盐酸塔斯品碱促进大鼠皮肤创伤愈合及其作用机制的研究_西医学论文

盐酸塔斯品碱促进大鼠皮肤创伤愈合及其作用机制的研究_西医学 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 盐酸塔斯品碱促进大鼠皮肤创伤愈合及 其作用机制的研究_西医学论文 [真诚为您服务] 作者:董亚琳，贺浪冲，王怀荟，尤海生，吴娇芬 【关键词】 盐酸塔斯品碱 ,摘要,目的:研究盐酸塔斯品碱对皮肤创伤愈合的促进作用及其机制。方法: 建立大鼠背部双侧圆形创伤模型，观察创伤创面的愈合时间，测量其面积，检测组 织中羟脯氨酸与蛋白质含量的变化，并进行组织形态学观察。结果:盐酸塔斯品碱 可明显缩短创面的愈合时间。创伤后第3,14天，盐酸塔斯品碱组大鼠创面愈合 率显著高于自身二甲亚砜对照组(P<0.05或P<0.01);创伤后第3,7天，大 鼠创伤肉芽组织中蛋白质含量在盐酸塔斯品碱2 mg/ml组明显高于模型组 (P<0.05)，创伤后第7天蛋白质含量达到峰值，第14,21天逐渐降至正常皮 肤组织的含量水平;创伤后第3,21天，大鼠创伤组织中羟脯氨酸的含量，在盐 酸塔斯品碱组明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)，创伤后第14天羟脯氨酸 的含量达到峰值，第21天接近正常皮肤组织的含量水平。组织形态学结果显示: 在大鼠创伤组织修复早期，盐酸塔斯品碱能够促进新生毛细血管的形成。结论:盐 酸塔斯品碱具有促进大鼠皮肤创伤愈合的作用，其作用机制可能与促进肉芽组织中 新生毛细血管的生成以及蛋白质和胶原的合成有关。 ,关键词,盐酸塔斯品碱; 伤口愈合; 蛋白质类; 羟脯氨酸; 毛细血管 Effect of taspine hydrochloride on skin wound healing in rats and its mechanism ABSTRACT Objective: To study the effect of taspine hydrochloride (TA/HCl) on skin wound healing in rats and its mechanism. Methods: Bilateral round wounds were made on the backs of SD rats. The effect of TA/HCl on the skin wound was evaluated through determining closure time and contracting ability of the skin wound, observing histopathological characteristics and measuring contents of hydroxyproline (Hyp) and protein in the wound tissue. Results: The closure time of the skin wounds was significantly shorter in the TA/HCltreated groups than that in the model group. The percentages of wound contraction were higher in the TA/HCltreated groups than that in the dimethyl sulfoxide (DMSO) control group of the same group(P<0.05 or P<0.01) on the 3rd to 14th days after wounding. The content of the protein in the wound tissue in the TA/HCltreated group (2 mg/ml ) was higher than that in the model group (P<0.05) on the 3rd to 7th days after wounding, and it arrived at the peak on the 7th day and gradually decreased to the normal level in skin tissue on the 14th to 21st days after wounding. The contents of Hyp in the wound tissues in the TA/HCltreated groups were higher than that in the model group (P<0.05 or P<0.015) on the 3rd to 21st days after wounding, and