尿β2微球蛋白压电传感器阵列的构建与临床应用

尿β2微球蛋白压电传感器阵列的构建与临床应用 尿β2微球蛋白压电传感器阵列的构建与临 床应用 ?328?ChinJNosocomioIVo1.18No.32008 ? 论着? 尿l32微球蛋白压电传感器阵列的构建与临床应用 罗阳,陈呜,张波,赵猛,黄君富,张雪,府伟灵 (第三军医大学西南医院检验科,重庆400038) 摘要:目的探讨并建立压电石英晶体免疫传感器检测尿液微量&微球蛋白 的方法.方法采用葡萄球菌A 蛋白(SPA)法固定石英晶体微阵列上单克隆抗&微球蛋白抗体,并用石英晶 体微天平(QCM)检测样品反应频率 漂移量;优化传感器检测条件并运用回收实验.天内,天间重复试验来验证其准确 度与精密度,并将免疫比浊法作 为参比方法与建立的传感器方法进行方法学比较.结果该传感器平台的非特异 性反应低(FS~20Hz),线性范 围广(O.01~40.00mg/L),灵敏度达到3g/L,准确度高(CV<10),精密度试验总体 CV<10%,并且具有检 测时间短(<1Omin)等优点,与传统的免疫比浊法具有可比性.结论采用压电石 英晶体免疫传感器法检测尿 液微量B2微球蛋白是一种可行的检测方法,可应用于l临床检测并为诊断早期 肾损伤提供帮助. 关键词:免疫传感器;微球蛋白;尿液;方法学比较 中图分类号:R446文献标识码:A文章编号:1005—4529(2008)03—0328—04 QuantificationofUrinary2MicroglobulinwithPiezoelectric QuartsCrystalBiosensor LUOYang,CHENMing,ZHANGBo,ZHAOMeng,HUANGJun—fu,ZHANGXue,FU Wei—ling (SouthwestHospital.theMilitaryMedicalUniversity.Chongqing400038,China) Abstract:OBJECTIVETodiscussandestablishahighlyeffectivemethodtOquantifyB2m icroglobulinintheurine byimmunosensormicroarray.METHODSCommonproteinA(SPA)wasusedtoimmobili zetheantibodyonthe micro-array.Thendetecttheconcentrationofantigenconjugatedonthequartscrystalmicr obalance(QCM)to comparethedifferenceofthesensitivityandaccuracywithimmunoturbidimetryasarefere ncemethod.RESULTS Thenon—specificreactionwasverylowwiththeaverageFSlessthan20Hz,widelinearran gefrom0.01mg/LtO 40mg/L,thelimitofdetectionwas3/.tg/L,theCVoftheduplicatetestsandrecoverytestswer ebothlessthan 1Oandthedetectiontimewasveryshort(<10min).Bland—Altmanplotshowedthisbio sensorarraybeing highlycomparablewiththetraditionalimmunoturbidimetrymethod.CONCLUSIONST ousebiosensorarraytO detectthe&microglobulinintheurinecanbeafeasiblemethodindetectingtraceprotei ns,SOitcanbeused clinicallytohelpdiagnoseearlykidneyinjury. Keywords:Immunosensor;Microalbumin;Urine;Methodologycomparison 尿蛋白定量是临床检验医学中一个重要组成部 分.