C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果的研究

C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果的研究 山东农业大学 博士学位论文 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 姓名:张德庆 申请学位级别:博士 专业:预防兽医学 指导教师:牛钟相 2011-06-05山东农业大学博士学位论文 中文摘要 近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达技术研制 预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸(DNA)疫苗倍受青 睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。 核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将 多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于 DNA 疫苗蛋白表达量低,激发的免 疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高 DNA 疫苗的免疫效果已成为基 因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸 腺肽和补体分子佐剂等是提高 DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体 C3d分子佐剂 倍受人们的关注。 补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对 抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d 已经成为核酸疫苗有效 的新型分子佐剂。但是C3d 作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强 作用的差异性需要作进一步的研究。 PRRSV GP5基因编码的 GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性, 能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH 基因是沙门氏菌 A-E 群的高度保守 基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。 本研究首先对哺乳动物猪、鼠的 C3d基因进行克隆及序列测定 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ,并探讨了不同 种动物(猪、鼠、鸡、鸭)间补体 C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以 PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪(哺乳动物)C3d的受体结合功能区 p28和鸡、鸭(禽类 动物)C3d 的受体结合功能区 p29 作为分子佐剂,构建了 C3d-p2829.n(n2、4、6) 多聚体分子佐剂 PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌 pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫 苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检 测,探讨不同动物 C3d-p28(29)对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分 内容: 1、哺乳动物猪、鼠补体 C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物(猪、鼠) 的补体 C3d基因克隆并比较同禽类动物(鸡、鸭)C3d基因序列的差异性,首先从哺乳 动物鼠、猪的肝组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR扩增 C3d基因的 cDNA,琼脂糖凝胶 电泳鉴定后直接克隆到 pMD18-T载体,构建 pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌, 1 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 酶切鉴定并进行序列测定,然后进行 C3d 序列和 CR2 结合区同源性比较分析。电泳结 果显示,分别在 936bp 和 888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的 C3d基因克隆。 序列分析结果表明,哺乳动物(猪、鼠)和禽类(鸡、鸭)的补体 C3d基因同源性仅为 64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d 基因进化关系也越近。哺乳 动物(猪、鼠)与禽类(鸡、鸭)C3d 基因的 CR2 结合区比较分析发现,禽类为 29 个 氨基酸,而哺乳动物为 28 个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为 62%,而鼠、 猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达 82.8%和 84%,证明补 体 C3d 及 CR2结合区具有种属的差异性。 2、不同动物 C3d分子佐剂 PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物 C3d分 子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物 C3d cDNA的基础上,设 计引物克隆 C3d-p2829至 pUC19 载体,利用同裂酶 BamH ?和 Bgl ?构建多聚体 C3d-p2829.n,将其克隆至真核表达载体 pcDNA3.1+上;然后以 RT-PCR扩增 的 PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体 pcDNA3.1-C3d-p2829.n 中 p2829.n 上游,构建 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 29.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在 807、 987、 1167bp 处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体 C3d-p2829多聚体分子佐 剂的 PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p2829.n)。 