they arrived at the peak on the 14th day and at the normal level in skin tissue on the 21st day. Histopathological test results showed that TA/HCl could promote the formation of newly born capillaries in the early period of the wound healing. Conclusion: TA/HCl has the ability of promoting skin wound healing in rats, and it can also accelerate the growth of newly born capillaries and raise the production of protein and collagen in wound tissue. KEY WORDS taspine hydrochloride; wound healing; proteins; hydroxyproline; capillaries 红毛七,Leontice robustum (Maxim.) Diels,为小檗科牡丹草属植 物类叶牡丹的根茎，是陕西秦巴山区特有的药用植物，民间用于治疗关节炎和跌打 损伤等,1,。2003年高琨等,2,首次用细胞膜色谱法筛选研究了红毛七有效成 分，发现红毛七中含有的塔斯品碱(taspine)等多种生物碱与血管内皮细胞膜 及成纤维细胞膜有很强的亲合性。国外文献报道，从南美植物巴豆属Croton lechleri中提取的塔斯品碱具有抗炎和促进伤口愈合的作用,3,5,，但其作 用机制尚未完全阐明。本实验从红毛七中分离获得塔斯品碱并制备成盐酸塔斯品碱 (taspine hydrochloride, TA/HCl)，在筛选研究的基础上，以碱性成纤 维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为对照，观 察TA/HCl对大鼠皮肤创伤创面的愈合作用，并对其可能的作用机制进行了初步 的探讨。现报道如下。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 (1)TA/HCl(西安交通大学天然药物研究与工程中心制备，纯度 ,98%)，给药前用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)配制成所需浓 度;(2)bFGF喷雾剂(批号:20030805)，珠海亿胜生物工程制药有限公司 产品;(3)羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)测试盒(批号:20040224) 与考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(批号:20040217)，由南京建成生物工程研究所 提供;(4)DMSO等试验用试剂，均为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。 1.2实验动物 雄性SD大鼠，体质量200,240 g，由西安交通大学医学院 实验动物中心提供(合格证号:陕医动字第08005)。动物常规饲养，室温22,25 ?。 1.3实验方法 1.3.1创伤模型制备 大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，剃去背中部毛，面积约4 cm×5 cm，距脊柱两侧各旁开1.5 cm，在相同部位用特制打孔器切割2个圆形创面，直径约1.8 cm，面积约2.54 cm2，深至皮下，形成机械损伤动物模型,6,7,。造模后大鼠伤口暴露，单笼饲养。 1.3.2给药方法 大鼠造模后随机分为5组:模型组，TA/HCl大、中、小剂量组和bFGF对照组，每组25只。模型组大鼠，一侧创面不给药，另一侧给予DMSO，主要观察DMSO对创面愈合的影响。给药各组一侧创面分别给予不同浓度的TA/HCl(2、1和0.5 mg/ml)或bFGF(2 400 U/ml),8,，另一侧给予等体积的DMSO，作为自身溶媒对照。每侧创面给药50 μl，2次/d。 1.4检测指标 1.4.1创面愈合时间 观察大鼠在创伤和给药后，创面红肿、感染、结痂情况，并记录创面愈合时间。 1.4.2创面愈合率测定 于创伤后第3、5、7、10、14、18天用透明薄膜描记创面面积，与原创面面积比较，计算创面愈合率。愈合率,(原创面面积,现创面面积)/原创面面积×100%，评价创面的愈合速度,9,10,。 1.4.3创面愈合质量评价 于创伤后第3、7、14天，各组处死大鼠5只，第21天处死各组剩余10只大鼠。