通过对尿液中各种蛋白质浓度的增减进行定量 测定,可以为临床医师对各种疾病提供更为准确的 判断依据.具有重要床意义的尿蛋白常见于微量白 蛋白,q微球蛋白,p2微球蛋白,尿IgG等_1].而其 中p2微球蛋白又是其中最重要的尿蛋白之一口],其 -01;修回日期:2007—11一O5 收稿日期:2007-08 基金项目:国家自然科学基金(3040010730400420) 国际科技合作计划项目(2004DFA00600) 重庆市自然科学基金(CSTC2007BB5067) 军队”十一五”课题(06G073) 通讯作者:府伟灵,E-mail:weilingfu@yahoo.com 尿液中浓度的持续增加可以提示因糖尿病等原因引 起的肾小管损伤L3].然而,大多现有的82微球蛋白 的检测方法(放免法,化学发光法等)均需要进行抗 体的预先标记,此过程极为繁琐且往往给后续的测 定结果带来许多不定的影响因素.免疫比浊技术无 需进行抗体标记,但是其对检测设备和配套试剂的 要求极为严格,且检测成本较高.因此,临床上迫切 需要建立一种快速,无需标记,实时动态准确显示的 测定方法j. 压电生物传感器是检测领域中一门新兴学科, 而基于抗原抗体反应的免疫传感器又是传感器系列 中研究得最早也是最为成熟的了.本课题组前期对 压电石英晶体免疫传感器进行了深入研究并构建了 中华医院感染学杂志2008年第18卷第3期 多个压电传感器阵列[5],进而对一系列临床上常 见的指标进行了实际测试并取得满意效果[7].本 研究在前期实验研究的基础上,进行了的快速,准 确,定量,经过系统优化与改良,最终建立了一套基 于压电生物传感器的口.微球蛋白阵列,以实现尿液 中8.微球蛋白的快速,无标记,准确测定,为临床提 供了微量蛋白测定的新思路. 1材料与方法 1.1仪器与器材AT切型石英晶振,基频 IOMHz,由信息产业部电子第26研究所生产制备. SPA购于分装自Sigma的华美公司.抗人口.微球 蛋白(&microglobulin)单克隆抗体购自Sigma— Aldrich公司(PBS溶液pH7.2).PBS缓冲液: 0.05mol/L,pH7.2,自行配制.所用其他试剂均 为AR级. 1,2方法 1.2.1石英晶体金膜表面的预处理将石英晶体 浸入1mol/L的NaOH溶液中浸泡10min,三蒸水 清洗后,浸入1mol/L的盐酸(HC1)溶液中浸泡 10min,三蒸水及95乙醇清洗后,氮气吹干备用. 1.2.2抗体包被将金膜表面经过预处理石英晶 体在SPA溶液中浸泡12h,随后再用去离子水冲 洗.将抗人微球蛋白单克隆抗体10l,均匀涂 反应 布于已包被了SPA的石英晶体金膜表面,4? 6h;再加入1的BSA溶液100tA,封闭1h,用 PBS缓冲液和三蒸水分别冲洗3次,氮气吹干备用. 准品制备将尿口.微球蛋白纯品用PBS 1.2.3标 缓冲液稀释,配成各种浓度:10,50,100,500,1000, 5000,10000/~g/L,定标并绘制标准曲线. 1.2.4重复实验和回收实验分别对20,50,100, 860/~g/L4种浓度梯度的微量口z微球蛋白质控品 进行批内检测(每批测定20次)和批间检测(每天测 定1次,连续测定20d).然后在A,B,C,D4根试 管中分别加入低,中,高不同浓度的标准液以检测回 收率. 1.2.5方法学比较试验收集2005年4月一2007 年4月问西南医院65例住院患者的24h尿标本, 采集后采用一20?低温保存.然后分别用传感器 阵列和IMAGECOULTER检测这些临床样品. 1.2.6统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 采用SPSS13.0统计分析软 件进行.检验,标准曲线和相关分析采用Origin 7.5作图,方法学比较实验(Bland—Altman图)由统 计软件Medcalc8.11绘制. 2结果 2.1传感器阵列的构建传感器阵列的构建及包 被的抗口z微球蛋白抗体的分布,见表1. 