DNA的复制过程

DNA的复制过程 第二节 DNA的复制过程 一、DNA复制的起始点和方向 复制子 细胞中基因组DNA具有复制原点，并能够独立进行复制的单位称为复制子(replicon)。每个复制子都含有控制复制起始的复制原点(origin of replication，Ori)，这种复制原点在原核生物的染色体DNA中只有一个，复制一旦起始，必须使得整个基因组复制完成才可终止。在一个细胞周期中，复制子只能复制一次。 例如，在大肠杆菌的环状染色体DNA中，只有一个复制原点，因此是单复制子。 复制方向 复制方向大多是双向的，即分别向两侧进行复制，形成两个复制叉 (replication fork)或称为生长点(growing point)。也有一些生物DNA的复制是单向的，只形成一个复制叉。通常复制是对称的，两条链同时进行复制;有些则是不对称的，一条链复制后再进行另一条链的复制。在复制叉处DNA两条链解开，各自合成其互补链，复制时在电镜下观察可看到形如眼睛的结构，称为复制眼(replication eye)。 大肠杆菌 的DNA是双链环状，在镜下可观察到θ形结构。大肠杆菌的全部基因组含 6 有4.8X10bp，只有一个复制原点，大约在40分钟内能被完全复制。因此是单复制子。 真核生物 的一条染色体DNA中，有多个复制原点，因此是多复制子。例如在果蝇的 点。 一个染色体DNA分子中，估计有6000个复制原 在一般情况下复制从复制原点开始，而后向两个相反的方向伸展，进行DNA的复制。 96人的全部基因组大约有3X10bp，平均每条染色体的长度是130X10bp，其复制速率是50个核苷酸/秒，如果只有一个复制原点的话，复制完全部基因组大约需要几个星期。真核生物之所以能在很短的S期内(几个小时)完成自身染色体的复制，是靠很多个复制原点来完成的。 真核生物与原核生物染色体DNA的复制还有一个明显的区别: 真核生物染色体DNA在全部复制完成之前，原点不再重新起始复制;而在快速生长的原核生物中，原点可以连续起始复制。真核生物在快速生长时，往往采用更多的复制原点。 复制的起始点与方向见图10-3。 图 10-3 复制的起始点和方向 注:图内表示一个复制单元，由起始点向两个或单个方向生长，包含两个复制叉。 二、复制的主要阶段 (一)DNA双螺旋的解开 在大肠杆菌中，解链酶在复制叉内解开亲代双螺旋，分开的双链再和SSB结合，防止链内退火重新复性成为双链，使局部解开的两条单链可以作为复制模板。 不论线状或环状DNA分子，在细胞内均以超螺旋形式存在，而且局部解链会导致超螺旋应力的增加，会阻碍解链的前进。因此必须放出超螺旋应力。在大肠杆菌中是由拓扑异构酶II，即旋转酶切开环状超螺旋的两股，释放出超螺旋应力，而后再封口，除去环状DNA分子中的超螺旋。 (二)RNA引物的合成 DNA聚合酶都不能从头合成DNA新链，只能延长已经存在的DNA链。 在合成DNA链之前必须有一种引物。引物就是一小段互补RNA链，在末端的一个核苷酸要有一个游离的3′-OH。DNA聚合酶只能把底物(dNTP)转移到引物的3′-OH上去。大肠杆菌中合成RNA引物的酶是引发酶。它在合成RNA引物之前，还需要与dnaB蛋白的结合。 (三)DNA链的延伸 半保留方式 半不连续复制(semicontinuous replication) 在DNA复制过程中按照半保留方式。 两条链的方向 由于DNA两条链的方向是反平行的，一条的方向为5′?3′，另一条是3′?5′，按照模板的方向性，似乎应该有两类DNA聚合酶，分别催化5′?3′方向和3′?5′方向的复制，但迄今为止所发现的DNA聚合酶，只能催化5′?3′方向的合成。这就不能解释DNA的两条链为什么能够同时进行复制的事实。 半不连续复制 为了解决这个矛盾，冈崎于1968年提出了半不连续复制假说。