取创面皮肤约一半置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色,11,12,。将剩余组织置于冰生理盐水中漂洗，用滤纸吸干，,20?保存，测定蛋白质,13,14,及Hyp,15,16,的含量，操作按试剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 进行。取创伤后第7天模型组和TA/HCl大剂量组动物的创面组织，戊二醛固定，电镜下观察肉芽组织的超微结构。 1.4.4创面毛细血管计数 用网形目镜尺在显微镜下(10×20倍)对HE染色切片分别作毛细血管计数，每组5张切片，每张切片随机选取5个视野，计数新生毛细血管，并计算均值。 1.5统计学方法 统计分析采用SPSS 10.0软件。计量资料数据均数用x?s表示，组间差异显著性检验采用成组 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 资料的t检验，愈合时间采用Wilcoxon检验。 2结果 2.1TA/HCl对大鼠创面愈合时间的影响 模型组中空白对照和DMSO对照的创面愈合时间均约为19 d，两者之间比较无统计学意义;TA/HCl各组创面愈合时间比模型组平均缩短2,3 d(P<0.01或P<0.05)，尤以TA/HCl 2 mg/ml组愈合时间缩短最为显著(P<0.01);bFGF对照组的创面愈合时间亦明显缩短(P<0.05)。见图1。 2.2TA/HCl对大鼠创面愈合率的影响 创伤后第3、5、7、10、14、18天大鼠缺损创面的愈合率见表1。模型组中，DMSO对照的愈合率较空白对照有所增加，但无统计学意义;TA/HCl组(2 mg/ml、1 mg/ml)和bFGF对照组，与自身DMSO对照组比较，第3,14天的创面愈合率均有显著提高(P<0.01或P<0.05)。 图1 各组创伤大鼠创面愈合时间 (n,10)(略) Fig 1 Closure time of skin wounds in different groups (n=10) *P<0.05, **P<0.01 vs model group 表1 各组创伤大鼠不同时间的创面愈合率(略) Tab 1 Contraction rates of skin wound at different time in different groups *P<0.05, **P<0.01 vs DMSO control of the same group 2.3TA/HCl对大鼠创面肉芽组织中蛋白质含量的影响 大鼠正常皮肤组织中蛋白质含量为(41.8?5.8) mg/g (n,5)。模型组中空白对照和DMSO对照在创伤后第3,21天肉芽组织中蛋白质的含量均高于正常皮肤组织;创伤后第7天，肉芽组织内蛋白质的含量达到最高值，但两组之间比较无统计学意义。创伤后第3,7天，TA/HCl2 mg/ml组和bFGF对照组蛋白质的含量均明显高于模型组(P<0.05)。见图2。 2.4TA/HCl对大鼠创面肉芽组织中Hyp含量的影响 大鼠正常皮肤组织中Hyp的含量为(107?8)μg/g (n,5)。模型组中空白对照和DMSO对照在创伤后第3,7天，肉芽组织中Hyp含量均显著降低，第14,21天升高至正常水平，两组之间比较无统计学意义。TA/HCl组和bFGF对照组肉芽组织中Hyp的含量明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)，第14天达到峰值，第21天时含量逐渐降低。见图3。 2.5创面组织学检查 2.5.1HE染色观察 创伤后第3天，TA/HCl组和bFGF组均有明显的单核细胞渗出，伴有成纤维细胞和毛细血管的增生;而模型组中空白对照组和DMSO对照组坏死组织未清除，有少量单核细胞渗出，有散在的成纤维细胞形成。创伤后第7天，TA/HCl组和bFGF对照组伤口周围表皮细胞开始向伤口方向延伸蔓延，皮下成纤维细胞生长活跃，数量多，其毛细血管胚芽数量显著多于模型组(P<0.05或P<0.01)，胶原纤维含量也明显增加，见图4。创伤后第14天，TA/HCl组和bFGF对照组表皮细胞继续生长逐渐覆盖伤口，肉芽组织生长旺盛，可见周围上皮细胞延伸生长、新生血管网、神经末梢及修复后的表皮细胞;而模型组中空白对照组和DMSO对照组则有较多肉芽组织生长，胶原开始形成。创伤后第21天，TA/HCl组和bFGF对照组皮下及肌层均有大量纤维母细胞增生，血管减少，创口消失，新生皮肤附属器开始形成，创面已基本愈合;模型组中空白对照组和DMSO对照组创口亦消失，但胶原纤维数量相对较少。见图5。 2.5.2电镜观察结果 创伤后第7天，TA/HCl 2 mg/ml组创面肉芽组织中可见大量成纤维细胞，胞体大，核内染色质分布均匀，核仁明显，胞浆内有丰富的粗面内质网，内质网池轻度扩张，池内含有均匀的低电子密度物质，说明蛋白质、基质等合成旺盛，细胞处于功能旺盛状态;细胞周围可见到大量的胶原纤维，成纤维细胞间还可见新生的毛细血管，其内皮细胞较厚，略呈扁平状。