3、不同动物 C3d 分子佐剂对 PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索 不同动物 C3d分子佐剂对 PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、 猪 、 鸡 、 鸭 四 种 动 物 补 体 C3d-p2829.n PRRSV GP5 核 酸 疫 苗 (pcDNA3.1-GP5-C3d-p2829.2.4.6)及 pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质 粒,通过脂质体转染至 Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫 BALB/c小鼠,然后利用不 同 ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的 GP5抗体水平和 IL-4、 IFN-γ含量。结果表明, 以补体 C3d-p2829.n为分子佐剂的 PRRSV GP5基因重组疫苗均可在 Marc145细胞内进 行表达;连接不同动物 C3d-p28292,4,6 聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中 GP5 抗体水 平、IL-4和 IFN-γ含量均比空载体(pcDNA3.1)和 pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异 均显著(P0.05),其中以 pcDNA3.1-GP5-p2829.6 组的效果最佳,但均不如 PRRSV 油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有 C3d-p2829.n(n2,4,6)相同聚体的疫苗免疫组 小鼠血清中的 GP5抗体水平、IL-4 和 IFN-γ含量两两比较无差异性。 4、鼠 C3d 分子佐剂沙门氏菌 invH 基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进 一步探讨分子佐剂 C3d 在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌 invH 为核酸疫 2 山东农业大学博士学位论文 苗的模式基因,构建了 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6 重组质粒,免疫 BALB/c 小鼠并检 测了小鼠血清中 invH抗体和 IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表 明,小鼠血清中 invH抗体水平、IL-4 和 IFN-γ 的含量与 pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对 照组比较,差异均显著(P0.05)。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6 核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于 pcDNA3.1-invH组,差异显著(P0.05), 与空白组 和 pcDNA3.1组比较,差异均极显著(P0.01),但核酸疫苗的保护效果不及灭 活疫苗。 本研究结果探明了动物 C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作 用,为开 发利用不同动物 C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和 技术支持。 关键词:C3d分子佐剂;核酸疫苗;PRRSV GP5;沙门氏菌 invH;免疫效果 3 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 Construction and immunogenicity of nucleic acid vaccines containing molecular adjuvant complement C3dAbstract In recent years, with the development of molecular biology and immunology theory and technology, the research of biological products using to prevent and treat have already become a hot spot in the immunology field by genetic restructuring express technologyAmong them the nucleic acid DNA vaccine is extremely popular. The nucleic acid vaccine is a new generation of vaccine after the inactivated vaccine, live attenuated vaccine, unit vaccine and genetic engineering vaccine, which has many advantages, such as inducing the humoral immune and cellular immune response, safety in the use, easy to produce, and so onThe gene combination vaccine could be made by integrating some genes together. However, the speed of DNA vaccines’ application development is limited because its’ low protein expression and weaker immune response. Thus, improving the immunity effect of DNA vaccine is an urgent problem to solve in the immune study. At present, application of molecular adjuvants is an important measure to improve the immunity effect of DNA vaccines. The molecular adjuvants have interleukin, interferon, thymosin and complement molecular adjuvants etc, which complement molecules C3d as a new molecular adjuvants is of growing concernC3d is the final cleavage product of complement C3 while C3 is activated, which can promote antigen presenting cells APC to carry on the uptake of antigens in , to present antigens, and improve the immune response capability. Therefore, C3d has been defined to be a new and effective molecular adjuvant in the nucleic acid vaccine. Whereas C3d as molecular