石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收...

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品 80%乙醇 15 min 95%乙醇 15 min 100%乙醇 15min 2 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min 二甲苯透明 5-10 min 1/2二甲苯1/2石蜡 30 min 石蜡（1） 1.5hr 石蜡（2） 1.5-2.5hr 石蜡（3）包埋 RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min 二甲苯(2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）脱水85%乙醇 5 min 95%乙醇 5 min 无水乙醇 5 min 无水乙醇 5min 二甲苯(1) 10min 二甲苯(2) 10min 中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min 二甲苯(2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）切片在PBS中浸泡 5 min*3 moil封片，避光4C保存

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