ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究本科毕业论文（可编辑）

ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究本科毕业论文（可编辑） ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究本科毕业 论文 全日制普通本科生毕业论文 ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异ANALYSIS OF GENETIC VARIATION OF PLEUROTUS ERYNGII STRAINS BY ISSR MARKER 学生姓名: 学 号:年级专业及班级: 指导老师及职称: 学 院: 湖南??长沙 提交日期:20 年 月 湖南农业大学全日制普通本科生毕业论文 诚 信 声 明 本人郑重声明:所呈交的本科毕业论文(设计)是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 毕业论文作者签名: 年 月 日 目 录 摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 关键 词„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 1 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..2 1.1 杏鲍菇有效成 分„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 1.2 杏鲍菇药理作 用„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 1.3 分子标记技术研究现 状„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.„3 2.1 供试菌 株„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.2 培养 基„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.2.1 试管斜面培养 基„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2.2.2 液体PDA培养基„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.3 主 要仪器与试 剂„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.4 试验方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.4.1 菌丝培 养„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 2.4.2 DNA的提取和检 测„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.4.3 ISSR反应体系优 化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.4.4 ISSR引物的筛 选„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2.4.5 PCR产物的电泳检 测„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 2.4.6 数据统计与分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3. 结果与分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 3.1 DNA质量检 测„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 3.2 ISSR反应体系的优 化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 3.2.1 扩增程序的选 择„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„. 7 3.2.2 PCR反应体系的优 化„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 7 3.3 ISSR引物的筛 选„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3.4 ISSR扩增„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3.5 样品的相似系数及UPGMA聚类分析„„„„„„„„„„„„„„„„9 4. 小结与讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 12 参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„附录 1„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异 学 生:黄民凤 指导老师:刘东波 湖南农业大学园艺园林学院，长沙，410128 摘 要:杏鲍菇 是近年来人工栽培成功的集食用、保健、药用功能于一体的珍稀食用 菌。目前采用ISSR分子标记对其遗传差异研究较少，本验以CTAB改 良法-II对24个杏鲍菇品种进行了DNA的提取，应用ISSR技术分析 了菌株的DNA序列多态性，从22引物中筛选出11ISSR引物对24个 菌株基因组DNA进行PCR扩增。