质粒的小量提取
1.质粒是什么
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体,是一个具有自身复制起点的复制单位,独立于细胞的主染色体之外。在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
2.分离质粒DNA有三个步骤:培养细菌使质粒扩增,收集和裂解细菌,分离和纯化质粒DNA
3.在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状DNA(cccDNA):质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA):质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形DNA(lDNA):质粒的两条链均断裂;线性分子质粒DNA的分子构型。
4.质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为:松弛线性的DNA;松弛开环的OC构型超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的SC DNA走在最前沿,OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的,它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间。
5.碱裂解法步骤:
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒离心管数次,以混匀
内容
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物(千万不要振荡),冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70%乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液(pH8.0,含20μg/mlRNaseA)中,储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。
6.碱裂溶液:
溶液1 50mM葡萄糖:是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉降
25mM Tris-cl:控制溶液pH
10mM EDTA(ph=8.0):是二价钙离子,镁离子等2价金属离子的螯合剂,
主要作用为抑制DNase的活性和抑制微生物的生长溶液2 0.2N NaOH:溶解细胞。之所以叫见裂解法,是因为NaOH是最佳溶解细胞的
试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,都会瞬间溶解,细胞
从双层膜结构向微囊结构的变化
SDS:结合蛋白,平均两个氨基酸结合一个SDS
PS:为保证NaOH不因为吸收空气中的CO2而减弱其碱性,最好用新鲜的浓NaOH 稀释后和2%的SOS等体积混合后使用。加溶液2时要记住两点:【1】时间不能过长,因为在这样碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂;【2】操作必须温柔,不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会混入质粒DNA 中,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA 条带。
溶液3 3M醋酸钾:SDS十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾PDS,而
PDS是不容的,SDS结合了大量蛋白质,PDS就将绝大部分蛋
白质沉淀了,同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被沉淀了。因
为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给沉淀了2M的醋酸:中和NaOH,长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和。基因
组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片段,就没有办法再被PDS
沉淀了
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