他认为复制时复制叉向前移动，留下两条单链分别做模板，一条是3′?5′方向，以它为模板合成的新链是5′?3′方向，是连续的，称为前导链(leading strand); 冈崎片段 而另一条模板链是5′?3′方向，以它为模板，合成的新链是不连续的DNA片段，称作冈崎片段(Okazaki fragment)。在大肠杆菌中冈崎片段的长度约为1000个核苷酸，在哺乳动物中约为100-200个核苷酸。冈崎片段合成的方向也是5′?3′，但它与复制叉前进的方向相反，是倒退着合成的，由多个冈崎片段连接而成的这条新的子代链，称为滞后链(lagging strand)。 在一个复制叉内，两条新链的合成都是5′?3′方向，前导链是连续的，滞后链是冈崎片段。大肠杆菌DNA在一个复制叉内的合成过程见图13-7。 (四)RNA引物的切除 RNA引物的切除，在大肠杆菌中由DNA聚合酶?的5′?3′外切活性完成的，留下的空隙由该酶的5′?3′聚合活性填补。 图10-4 半不连续复制示意图 (五)冈崎片段的连接 最后，引物被切除并且空隙也已修复的冈崎片段由DNA连接酶封闭缺口，把小片段连接成完整的子代链。由于大肠杆菌的染色体是环状的，其5′最末端冈崎片段的RNA引物被切除后可借助于另半圈的DNA链向前延伸来填补，最后可在DNA连接酶的作用下首尾相连，形成完整的基因组基因。 而对于真核生物来说，其染色体基因组是双链线状，在复制后，不能像原核生物那样填补5′末端的空缺，从而会使5′末端序列因此而缩短，真核生物通过形成端粒结构来解决这个问题。 三、DNA复制的半保留性证明 早在1953年，J. Watson和F. Crick提出DNA双螺旋模型，半保留复制是双链DNA分子普遍的复制方式。1958年M. Meselson和F. Stahl用实验首先证明了半保留复制的正确性，迄今仍为大家所公认。 (一)DNA的半保留复制有重要的生物学意义 因为复制必须准确无误，否则将危及生物的生存。即利用半保留复制方式将自身DNA中蕴涵的全部遗传信息传给后代，例如大 910肠杆菌复制DNA时，10至10个碱基对才可能发生一个误差。 (二)为保证复制的准确性，细胞以下列机制提供相应的保障 ?DNA聚合酶?和?的5′?3′的聚合作用 DNA聚合酶?和?在模板引导下，按5′?3′进行DNA聚合时，可以严格按照碱基互补配对的原则进行合成。 ?DNA聚合酶?3′?5′外切酶活性 DNA聚合酶?可对已经加上去的核苷酸进行校对，当新合成的互补链上有错误的核苷酸时，即行使3′?5′外切酶活性，将连接上的错误核苷酸从3′端切除。 ?切除引物 由于刚开始聚合时较易发生错配，所以生命体选择先合成一段RNA引物， 然后由DNA聚合酶?的5′?3′外切酶活性将引物切除，再由DNA聚合酶的5′?3′聚合酶活性在切除引物处补平。 ?聚合时的方向 现在已知DNA的聚合都是5′?3′，为什么不能从3′?5′端聚合呢,原来，如果按5′?3′聚合，一旦出现碱基错配，可由DNA聚合酶?从3′端切除聚合上的错误的核苷酸，剩下3′-羟基，后者可以接受由以dNTP为原料而生成的单核苷酸， 即dNTP可以和上一个核苷酸的游离3′-羟基生成3′，5′-磷酸二酯键，dNTP自身水解掉焦磷酸。发生反应的原料本身即为高能化合物，靠磷酸键的水解即可保证此反应的顺利进行。而如果按3′?5′方向聚合时，出现了错配碱基后也可利用DNA聚合酶?的5′?3′外切酶活性将错配的核苷酸切除，切除后剩下 5′-羟基或5′-磷酸，继续聚合时，需要将5′-羟基或5′-磷酸核苷酸进一步磷酸化，或者需要外源的能够提供能量的物质，才能完成聚合反应。所以，生物体选择DNA合成的方向都是5′?3′，这是长期进化、选择的结果。 ?修复作用 虽然在复制过程中有校正功能，但是环境中的物理或化学因素还可以使DNA不断受到损伤，它们可以通过细胞的各种修复机制进行修复，具体内容见DNA的损伤与修复。 