采用平均分类法UPGMA分析表明，相 似系数为0.6250左右时，24个不同品种被分为4大类，20号菌株独 成一类，说明20号菌株与其它各菌株遗传距离较远。其中，1与3， 6，7，8，10，11，13的遗传相似系数，高达0.9510以上，这几个 菌株亲缘关系很近。24个品种的ISSR分析，对我们选择优良亲本、 进行单孢杂交以及育种研究提供了重要依据。 关键词:杏鲍菇;ISSR分子标记;PCR扩增;聚类分析 Analysis of Genetic Variation of Pleurotus eryngii Strains by ISSR Marker Student: Minfeng Huang Tutor: Dongbo Liu (College of Horticulture and Gardening, Hunan Agricultural University, Changsha,410128, China) Abstract: Pleurotus eryngii is one of the rare edible fungi for food, health protection and medicinal function. urrently, there is little study on the genetic analysis of Pleurotus eryngii by ISSR marker. Improved CTAB method-II was used to isolate the DNA and inter-simple sequence repeats ISSR method was used to analyze the DNA sequence polymorphism of 24 Pleurotus eryngii varieties. Eleven primers were chosen from 22 primers for ISSR analysis. UPGMA analysis showed that these strains were divided into 4 groups at genetic similar coefficients GSC of 0.6250, No.20 strain was one group, which indicated that the genetic distance of No. 20 was far away from that of others. The genetic similar coefficients between No. 1 and No.3,No.6,No.7,No.8, No.10,No. 11,No.13 was highest up to 0.9510 which indicated that the genetic relationship of these strains is close. ISSR analysis of these 24 strains was the basis for the research of good parent strains chosen, single spore hybrid and breeding. Keywords: Pleurotus eryngii; ISSR molecular marker ;PCR amplification; Clustering analysis 1 前言 杏鲍菇 Pleurotus eryngii 始生长于伞形花科 Umbelliferae 刺芹属 Eryngium 刺芹枯死的植株上，所以又名刺芹侧耳，隶属于真 菌门、真担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属〔1~2〕。台湾省和福建 省根据该菇具有含仁香味、称为杏仁鲍鱼菇，简称杏鲍菇。杏鲍菇是 典型的亚热带草原一种干旱沙漠地区的野生食用菌。在自然条件下， 于春末至夏初生于伞形科植物田刺芹，阔叶拉瑟草以及阿魏等植物的 地下根茎及周围土壤中，营腐生、兼性寄生生活。杏鲍菇有许多生态 型，各生态型垂直分布完全不同，主要分布于南欧、北非、中亚等地 区〔3~4〕。据中科院青藏高原综合科学考察队 1996 《横断山真菌》记载，我国四川、青海、新疆也有分布，是一种极宝贵的种质资源。杏鲍菇是一种优质大型肉质伞菌，菌柄粗壮，具有杏仁香味，菌肉肥厚似鲍鱼。 1.1 杏鲍菇有效成分 杏鲍菇质地脆嫩且营养丰富。杏鲍菇干品含蛋白质21.44,，脂肪1.88,，还原糖2.17,，总糖36.78,，甘露醇2.27,，游离氨基酸2.36,，总碳水化合物57.35,，水溶性成分66.9,，灰分7.83,，水分11.56,。与香菇、银耳和黑木耳干品相比，杏鲍菇蛋白质含量和灰分含量较高，甘露醇、游离氨基酸含量也丰富，而脂肪含量和总糖含量较低。林衍铨[5]等人通过分析杏鲍菇子实体蛋白质的含量、氨基酸组成，并采用国际上通用的 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 方法对供试菌株进行蛋白质营养评价，实验结果表明，杏鲍菇含有17种氨基酸 色氨酸未测 ，其中7种是人体必需氨基酸，占氨基酸总量的42,以上。子实体和菌丝体的维生素C含量分别为21.4mg,100g和13.9mg,100g。杏鲍菇符合世界卫生组织 WHO 提出的蛋白模式必需氨基酸 E, 总量应达到40,左右的要求，具有很高的营养价值。 1.2 杏鲍菇药理作用 杏鲍菇可显著提高人体免疫功效，并有抗癌、降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、美容[6]、防止心血管病等功效。