作用。如果将氯苄青霉素和硫酸链霉素 [26]联合应用，具有更加明显的抑菌效果。当然，生长延缓剂和抗生素的加入与否以及加入量的多少应依具体情况而定。 5展望 综上所述，马铃薯脱毒技术研究尽管在自然选择、物理学、化学、生物学等方面都作了大量研究工作，并取得了较大成绩，但目前最行之有效的方法是生物学方法中的茎尖培养脱毒。而在茎尖培养脱毒过程中，影响茎尖成活、成苗及脱毒效率的因素诸多，尤其是茎尖培养过程中培养基中所加的植物生长调节剂的绝对浓度和配比，及培养基的状态等研究上存在着较大分歧。在茎尖培养脱毒过程中热处理的使用虽然可以显著提高对有些病毒的脱毒率，但热处理法局限性很大，对一些球形病毒处理效果很好(如PLRV)，但对线状病毒及杆状病 ，PVY等病毒)，且在一些温热处理比较敏感的材料应用上，毒处理效果并不是很好(如PVX 存在一定困难。虽然茎尖培养脱毒技术的脱毒效果很好，可是其剥离茎尖的操作必须人工进行，这给工厂化生产无毒苗带来一定困难。因此，有必要对影响茎尖成活、成苗及脱毒过程中的诸多影响因素进行比较系统的研究，寻找更为快速、有效，便于工厂化生产的脱毒方法，为以后的马铃薯脱毒技术人员提供一套切实可行、高效率的脱毒途径。 参考文献 [1]黑龙江农业科学院马铃薯研究所.中国马铃薯栽培学[M].北京:中国农业出版社,1994. 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