adjuvants has different animal species diversity, the immuno-enhancing differences of C3d among different animals need further studyGP5 protein is a glycosyl capsule membrane protein coded by PRRSV GP5 gene, which has good immunogenicity and could induce the specific humoral immune and cellular immune. InvH gene is the highly conservative gene at salmonella A-E groups, which can code the surface protein to adsorb and invade epithelial cells. The capacity of salmonella bacteria to4 山东农业大学博士学位论文 invading intestinal mucosa cells is decided by this protein Firstly, C3d genes of mammals pig and mouse were cloned and sequence analyses were investigated in this study; Subsequently, the relevance and difference between mammals and poultry animals pig, mouse, chicken and duck was investigated in gene level. And then, nucleic acid vaccines containing PRRSV GP5 model gene with the complement p28 polymersomes of mammals swine or mouse complement C3d receptor binding domain, or the complement p29 polymersomes of poultry chicken or duck and nucleic acid vaccine containing Salmonella invH model gene with C3d-p28.6 of mouse were constructed; mice were inoculated by the nucleic acid vaccines and the main immune indexes of humoral immune and cellular immune were evaluated to observe the immuno-enhancing effect of the different animals C3d C3d-p2829.n(n2、 4、 6) in the nucleic acid vaccines. This research mainly including four sections: 1. Cloning and Sequence Analysis of Complement Component C3d from the mammals pig and mouse: In order to obtain mammals pig and mouse C3d gene cloning and compare the differences with poultry animals chicken and duck C3d gene sequences, total cell RNA was extracted from the liver tissue of the mammals pig and mouse, and the cDNA of C3d was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR. The cDNA fragments were directly cloned into pMD18-T plasmid, and the recombinant plasmids pMD18-T-C3d were identified by restriction endonucleases digestion and sequencing. The cloned C3d genes and CR2 binding region on C3d were compared between mammals and poultry. Electrophoresis showed the C3d gene cloning of pig and mouse were obtained successfully for the bright strips in 936bp and 888bp respectively. The results of sequence analysis indicated that the homology of complement C3d gene between mammals pig and mouse and poultry chicken and duck is only 64%; the phylogenetic tree showed C3d had varieties in species mammals and poultry, more close relationship, more close evolutionStructural analysis in CR2 binding region indicated that there were 28 amino acids in mammals but 29 amino acids in poultry; the homologous amino acids were only 60% between poultry and mammals, however there were more homologous between mammals pig and mouse 82.8% and between poultry chicken and duck 84%, which indicated that the complement C3d and the CR2 binding region had the genus-specificity 5 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 2. Construction of nucleic acid vaccines containing PRRSV GP5 gene with complement C3d of different animals as molecular adjuvants: In order to find out the immuno-enhancing effect of molecular adjuvant C3d of different animals in the nucleic acid vaccine, after cloning the C3d cDNA, four pairs of primers