第三节 反转录合成DNA 发现 反转录酶(reverse transcriptase)是1970年在致癌RNA病毒(鸟类成髓细胞白血病病毒和劳氏肉瘤病毒)中首次发现的，后来发现该酶存在于某些RNA病毒和个别DNA病毒中。 功能 病毒反转录酶催化RNA指导下的DNA合成，即以病毒RNA为模板，以dNTP为底物，催化合成一条与模板RNA互补的DNA链，此DNA链称为互补DNA链(complementary DNA, cDNA)。反应方式与其它DNA聚合酶相同 方向 也是5′?3′合成，并需要RNA作引物。 过程 当致癌病毒的RNA进入宿主细胞后，首先在反转录酶的催化下，按上述方式合成一条cDNA链，形成RNA-DNA杂交分子。反转录酶中有RNase活性的组分水解杂交链中的RNA，被感染细胞内的RNase H也可水解RNA链。然后，再由DNA聚合酶I一边切除RNA，一边以第一链cDNA为模板，催化合成与之互补的另一条DNA链，形成双链DNA分子。 反转录酶有三种酶活性 其催化的反应是: ?RNA指导的DNA合成反应; ?RNA的水解反应; ?DNA指导的DNA合成反应。新合成的双链DNA分子可进入宿主细胞的细胞核中，并整合到宿主细胞的DNA中(不表达)，并与宿主细胞DNA一起复制而传递给子代细胞。在某种条件下此潜伏的DNA可活跃起来，转录出病毒RNA而使病毒繁殖。在另一种条件下它可以引起宿主细胞发生癌变。 第四节 DNA的损伤与修复(自学) 造成DNA损伤的原因可能是生物因素、物理因素或化学因素，DNA的重组，病毒的整合，某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂都会造成DNA局部结构和功能的破坏，受到破坏的可能是DNA的碱基、核糖或是磷酸二酯键，DNA在复制过程中也仍然可能产生错配。造成DNA损伤的因素可能来自细胞内部，也可能来自细胞外部，损伤的结果是引起生物突变，甚至导致死亡。 保证DNA分子的完整性对于生物是至关重要的。在长期的进化过程中，生物体获得了复杂的DNA损伤修复系统，可以通过不同的途径对DNA的损伤进行修复。这些途径可分成两大类:光诱导的修复(光复活)和不依赖于光的修复(暗修复)。暗修复又有三种不同的机制，即切除修复，重组修复和应急修复。 本章小结: 遗传信息的传递依据中心法则进行。遗传信息经亲本DNA的复制后～完整准确地传给子代。复制具有半保留性。有多种酶和蛋白因子参与DNA的复制～包括解链酶、引发酶、DNA聚合酶、拓扑异构酶和连接酶等。原核生物的DNA聚合酶?是主要的复制酶。真核生物的DNA聚合酶有5种～分别负责核DNA和线粒体DNA的复制。DNA聚合酶以dNTP为原料～通过形成3′—5′磷酸二酯键延长多核苷酸链～并有校对和纠错的功能。此外～真核细胞的端粒酶可防止复制后子代线性化基因组DNA缩短。 DNA复制通常是从特定的复制原点开始～有双向进行的～也有少数单向进行的。由于双链DNA模板走向相反～且子链的合成总是5′?3′～因此复制采取的方式是半不连续的～连续合成的子链称为前导链,而通过不连续合成冈崎片段然后形成的子链称为滞后链。复制起始时都需要RNA引物～原核生物的RNA引物最终由DNA聚合酶?切除并将留下的空隙填补～再由DNA连接酶连接起来。 在反转录酶的作用下～可以RNA为模板合成DNA。其他类型的复制方式还有噬菌体DNA的滚环复制和线粒体DNA的取代环复制等。 一些物理、化学和生物学因素～可以导致DNA受到损伤。光复活、切除修复、重组修复和SOS修复是几种主要的修复方式。其中光复活是唯一利用光能的修复系统～其余的修复系统均以ATP作为能源。光复活和切除修复都是修复模板链～重组修复可以将损伤的影响降低到最大限度～而SOS修复虽可产生连续的子代链～但也是导致突变的修复。