bFGF对照组与TA/HCl组基本相同。模型组创伤后第7天，电镜下见皮肤组织内细胞排列紊乱，未见完整的皮肤组织，可见大量炎细胞及坏死或凋亡的细胞，成纤维细胞坏死、凋亡，细胞结构不清晰。见图6。 图2 各组创伤大鼠不同修复期肉芽组织中蛋白质含量的变化 (n,5) (略) Fig 2 Contents of protein in granulation tissues of skin wounds in different healing periods (n,5) 图3 各组创伤大鼠不同修复期肉芽组织中Hyp含量的变化 (n,5)(略) Fig 3 Contents of Hyp in granulation tissues of skin wounds in different healing periods (n,5) 图4 各组创伤大鼠不同修复期肉芽组织中新生毛细血管数量 (n,5) (略) Fig 4 Numbers of newly born capillaries in granulation tissues of skin wounds in different healing periods (n,5) 图5 创伤后第7天创面肉芽组织生长情况 (HE染色，×200)(略) Fig 5 Histopathological characteristics of granulation tissues of skin wounds on the 7th day after wounding (HE staining, ×200) A: Model group; B: TA/HCltreated group (2 mg/ml) 图6 创伤后第7天创面肉芽组织超微结构(×5000)(略) Fig 6 Superstructure of granulation tissues in skin wounds on the 7th day after wounding tested by electron microscope (×5000) A: Model group; B: TA/HCltreated group (2 mg/ml) 3讨论 创伤愈合是一个复杂的病理过程，可分为三个重要重叠阶段:炎症反应期、肉芽组织形成期及改建期，而最关键的步骤是肉芽组织形成期。肉芽组织数量的多少和质量的好坏直接影响着创面的修复愈合程度及其预后。因此，通过检测肉芽组织内蛋白质的含量及新生毛细血管数量，可以初步估计出组织的生长情况,17,。本实验结果表明:在创伤后早期(第3,7天)，TA/HCl 2 mg/ml组和bFGF对照组肉芽组织内蛋白质的含量明显高于模型组;TA/HCl(2 mg/ml、1 mg/ml)组和bFGF组毛细血管胚芽数量明显多于模型组。由此说明:一定剂量的TA/HCl在创伤早期可促进肉芽组织内蛋白质的合成和新生毛细血管的形成。 胶原是创伤愈合过程中不可缺少的重要成分,18,19,，Hyp是胶原的主要成分之一，在胶原中约占12.5%,20,，测定Hyp的含量可间接反映胶原的含量，可作为创伤修复的一项指标。本实验结果表明:在创伤修复中、后期， TA/HCl各剂量组和bFGF对照组Hyp含量均高于模型组;第14天时，Hyp含量达到峰值，表明新生胶原合成旺盛，说明TA/HCl可促进创伤组织中胶原的合成和累积，但是否会形成瘢痕增生，有待进一步的研究。 在创伤修复过程中，bFGF可以影响创伤修复的整个过程。内源性bFGF在创面局部通过复杂的调节过程促进创面愈合。外源性bFGF可刺激组织分泌bFGF，也可直接刺激成纤维细胞及细胞外基质的合成，形成胶原纤维;另一方面，bFGF与相应的受体结合后，可诱导内皮细胞的迁移、毛细血管的增生，促进成纤维细胞增殖，使肉芽组织迅速生长，加速受创组织再上皮化，从而完成皮肤的修复过程,8,。本实验结果表明:在创伤局部应用TA/HCl，可促进创伤愈合早期肉芽组织中蛋白质和毛细血管的形成，而中、后期则表现为刺激Hyp和胶原的合成，具 有明显促进皮肤创伤愈合的作用。TA/HCl是否通过促进内源性bFGF的表达而产 生作用，有待作进一步的研究。 ,参考文献, 1中国医学科学院药物研究所. 中药志,M,. 第二版. 北京: 人民卫生出 版社, 1979. 424. 2高琨, 贺浪冲, 杨广德. 用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分 ,J,. 中国药学杂志, 2003, 38 (1): 1416. 3Perdue GP, Blomster RN, Blake DA, et al. 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