were designed to subclone the C3d-p2829 gene to the pUC19 plasmid. Several tandems of C3d-p2829 were constructed in the pUC19 plasmid used a pair of isoschizomers BamHI and BglII. Digested the pUC19-C3d-p2829.n to get the gene of C3d-p2829.n, and then cloned the products to pcDNA3.1 + plasmid. After this, the GP5 gene of PRRSV was cloned through RT-PCR and inserted to the upstream of the C3d-p2829.n which is in the pcDNA3.1-C3d-p2829.n, and the nucleic acid vaccines containing PRRSV GP5 gene with C3d-p2829.n as molecular adjuvants were constructedElectrophoresis showed that the bright strips appear in 807、987、1167bp after digested the reconstructive plasmids pcDNA3.1-GP5-C3d- p2829.n respectively, which indicates that the reconstructive plasmids containing PRRSV GP5 gene with C3d-p2829.n as molecular adjuvant were constructed successfully3. Study on immunity enhancement effect of nucleic acid vaccine containing PRRSV GP5 with C3d of different animal as molecules adjuvants: In order to explore the immuno-enhancing effect and difference of the PRRSVGP5 nucleic acid vaccine containing molecules adjuvant C3d of different animals, the reconstructive plasmids were extracted and expressed instantaneously in the Marc145 cells by liposomes carrying after the reconstructive plasmids of four kinds of animals pcDNA3.1-GP5-C3d-p2829.n and the plasmid pcDNA3.1-GP5 were constructed. Subsequently, the vaccines’ abilities to elicit the humoral and cellular immune responses were investigated in BALB/c mice. The result showed that the reconstructive plasmids well expressed as GP5 protein in the Marc145 cells and that significantly enhanced GP5-specific ELISA antibody, GP5-specific neutralizing antibody, IFN-γ level, and IL-4 level, could be induced in mice immunized with nucleic acid vaccines encoding the pcDNA3.1-C3d-p2829.n-GP5 than those received nucleic acid vaccine expressing only the pcDNA3.1 vector and pcDNA3.1- GP5 group P 0.05, although these were not as effective as inactivated oil-emulsion vaccine. The increase in the immune response elicited by six copies of p2829 was higher than four copies of p2829 P 0.05, which is also higher than two copies of p2829 P 0.01. Furthermore, there were no6 山东农业大学博士学位论文 differences of the GP5 antibody level, IL-4 and IFN-gamma content in the serums of mice immunized with nucleic acid vaccines containing the same copies of C3d-p28294. Construction and immunogenicity of nucleic acid vaccines containing invH gene of salmonella with murine complement C3d as molecules adjuvants: In order to further explore the immuno-enhancing effect of C3d as molecular adjuv- ants in the bacteria nucleic acid vaccine. Nucleic acid vaccines containing the invH as model gene with six copies of mC3d-p28 as molecules adjuvant were constructed; subsequently, mice were inoculated by the nucleic acid vaccines and the invH antibody level, IL-4 and IFN-gamma content in the serums were detected; and then, tapping poison protection test was performed in mice. Result showed differences of the invH antibody level, IL-4 and IFN-gamma content in the serums were significant compared with those received nucleic acid vaccine expressing only the pcDNA3.1 vector and pcDNA3.1-GP5 group P0.05.The results of poisoning experiment showed that the