研究发现杏鲍菇多糖对自由基引起的亚油酸、菜油氧化以及离体肝脏组织的脂质过氧化均有一定的抑制作用[7]，作为一种调节剂，在激活T淋巴细胞中具 有强烈的宿主介导性，能刺激抗体形成、增强人的免疫力、发挥抗癌作用[8]。一项研究还表明杏鲍菇对脂肪肝、急慢性肝炎、心肌梗塞均有良好的预防和治疗作用[9]。 1.3 分子标记技术研究现状 近年来，随着分子生物学的迅速发展，分子标记技术被广泛地应用于群体遗传多样性研究，上世纪80年代出现的RFLP和90年代出现的RAPD分子标记技术，已广泛应用到香菇、金针菇、双孢蘑菇、侧耳等食用菌遗传多样性、菌株鉴别和育种研究中〔10~13〕。加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等(1994)发展的ISSR(Inter-simple SequenceReqeats)是基于SSR发展来的一种新型分子标记技术〔14〕，其生物学基础是基因组中存在的简单重复序列(SSR)，以SSR基序序列为基础设计长度为16 bp~18 bp的引物，对基因组DNA的SSR区域进行PCR扩增，不同物种基因组DNA中的SSR数目和间隔的长短不同，就可导致特定结合位点分布发生相应的变化，从而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变，根据谱带的有无及相对位置，分析不同样品间ISSR标记的多态性，该技术可以和RAPD一样用于各类动植物的研究，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD等标记更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且比RAPD技术更加稳定可靠，实验重复性更好〔15~18〕。同时，ISSR分子标记技术能够从基因水平揭示出菌株间亲缘关系和遗传差异，可以为育种准确提供选育亲本材料的遗传信息，提高育种针对性，进而辅助高产优质品种的选育。目前，张介驰等用ISSR分子标记技术分别对黑木耳、银耳、金针菇等 食用菌进行了遗传多样性的研究〔19~21〕。冯伟林等[22]应用ISSR技术分析了杏鲍菇生产性菌株的DNA序列多态性，从20引物中筛选出11ISSR引物对12个杏鲍菇生产性菌株基因组DNA进行PCR扩增。结果表明，这些杏鲍菇菌株遗传相似系数为0.68,1.00。采用平均分类法UPGMA分析表明，在遗传相似系数为0.83处可将这12个杏鲍菇生产性菌株分成3类。亲缘关系分析，为杂交育种提供了很好的指导意义 2 材料与方法 2.1 供试菌株 供试菌株为干预技术实验室保存菌种。来源见表1表1 供试菌株信息 Table 1 of strains 编号 原编号与名称 编号 原编号与名称 1 穗光 8 韩国2号 2 广州009-1 9 新分-004-1 3 佳丰 10 杏大二号 4 ZX00-1 11 杏大? 5 龙海继代 12 正兴一号 6 杏大一号 13 杏大三号 7 杏大? 14 杏大?号 编号 原编号与名称 编号 原编号与名称 15 A-1×C-1 杏大009-1 20 9-1× b 3-2 16 A-2×C-2 杏大009-1 21 A-1×B-1 杏大004-1 17 9-5×3-1 22 9-1× c 3-1 18 9-1× b 3-1 23 9-1× a 3-2 19 A-2×B-2杏大009-1 24 9-1× a 3-1 2. 2 培养基 2.2.1 试管斜面培养基 母种加富PDA培养基[23]:马铃薯200 g葡萄糖20 g蛋白胨5 g，KH2PO4 3 gMgSO4??7H2O 0.5 g，琼脂20 g，PH自然2.2.2 液体PDA培养基 杏鲍菇适宜的液体培养基为:葡萄糖3.0%;蛋白胨0.2%;KH2PO40 .05%;MgSO4 0.05%;PH 6.5。 2.3 主要仪器与试剂 试剂:葡萄糖、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、蛋白胨、酵母粉、V、液氮、Tris-HCl、EDTA、NaCl、CTAB、PVP、β-巯基乙醇、Tris-酚、氯仿、异戊醇、乙酸钠、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、TE溶液、RNAse、蛋白酶、氯化苄、DNA Loading Bruffe、琼脂、EB、ddH2O等。 仪器、设备:电子天平?:AL 204-IC Mettler Toledo ，pH计:Seven Multi Mettler Toledo ，超纯水仪:PALLPL5243，通风柜:Kerric，微波炉:Galanz WD900SL 23-2，冷冻离心机:HITACHI CF 15R，紫外可见分光光度计:Shimadzu UV1800 ，移液器:Eppendorf，电泳仪:DYY-4C型 北京市六一仪器厂 ，PCR扩增仪:东胜龙 EDC-810 Biometra gradient，凝胶成像系统:Gel Imaging System G:Box, Syngene。 2.4 试验方法 2.4.1 菌丝培养 杏鲍菇采用液体摇瓶培养方法，培养基配制好后置于高压灭菌锅 里灭菌30 min，接种前把菌种置于25?培养室中活化2 d，接种时在无菌工作接种台操作，接种量为10%，接种后把接好的菌种放在25?培养室中活化2 d后，转入摇床中培养，摇瓶装量100-140 ml/500ml，摇瓶转速150 r/min，培养温度25?，最佳培养时间7 d。每天观察菌丝体生长情况，若污染及时处理。待到菌丝体长后及时取出，4?保存备用。 2.4.2 DNA的提取和检测 DNA的提取: CTAB改良法-II[24]: 1. 取菌丝体0.5 g在预冷的研钵中加入液氮迅速研磨成细粉，置于10 mL 离心管中，加入65 ?预热的CTAB提取缓冲液4mL，充分振荡混匀，65 ?温育1 h，每隔10,15 min小心振荡混匀一次; 2. 