Western blot 检测蛋白
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达
Western blot 技术主要是通过电泳技术区分不同的蛋白质组分,并将所分离的蛋白质转移至固体支持体上,通过特异试剂和抗体作为探针,对靶蛋白分子进行检测的一种
方法
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。
实验过程:
一、制备SDS page凝胶
二、将代测样品,溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,确保蛋白质解离成单个多肽亚
基,尽可能减少相互间的聚集。
三、根据蛋白质的分子量,通过SDS-PAGE 电泳,使不同分子量的蛋白质互相之间分离。
四、把电泳分离的样品从凝胶转移到固相载体NC膜上。
五、与靶蛋白的检测抗体进行特异性反应。
六、带有标记的二级免疫试剂与上述特异性反应物起反应,利用其标记物进行检测。
一、制备SDS page凝胶
1、制胶玻板洗涤擦干,垂直装在制胶架上,并装在电泳槽上(自己加的),根据所测定的蛋
白质分子量的大小配制不同的胶浓度溶液,依次加入水,缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶母液, SDS、加速剂、催化剂等,配制?
2、灌制分离胶,上面加少量的去离子水,隔绝空气,保持胶凝固时,表面光滑,胶凝固控
制在30分钟左右,看到胶表面与上层水之间有一条明显的界限,表明胶已凝固,
3、从电泳槽中取下制胶板(加),弃上层水(倾倒掉水后,用小块滤纸将水吸干,),?在分
离胶上直接灌注浓缩胶?立即插入样品梳子,避免气泡,等待胶凝固
浓缩胶的制备:(5ml体系)
水 3.4ml
30%丙烯酰胺溶液0.83ml
1.5mol/L Tris (PH 6.8) 0.63ml
10% SDS 0.05ml
10%过硫酸铵(新鲜配制)0.05ml
TEMED 0.005ml
二、样品处理
1、原理:蛋白质加SDS,加强还原剂,蛋白质分子被解聚,解聚后的氨基酸侧链
与SDS充分结合,形成带负电荷的蛋白负SDS胶束,所带负电荷大大超过蛋白分子原有的电荷量,消除了不同分子之间的电荷差异。电泳中蛋白质亚基的迁移率取决于亚基分子量的大小,蛋白质本身的电荷因素可以被忽略。
2、步骤:在样品中加入2 SDS加样缓冲液,100℃沸腾3分钟,使蛋白质变性解
聚,准备上样,电泳
2 SDS加样缓冲液
二硫苏糖醇(DDT)
SDS
电泳指示剂溴酚蓝
甘油
三、电泳
1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳原理:电泳槽缓冲液的PH值和离子强度与配胶缓冲液不同,当两电极之间接通电流后,凝胶中形成移动界面,并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进,样品通过高度多孔的浓缩胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带,通过这种方法把样品浓缩成极小体积,使电泳的分辨力大大提高。
2、实验步骤:将凝固后的凝胶放入电泳槽中,加上tris-甘氨酸电泳缓冲液,小心取出梳子,不要弄破胶表面,?加入已处理好的样品,?电泳,控制电流或电压,打开电源,电泳时间3-4小时,电泳结束后关闭电源,取出凝胶,?从玻璃板上取出胶,切割需要的目的胶,放入装有培养皿中。
四、转膜
1、原理(动画):蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到固相支撑物上,半干式电转仪,凝胶及与之相贴的硝酸纤维素滤膜,加于事先用转移缓冲液浸泡过的滤纸之间,平放在电转仪上,负极朝上,正极朝下,凝胶在负极端,薄膜在正极端,转移方向从负极到正极。
2、实验步骤:测量凝胶大小,裁剪与凝胶一样大小的薄膜,浸入去离子水后,再浸入转移缓冲液内,?随后取出进行转移,在操作时要注意各层面之间不要有气泡(每加一层,可用玻璃棒擀平),凝胶在负极端,薄膜在正极端,转移方向从负极到正极。盖好电转仪的盖子,开电泳,(根据检测蛋白质的分子量,设定电流或电压及转移时间)室温进行转移,转移后取出薄膜,水漂洗一下,做好标记,在滤纸上吸干水分。
五、与靶蛋白的检测抗体进行特异性反应
1、原理(动画):
2、实验步骤:在进行抗反应前,需先进行封闭(注意,用封闭液时,要摇匀),用大分子物质封闭非相关的蛋白结合位点,降低非特异性结合背景,封闭液通常选用5%的低脂奶粉或牛血清白蛋白,将滤膜放入装有封闭液的培养皿中,平缓摇动1-2小时,取出滤膜,放在滤纸上,弃去封闭液,将滤膜放入塑料薄膜中,用封口机封闭,在一角剪一缺口,加入抗靶蛋白的特异一抗抗体,多数是多克隆抗体,与靶蛋白结合,用封闭液稀释一抗,挤出气泡,用封口机封好,4℃孵育2h或过夜(仪器震摇)。
剪口,弃去一抗液,用PBS-T漂洗薄膜3次(振动仪上),洗去未结合的抗体,
六、带有标记的二级免疫试剂与上述特异性反应物起反应,利用其标记物进行检测。
1、原理(动画):
2、步骤:加入带有检测系统的非特异性二抗抗体溶液,目前常用的检测系统是ECL化学发
光法,在室温下,平缓摇动2h,用PBS-T漂洗薄膜几次,进行ECL化学发光法,将漂洗后的滤膜在双蒸水中平衡5分钟,等比例混合底物,发光剂和增强剂,均匀的涂抹在薄膜上,反应5分钟,弃去表面液体,放入暗盒进行X光压片,约5分钟左右进行显影,最后观察结果
蛋白质的Western blot 技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点,使靶蛋白的检测量降低到1-5ng,因而它作为分子生物学的一种基本技术被广泛使用。