protective rate of the vaccine containing six copies of mC3d-p28 was higher than pcDNA3.1-invH group, significant difference P0.05, and was extremely significant difference P0.01compared the blank group and pcDNA3.1 group, although these were not as effective as inactivated oil-emulsion vaccineThe results of this study has proven the immuno-enhancing effect of molecular adjuvants C3d in the viruses and bacteria nucleic acid vaccine, which may provide theoretical basis and technical support for the development of other pathogens’ nucleic acid vaccine using C3d of different animals as molecular adjuvants Keywords: Molecular adjuvants C3d; Nucleic acid vaccine; PRRSV GP5; Salmonella InvH; Immunity effect7符 号 说 明 英文缩写 英文全称 中文全称 AA Amino acid 氨基酸 Ab antibody 抗体 ADE Antibody dependent enhangcement 抗体依赖性增强作用 ADV Adenovirus 腺病毒 AI Anaphylatoxin inactivator 过敏毒素灭活剂 AKP Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 AP Alternative Pathway旁路途径 APC Antigen-presenting cells 抗原递呈细胞 BCR B cell receptor B细胞受体 BGH Bovine growth hormone 牛生长激素 bp Base pair 碱基对 C C o m p l e m e n t 补体 C3d Complement C3d 补体 C3d cDNA complementary DNA 互补 DNA C1INH C1 inhibitor C1抑制物 CP Classical pathway 经典激活途径 CTL Cytotoxic T lymphocyte 细胞毒性 T淋巴细胞 DC Dendritic cells 树突状细胞 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦炭酸二乙酯 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 d day 天 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 E Red Cell 红细胞 EB Ethidium bromide 溴化乙锭VIE.coli e sc h e r ic hi a c o l iba c t e re r大肠埃希氏杆菌 EDTA et hy l en ed ia m ine t etraacetic acid乙二胺四乙酸 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 ggr a m克 hh o ur 小时 HI Hemagglutination inhibition 血凝抑制 HIV human immunodeficiency virus 人免疫缺陷病毒IFA immunofluorescent assay 间接免疫荧光试验 IFN interferon 干扰素 Ig immunoglobulin 免疫球蛋白 IL interleukin 白细胞介素 kb kilobase 一千个碱基 kDa Kilo-daltons 千道尔顿 kg kilogram 千克 LB luria-bertani medium LB培养基 LP lectin pathway 凝集素途径 M mole/liter 摩尔/升 mAb monoclonal antibody 单克隆抗体 MAC membrane attack complex 膜攻击复合体 MCP Membrane cofacto protein 膜辅蛋白 mg milligram 毫克 MHC Major histocompatibility complex 主要组织相容复合体 min minute 分钟 mLmilliliter毫升 mM millimole/liter毫摩尔/升 mol/L mole/liter 摩尔/升 3-[4,5-dimethylthiazol]-2,5-diphenyltetrazolium MTT 四甲基偶氮唑盐 romideVIINK natural killer cell 自然杀伤细胞 OD optical density 光密度值 ORF open reading frame 开放阅读框架 P Properdin 备解素 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PEG polyethylene glycol 聚乙二醇 Porcine reproductive and respiratory syndromePRRS 猪繁殖与呼吸综合征 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 猪繁殖与呼吸综 合征病毒 PRRSV R Receptor 受体 RNA ribonucleic 核糖核酸 rpm Rounds per minute 转/分钟 RT-PCR Reverse transcriptase PCR 反转录 PCR s second 秒 SDSSodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 泳 SPF specific pathogen free 无特定病原体 TCID Tissue culture infection dose 50 组织培养半数感染量 50 TCR T cell receptor T淋巴细胞受体 Tetramethyl benzidine 四甲基联苯胺 TMB Tris Tris[hydroxylmethyl] amino methane 三羟甲基氨基甲烷g microgram 微克L microlitre微升 VIII 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所取得的成果。 对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中 明确说 明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 , 同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和 电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名: 导 师 签 名: 日期: 4 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 1 前 言 1.1 核酸疫苗的研究进展 核酸疫苗nucleic acid vaccine, NAV又称基因疫苗、DNA 疫苗, 是近年来随着基因 治疗技术的发展而产生的一种新型疫苗。