12000 r/min离心10 min; 3. 加入30%体积的无水乙醇; 4. 取上清，加4 mL苯酚?氯仿?异戊醇 25??24?1 ，12000 r/min离心10 min; 5. 取上清，加入1/10体积乙酸钠(3 mol/L, pH 5.2)，等体积-20 ?预冷的异丙醇，混匀，-20 ?放置过夜; 6. 12000 r/min 离心10 min，弃上清液; 7. 取沉淀，用70 %乙醇洗涤2次，室温挥干乙醇，直至沉淀无醇味但仍保持湿润; 8. 50 μL TE溶液溶解DNA; 9. 加入0.5 μL 50 mg/ml RNase 消化1 h。 DNA质量检测: 1 紫外分光光度计检测 将所得DNA 提取液稀释一定倍数，于Shimadzu UV1800紫外分光光度计上测定260，280 nm处的吸光度以及DNA 浓度，并根据OD260/ OD280的值判断DNA 纯度。 2 电泳检测 将所得DNA 于1.0%琼脂糖凝胶(含EB,溴化乙锭)中进行电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察。 2.4.3 ISSR反应体系优化 对ISSR分子标记体系中的Mg2+浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度及 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA用量进行了单因子多水平比较试验。 (1)Mg2+浓度 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L 6个浓度梯度。 (2)Taq酶用量 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U/25μL 6个浓度梯度。 (3)dNTPs浓度 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L 6个浓度梯度。 (4)引物浓度 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L 5个浓度梯度。 (5)模板DNA用量 37.5、75.0、112.5、150.0 ng/25μL 4个梯度。 PCR反应总体系:25 μL。 反应的PCR 扩增程序为:94?预变性5 min，94?1 min，35? 1min，72? 2min，5个循环;94? 1min，50-55? 1min，72? 2min， 35个循环;最后72?延伸10 min，4?保存。反应在GeneAmp PCR System9700仪上进行。 2.4.4 ISSR引物的筛选 ISSR引物来源于已公开发表的食用真菌的相关文献，选择了引 物22条，如表2.4.4。引物由华大基因合成。 Table 2 ISSR Primer Sequences 引物编号 引物序列 引物编号 引物序列 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 818 CACACACACACACACAG 820 GTGTGTGTGTGTGTGTC 825 ACACACACACACACACT 826 ACACACACACACACACC 827 ACACACACACACACACG 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 861 ACCACCACCACCACCACC 864 ATGATGATGATGATGATG 873 GACAGACAGACAGACA 880 GGAGAGGAGAGGAGA 881 GGGTGGGGTGGGGTG 889 DBDACACACACACACAC 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA 考虑 到时间和成本，本试验选用6份材料(表2的1,6号菌种)对ISSR 分子标记的22条引物进行筛，三次以确定其重复性，筛选出条带清 晰、差异明显的引物，然后对全部试验材料进行ISSR扩增。 2.4.5 PCR产物的电泳检测 PCR产物于1.4%琼脂糖凝胶(含EB)中进行电泳检测，电泳缓冲液1×TAE，在SYNGENE 型凝胶成像系统下观察、拍照，检测PCR效果。 2.4.6 数据统计与分析 以最适条件进行PCR扩增，扩增得到的指纹图谱使用软件NTSYS-pc 2.11a(Numerical Taxonomy Multivariate Analysis System, version 2.11a)进行数据分析。电泳获得的扩增图谱中的每一条带(DNA片段)均代表了模板与引物的一个结合位点，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点，其产物按扩增阳性“1” 强带和可分辨、稳定性、重复性好的弱带均赋值为1 和扩增阴性“0”记录电泳带谱，进行统计，利用Ntedit录入数据，形成“0-1”数据表。使用软件包中的SimQual计算相似性系数，得到相似系数矩阵，用其中SAHN程序和UPGMA Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Averages 方法进行聚类分析，通过Tree plot模块生成聚类图。相似系数的范围为0,1，当相似系数接近0，说明两菌株间的相似性程度越小，接近1，说明相似性程度大。 3. 结果与分析 3.1 DNA质量检测 取2 μL DNA样品与适量溴酚蓝混合，用1.3%的琼脂糖凝胶(含EB)进行检测，在凝胶成像系统上拍照，有一条清晰的条带，点样孔处无杂质 如图1 。同时采用紫外分光光度计检测其OD260/OD280值，均在1.8,2.0之间 图1 DNA样品电泳检测 Fig. 1 Electrophoretogram of DNA samples3.2 ISSR反应体系的优化 3.2.1 扩增程序的选择 参考已公开发表的文献，反应程序为:94?