表12×5型传感器阵列抗体包被分布 注:*B2微球蛋白. 2.2传感器的精密度与准确度测试 2.2.1检测高中低浓度标准品的结果检测高中 低浓度标准品的结果传感器的天内,天间重复实验 中传感器检测高中低浓度标准品的结果,见表2. 表2p微球蛋白(g/L)的重复检测结果 浓度 (g/L) (n一20) 天内(n一20)天间 均值SDCV()均值SDCV() 注:SD表示标准差. 2.2.2回收率回收实验中传感器检测高中低浓 度标准品添加后的回收率,见表3. 表3尿pz微球蛋白(g/L)的回收实验结果 项目原浓度加入后浓度检测浓度回收率(oA) A0.000.00266.16… B3.000.14266.31105.00 C100.004.76271.32108.40 D600.0028.57293.8997.10 均值………103.50 标准差………5.80 2.3标准曲线压电石英晶体免疫传感器检测尿 微量8.微球蛋白的标准曲线,分别用浓度为10,50, 100,500,1000,5000,10000/~g/L的微量尿82微球 蛋白标准液进行定标,其检测频率漂移值随加入浓 度增加而上升的曲线,见图1. 2.4方法学比较压电石英晶体免疫传感器与免 疫透射比浊的方法学比较,见图2,3.其中图2表 示采用一致性分析所作图形的结果,从图上可以看 出两种检测方法的相关性较好(r2—0.9991).图3 为采用Bland—Altman方法统计分析的两种方法相 关性的结果,由图上结果可知其相关性较好,两者的 差值都在一致线的两侧呈正态分布,且其2SD也较 ,J,,仅为10.7g. 孙 4975 %卯 O58 ?”孔? 294325n踮 ? 6952 弘踮? 145孙 ?? 2O12 25 OO ?? 吼吼 ? ChinJNosocomiolVo1.18No.32008 400 350 5300 褂150 100 50 ? ,., 燃 奴 帮 筮 101010s10’ B2]l浓度(|IL) 图1传感器检测&微球蛋白的标准曲线 02004006008001000 压电生物传感器(|I) 图2一致性分析微量Bz微球蛋白传感器与 免疫比浊的比较 02004006008001000 压电传感器与INM测定结果的均值(|Ig/L) 图3Bland-Airman分析微量口z微球蛋白传感器与 免疫比浊的比较 3讨论 对尿微量8微球蛋白进行早期检测是防止肾 脏病变的有效手段之一,对于糖尿病患者和高血压 患者尤为重要,测定尿微量82微球蛋白可以预测糖 尿病肾病和高血压病的进展.糖尿病肾病是糖尿病 的重要并发症,一旦临床确诊为糖尿病肾病,发展成 肾衰是不可避免的,因而是糖尿病早期死亡的最重 要原因.是不可逆病变.糖尿病肾脏病变主要是由 于肾小球滤过增加,代谢改变导致高滤过率,基底膜 改变,负电荷降低,肾小球内压力增高而造成.3O 的1型糖尿病患者病程15,2O年会出现肾病,2O% 的2型糖尿病患者在明确诊断时已有肾病,2型糖 尿病患者病程5年后肾脏并发症显着增高. 尽管8微球蛋白在肾脏的早期损伤中具有重 要的诊断价值,然而其准确定量一直是临床难题. &微球蛋白是一种几乎在所有的体细胞的细胞膜 上都存在的低相对分子质量(Mr11×10.)的蛋白 质.游离的8微球蛋白是细胞裂解的产物.它是 由肾小球分泌的,然后被肾小管细胞吸收和分解. 肾小球过滤功能可以降低血清中出现高浓度的 BMG,肾小管功能异常,血清中,正常尿液中的8微 球蛋白的浓度会升高.然而8微球蛋白在尿液中 的稳定性较差,尤其是在pH<5的酸性尿中稳定性 极差.因此,为了能够准确定量8微球蛋白,我们 采用了24h尿液作为标本来源,并且在标本采集后 立即加入lmol/L的Hcl或者NaOH使尿液标本 的pH稳定在7,8,同时加入蛋白酶抑制剂,以防 止蛋白的降解.检测结果显示其效果明显,说明该 样本处理方法合理. 从本实验室构建的传感器的阵列图(表1)可以 看出,本系统一次可以同时检测8例标本,另有1例 为空白对照与阳性对照,每次检测结果为实测频率 值与空白对照值之差值,从而能够排除传感器的非 特异性吸附导致的频率下降,减少系统误差.