所谓核酸疫苗是指将编码特异性的抗原多肽或 蛋白质基因与具有表达调控元件的载体重组的质粒DNA, 直接导入动物组织, 诱导动物 免疫系统对编码抗原基因在体内表达的多肽或蛋白质发生免疫应答以达到预防和治疗 的作用, 这种免疫制剂称为核酸疫苗Rabinovich et al,1994。由核酸疫苗直接引发免疫应 答的发现和研究始于 1990年, 美国威斯康星大学 Wolff 等Wolff JA et al,1990首次报道 了小鼠肌肉注射纯化 RNA 或 DNA 表达载体 DNA, 可在肌肉细胞内产生相应基因的表 达产物氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶及 β-半乳糖苷酶, 并持续很长时间, 于是他们提出 了应用编码抗原的基因在细胞内的表达, 可作为研制新型疫苗的手段。1992 年 Tang 等 Tang DC et al,1992将带有人生长激素基因的质粒 DNA,通过基因枪导入小鼠表皮细胞, 几周后 98%被接种的小鼠产生抗人生长激素抗体。 1993 年 Ulmer 等Ulmer JB et al,1993 发现小鼠经肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白的载体质粒 DNA后,可有效地保护小鼠抵 抗另一种亚型流感病毒的攻击。 1994年世界卫生组织全球疫苗和免疫计划委员会(WHO GPV)等 3 个组织在日内瓦联合召开了核酸疫苗会议, 充分肯定了核酸疫苗的优点及应 用前景, 推动了核酸疫苗的研究。由于 DNA 疫苗本身有很多其他传统疫苗所不具备的 优点, 而被广泛应用于对人类和动物的病毒、细菌和寄生虫等传染病新疫苗的研究中, 而且还扩展到对肿瘤、自身免疫病和过敏等疾病的免疫治疗研究李忠明 等,2001。然 而, DNA 疫苗的动物试验研究表明, DNA 疫苗在小动物试验获得了较好的免疫效果, 可诱导机体产生较高的特异性抗体, 但对大动物 DNA 疫苗的效果就不尽理想崔保安 等,2006。因此, 科学研究者们已经开始了免疫佐剂的研究以期望增强 DNA疫苗的免疫 效果。 1.1.1核酸疫苗的构成 核酸疫苗是由病原体的抗原编码基因和作为真核细胞表达质粒载体构成。8 山东农业大学博士学位论文 1.1.1.1抗原编码基因 对于灭活疫苗和弱毒疫苗,不必知道具有免疫保护功能的确切抗原表位,而核酸疫 苗则利用单一蛋白质抗原分子来诱导免疫反应,首先就要明确编码具有免疫活性的特定 抗原的核酸。因此,获得合适的抗原编码基因并将它插入到载体上,是发展基因疫苗的 一个重要环节。一般选择基因组保守序列作为核酸疫苗的抗原编码基因即目的基因构 建核酸疫苗。对于病原体基因组较为清楚的,可选择病原体表面编码糖蛋白基因作目的 基因;而易发生变异的病毒,则可选择各亚型共有的核心蛋白基因中的保守序列作目的 基因,可避免易变和病毒产生免疫逃避现象;未知病原体,可利用表达文库免 疫技术 expression library immunization, ELI来获得免疫活性基因。抗原编码基因可以是完整 的一组基因,也可以是单基因的 cDNA,还可以是编码抗原决定簇的一段核昔酸序列,它 们的表达产物都是病原体的有效抗原成分,都可诱发保护性免疫。 1.1.1.2真核表达质粒载体 为使目的基因在真核细胞内有效表达并诱发免疫应答,构建合适的载体是非常必要 的。较理想的质粒载体都具备以下条件(吴乃虎,2001;李海山 等,2003;郑春福, 2000) (1)可以在细菌中复制的复制起点; (2细菌的抗性基因; (3可在哺乳动物细胞中 表达的强启动子;(4用于保持 mRNA 分子稳定性的 polyA 加尾信号序列和一些内含子 序列,翻译起始序列,转录终止序列等调控元件。真核细胞表达载体的质粒多以 pBR322 或 pUC质粒为基本骨架,带有细菌复制子(ori),能在大肠杆菌内高效稳定地复制,但 不能在哺乳动物的细胞内复制;要求不会整合到宿主细胞的染色体中。由于核酸疫苗诱 导的是抗编码目的基因蛋白的免疫应答,而不是抗载体质粒的免疫应答,因此,理论上 这种载体质粒可以多次用于制备编码不同蛋白质的 DNA,提供多种疾病的保护性免疫。 启动子是决定核酸疫苗在靶细胞中表达水平的重要元件,负责调控基因的表达,用 于制备核酸疫苗的质粒,通常是非复制型的真核表达质粒,其在宿主细胞内的表达水平 与调控 DNA 表达的启动子关系密切。目前常用的启动子主要有猴空泡病毒早期启动子 SV40、劳氏Rous肉瘤病毒启动子RSV、腺病毒启动子ADV和巨噬细胞病毒早期启 动子CMV等。研究证明,源于巨噬细胞病毒的启动子调节功能最佳,源于 Rous 肉瘤 病毒的启动子的调节功能也较好。9 C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究 增强子是真核表达质粒载体不可缺少的另一元件,由一组核心序列组成,主要功能 是增强启动子的转录能力,并且不依赖方向,能在远距离发挥作用,一种理想的增强子 能增强 10-100倍的转录水平,常用的增强子通常来源于 SV40, RSV或 CMV,这些增强 子具有比较高的转录增强作用。 真核表达载体一般具有 1-2个抗性基因,在制备核酸疫苗的过程中借助其功能筛选 和扩大培养含有真核表达质粒的阳性菌,收集核酸疫苗。抗性基因有显性和隐性抗性基 因之分,隐性抗性基因必须选用被选择遗传分子是缺陷型的受体细胞株作为受体,显性 抗性基因对受体细胞无特殊要求。 1.1.2核酸疫苗的分类 核酸疫苗由于起步较晚,国际上尚无统一分类。目前应用最多的是 DNA 疫苗,因 为从 DNA提取、酶切、质粒 DNA重组和表达等技术相对成熟。但是由于 DNA疫苗存 在与宿主 DNA整合引起癌变的潜在危险,因而未来将更加重视对 RNA疫苗的研究。由 于核酸疫苗所用载体理论上可同时承载数个目的基因,也可根据目的基因数目分类,此 外还可结合疫苗的使用途径分类。核酸疫苗可粗略分类如下: ?根据核酸类型,分为 DNA疫苗和 RNA疫苗。 ?根据目的基因数目,分为单基因和多基因核酸疫苗。 ?根据功能,分为禽流感核酸疫苗、新城疫核酸疫苗等。 ?根据使用途径,分为肌注疫苗,静注疫苗,局部黏膜疫苗等。 ?根据其佐剂及修饰状态,分为脂质体核酸疫苗,金微粒核酸疫苗,IL-2加强核酸 疫苗等。 1.1.3核酸疫苗可能的作用机制 现代免疫学证明抗原进入机体后,由抗原提呈细胞(APC)呈递给免疫效应细胞的 + 方式有两种:外部抗原通过与 MHC ?类分子结合后提呈给 CD4 T 淋巴细胞,刺激 B 细胞增殖、分化成浆细胞,产生特异性抗体。大多数死疫苗或亚单位疫苗的抗体应答是 由 MHC ?类分子提呈的;在机体被感染或接种减毒活疫苗后,细胞内生成的内源性抗 + 原则与细胞中的 MHC ?类分子结合后,呈递给 CD8 T 淋巴细胞,产生特异性细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)和辅助性 T 淋巴细胞(Th),在产生细胞免疫的同时,这种抗原也被 10 山东农业大学博士学位论文 + 呈递给 CD4 T 淋巴细胞,诱发产生保护性抗体的体液免疫(Akbati et al,1999;Barry et al,1997;Wolff et al,1990)。 T 淋巴细胞通过其表面受体(TCR) (α/β链)识别由细胞表面主要组织相容