预变性5 min;94?变性1 min，50-55?退火1 min，72?延伸1 min，共40 个循环;72?最后延伸10 min。 3.2.2 PCR反应体系的优化 (1)Mg2+浓度对PCR扩增的影响:Mg2+浓度会直接影响扩增条带的强弱，对其扩增的特异性和分辨率都有显著的影响。Taq DNA聚合酶是一种镁离子依赖性酶，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，而浓度过低，会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。此外还会影响模板与PCR产物的解链稳定性、引物与模板之间的结合效率、产物的特异性和引物二聚体的形成[25]。由图2电泳图谱可知，Mg2+浓度在2.5mmol/L时，条带丰富清晰，随着Mg2+浓度的增加，条带模糊。因此，适宜的Mg2+浓度为2.5mmol/L。 图2 三个因素不同浓度梯度的ISSR扩增图谱 Fig. 2 Electrophoresis patterns of ISSR in different concentration of three factors 1-6泳道: Mg2+浓度梯度(分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L); 7-12泳道: Taq酶用量(分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U/25μL); 13-18泳道: dNTPs浓度梯度(分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L)。 (2)Taq DNA聚合酶的用量对PCR扩增的影响:Taq DNA聚合酶是PCR扩增能否成功的关键。Taq DNA聚合酶浓度过高，不仅浪费而且会引起非特异性扩增。由图2可知，当Taq DNA聚合酶浓度升高至1.0U/25μL时，扩增条带清晰，且产量增加。因此，合适的Taq DNA聚合酶浓度应为1.0 U/25μL。 (3)dNTPs浓度对PCR扩增的影响:dNTPs浓度是影响扩增效果的另一个重要因素。dNTPs为PCR扩增提供原料，dNTPs浓度过低将降低PCR产物的产量，浓度过高虽可增加产物的产量，却会增加碱基的错误掺入率，影响与引物的结合，导致非特异性扩增，适当地降低浓度反而会提高反应的准确度。此外，dNTPs还会与Mg2+结合，形成Mg2+-dNTPs复合体，影响Mg2+总体含量，从而降低TaqDNA聚合酶的活性，影响PCR扩增效率。由图2看出，dNTPs浓度为0.20 mmol/L时，扩增条带丰富清晰，随着dNTPs浓度的增加，条带反而减少减弱。因此，合适的dNTPs浓度应选择在0.20 mmol/L。 (4)引物浓度对PCR扩增的影响:引物质量、引物浓度、正反向引物浓度的一致性，也是PCR扩增的影响因素之一。引物浓度过低，与模板DNA结合率低，产物产量降低;引物浓度过高则会引起错配和非特异性扩增，也会引起引物二聚体的形成。 3.3 ISSR引物的筛选 通过对22条ISSR引物进行筛选，选出11条带型清晰、差异明显的引物(见附录1)。它们分别是807、808、809、825、827、835、836、840、842、864、880。 3.4 ISSR扩增 用筛选出来的11条具有明显差异带的引物对试验材料进行PCR扩增，经统计，11条引物共扩增出清晰条带133条，其中多态性条带为133条，各引物扩增出的条带数范围为8,15，平均每对引物扩增的条带数为12.1条，11条引物扩增出的DNA条带全部为多态性条带，多态性比率100%。扩增片段大小均集中在200,2000bp之间，扩增电泳图详见附录。扩增是在Veriti PCR System AB 仪上进行。 3.5 样品的相似系数及UPGMA聚类分析 采用NTSYSpc软件中的SIMQUAI程序进行数据分析，获得各菌株间的遗传相似系数矩阵(表3)，品种间的相似系数范围为0.3671~0.9843。最大相似系数均分别出现1与3、6、7、8、10、11、13之间，最小相似系数出现在20和21、23之间。 用UPGMA聚类法对24株杏鲍菇样品菌株进行聚类分析，获得树形图 如图3 ，在相似系数为0.6250左右时，样品被分为4大类，20同样独成一类(记作IV类);18，22;14和15同样聚为一类(分别记作III、?类)，其余聚为一类(记作?类)。大约在相似系数为0.860时，I类又分为四大亚类，第一亚类包括了分别为1、3、4、6、7、8、10、11、13、17号等10个菌株。第二亚类包括了23、24号菌株，第三亚类包括2、4、5、9、12号菌株，第四大类包括了16、 19、21号菌株。 Table3 Similar coefficient matrix based on ISSR makers 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1 1.0000 2 0.7890 1.0000 3 0.9609 0.7656 1.0000 4 0.8515 0.8125 0.8437 1.0000 5 0.7812 0.9765 0.7734 0.8203 1.0000 6 0.9609 0.7656 0.9687 0.8593 0.7734 1.0000 7 0.9687 0.7890 0.9765 0.8671 0.7968 0.9765 1.0000 8 0.9609 0.7812 0.9687 0.8593 0.7890 0.9843 0.9765 1.0000 9 0.7578 0.9531 0.7500 0.8437 0.9453 0.7656 0.7734 