同时, 阴性对照和阳性对照分布于传感器阵列的不同行, 从而可以排除因为单排电路差异而引起的系统误 差. 重复实验可以反映一个检测方法的重复性,即 精密度.本实验中(表2)天内差异较小:并且4个 检测浓度的变异系数也都<10;天间重复实验中, 高浓度的蛋白测定时无论是标准差还是变异系数都 较天内重复略大,但4个检测浓度的变异系数也都 <10. 回收实验是用来衡量一个待检方法的准确度 的.其方法是在将同一份未知浓度的样品等量分成 4份,在第1份中加入一定体积的蒸馏水,在第2,3, 4份中分别加入等体积的低,中,高3种浓度的标准 微量G微球蛋白溶液,从而计算出检测值与加入值 之间的比值并用百分比表示,其计算公式如下: 加入后浓度=地譬 回收率一X100% 本实验中高中低3种微量p微球蛋白添加浓 度的回收率都在95.O,110.O%(分别为 105.O,108.4,97.1),平均为103.5%.3个 回收率的标准差为5.8,说明本传感器平台的准确 性较好,已达到临床实验室诊断的要求. 中华医院感染学杂志2008年第18卷第3期 从B微球蛋白的标准曲线(图1)中可看出,从 低浓度开始,反应频率下降与浓度的对数值呈一个 线性增长期,随着抗原浓度的逐渐增大,其下降频率 值也随着增加.然而当标准品浓度>10mg/L之 后,上升的趋势趋于平缓,但仍然在上升,说明传感 器中抗原抗体的结合受到一定拟制.其原因可能是 随着溶液浓度的增加,抗原,抗体的量不再成最佳比 例.因此在从0.01,40mg/L的区域内,反应都呈 一 个一次函数增长模型(r一0.999).但当浓度 >40mg/L之后则不再呈一次函数关系,于是我们 在确定B微球蛋白传感器的检测工作区间时,则将 最低浓度确定为0.01mg/L,最高浓度40mg/L. 超过这个范围,测量值的可靠性降低,若样本中的浓 度高于此限度,则需要进行稀释后检测.最低检出 限由空白样本5次测量的均值加上2SD来确定,本 实验中尿微量B微球蛋白的最低检出限为3/~g/L, 其最低定量检出限为4g/L.这完全可以满足普 通临床标本检测的要求[8]. 图2,3都是反应的两种实验方法的一致性.图 2中尿微量B微球蛋白传感器与传统的金标准免 疫比浊相比较,图形显示大部分的点都存在于直线 的两侧.采用一次函数进行曲线拟合,所得r为 0.9991,说明两种方法的相关性较好.图3则是两 种方法所测值的结果差对两种方法检测的均值作散 点图,并且标上?2SD来观察其散点是否正态分布 在95的可信区间.如图上可知,整体均值为 一 0.9/~g/L,95的可信区间为从一l1.7, 9.8/~g/L;由图3可清楚看出,大多数的点都在 95可信区间之内,但更多的点分布在50, 600/~g/L,说明我们常见的临床标本的待检浓度多 在此区间. 综上所述,通过对尿B微球蛋白传感器与传统 的金标准免疫比浊的多方面指标进行方法学评价, 我们可以观察到尿B微球蛋白传感器阵列具有高 能量,高度特异性,高准确性,灵敏度高,工作区间范 围广,响应频率高的优点.极大地克服了常规免疫 比浊法所需器材昂贵,试剂成本较高,必须有使用特 定的配套试剂,不易进行推广等缺点,更克服了放免 法必须用同位素标记的缺点,能够实时对尿液中B 微球蛋白进行准确定量.为临床医生提供了一种可 行的快速诊断早期肾损伤的方法.同时,此平台也 可用来对糖尿病肾病,高血压肾病和隐匿性肾病的 诊断提供帮助.而且,此平台的建立为新一代压电 石英谐振传感器用于临床标本的检测奠定了坚实的 基础. 参考文献: SehillingerM.Cardiovascularriskstratificationinolderpa— tients:roleofbrainnatriureticpeptide,C—reactiveprotein, andurinaryalbuminlevels[J].JAMA,2005,293(13):1667一 l669. 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