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彗星实验彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理:它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单,双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下,DNA片段可进入凝胶发生迁移,而在碱性电解质的作用下,DNA发生解螺旋,损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链,所以在电泳...

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彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理:它能有效地检测并定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 细胞中DNA单,双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下,DNA片段可进入凝胶发生迁移,而在碱性电解质的作用下,DNA发生解螺旋,损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链,所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像,而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重,产生的断链和断片越多,长度也越大,在相同的电泳条件下迁移的DNA 量就愈多,迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度,从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性,研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时,这种技术只需要少量细胞。 实验材料: 玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液(PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA)、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。 实验步骤: 1.制片:配制1%的琼脂糖凝胶,于微波炉中加热融化后,浸泡磨砂玻片,用吸水纸将玻 片滑面及四周吸干,自然晾干备用; 2.细胞处理:将细胞消化收集,离心后吸弃上清,用预冷的1*PBS清洗细胞一次,以1*10^5 细胞/ml悬浮细胞; 3.铺胶:将细胞与凝胶以一定的比例(1:10)混匀后迅速滴于玻片上,在显微镜下观察 细胞的数目(注意调整比例及铺板均匀),4℃黑暗环境中固化10min; 4.裂解:轻轻取出玻片,将玻片浸于预冷的细胞裂解液中,4℃避光裂解30-60min; 5.解旋:从裂解液中取出载玻片,用PBS浸泡玻片3次,每次3mim,用纸巾吸去玻片上 的液体,置于水平电泳槽,加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上,避光解旋30min; 6.电泳:电压30V,电流300Ma,电泳30min。 7.漂洗及染色:电泳完毕,取出玻片,用PBS浸泡2次,每次15min,以中和强碱。滴加 DAPI染色,立即置于荧光显微镜下观察。 结果观察: 荧光显微镜下20倍波长,激发波长377nm,发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞,记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=(拖尾细胞数/50)*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长,拖尾细胞尾长(TL)=全长-头长,计算各剂量组的平均尾长。
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分类:医药卫生
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