0.7812 1.0000 10 0.9687 0.7734 0.9453 0.8828 0.7812 0.9453 0.9687 0.9453 0.7890 1.0000 11 0.9531 0.7578 0.9296 0.8671 0.7656 0.9296 0.9531 0.9296 0.7734 0.9843 1.0000 12 0.7578 0.9218 0.7500 0.8281 0.9140 0.7656 0.7734 0.7656 0.9687 0.7890 0.7890 1.0000 13 0.9687 0.7734 0.9453 0.8515 0.7812 0.9609 0.9687 0.9453 0.7578 0.9687 0.9687 0.7578 1.0000 14 0.4531 0.5234 0.4609 0.4453 0.5312 0.4609 0.4531 0.4609 0.4921 0.4218 0.4062 0.4765 0.4375 1.0000 15 0.4062 0.4765 0.4140 0.4140 0.4843 0.4296 0.4062 0.4296 0.4609 0.3750 0.3593 0.4296 0.3906 0.8437 1.0000 16 0.8281 0.8203 0.8046 0.8203 0.7968 0.8046 0.8281 0.8046 0.7890 0.8125 0.7968 0.7734 0.8125 0.4687 0.4062 1.0000 17 0.8750 0.7421 0.8671 0.8203 0.7187 0.8984 0.8750 0.8828 0.7578 0.8750 0.8593 0.7734 0.8593 0.4375 0.3906 0.7812 1.0000 18 0.4062 0.4296 0.4296 0.4296 0.4375 0.4140 0.4218 0.4296 0.4296 0.4062 0.4062 0.4140 0.3906 0.6093 0.6093 0.4375 0.3750 1.0000 19 0.8046 0.7968 0.8125 0.7968 0.7890 0.7968 0.8046 0.8125 0.7812 0.7890 0.7890 0.7656 0.7890 0.4609 0.4140 0.8671 0.7578 0.3828 1.0000 20 0.4218 0.3984 0.4296 0.3984 0.3906 0.4296 0.4218 0.4296 0.3984 0.4062 0.3906 0.4140 0.3906 0.6250 0.5781 0.4062 0.4375 0.6562 0.3671 1.0000 21 0.8203 0.8437 0.8125 0.8593 0.8359 0.8125 0.8203 0.8281 0.8281 0.8046 0.7890 0.7968 0.8046 0.4765 0.4453 0.8984 0.7890 0.4296 0.9218 0.3671 1.0000 22 0.4140 0.4375 0.4218 0.4218 0.4296 0.4218 0.4296 0.4062 0.4218 0.4140 0.3984 0.4218 0.4140 0.6484 0.6015 0.4921 0.4140 0.8359 0.4218 0.6328 0.4375 1.0000 23 0.8619 0.7656 0.8437 0.8593 0.7734 0.8593 0.8515 0.8593 0.7812 0.8671 0.8671 0.7812 0.8515 0.4296 0.4140 0.7734 0.8046 0.4140 0.8125 0.3671 0.8125 0.3750 1.0000 24 0.8359 0.7500 0.8281 0.8437 0.7578 0.8437 0.8359 0.8437 0.7812 0.8515 0.8359 0.7656 0.8203 0.4453 0.4453 0.7578 0.8515 0.4453 0.7656 0.4453 0.7812 0.4062 0.9062 图3 24个杏鲍菇品种ISSR标记的聚类图Fig.3 Dendrogram baesd on ISSR markers of 24 Pleurotus eryngii strains 4 小结 运用ISSR分子标记对杏鲍菇进行分析，首先对其反应条件进行了优化。最终反应体系体积为25μL，包括2.5μL 10×Buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.20 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，0.2 μmol/L的引物，DNA模板75 ng。PCR扩增程序为:94预变性5 min;94变性1 min，50退火1 min，72延伸1 min，共40 个循环;72最后延伸10 min，16保存。 本试验仅筛选了22条引物就筛选出了条带清晰、差异明显的ISSR引物11条，说明了本试验材料丰富的遗传多样性。用此11条引物进行24份材料的ISSR分子标记，利用NTSYS-pc软件进行UPGMA聚类分析。聚类分析结果显示，在相似系数为0.6250左右时，样品被分为4大类，20号菌株独成一类(记作IV类)，说明20号菌株与其它各菌株遗传距离较远。其中，13，6，7，8，10，11，13的遗传相似系数高，高达0.9510以上， 参考文献 [1] 黄年来.一种市场前景看好的珍稀食用菌一杏鲍菇[J].中国食用菌，199817(6):3-4. 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