罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究

罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 密 缓: 国内图书分类号: . 保密期间: 分类号: 项目 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 类型: 基础研究 论文选题来源: 全目制学术型硕士学位论文 罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 硕士研究生: 庞碧剑 指导教师: 吴灶和研究员简纪常教授 理学硕士 学位类别: 学 科: 海洋生物学 研究方 向: 海洋环境与生物资源保护 培养单位: 水产学院 授予学位单位: 广东海洋大学 年月日 论文提交日期:一 :: 斗’ 确覃 . 。一‘’棚?’‘?, 甜? 一. 一十;?二二.二.一?.一。 ?学位论文答辩委员会组成 主席: 神阵 委员 谚觞俐细 缈嗲%伽 导师。稳勉~ 时间:乃、、旷扣 崤. 攀 ‘?掣广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个 人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体, 均 己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名:偏魄锚 年月。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借 阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编八有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于、保密口,在??年解密后适阐本授权书。 、不保密。 请在以上相应方框内打“巾 协瑰锚 年月。日 作者签名: 聊端:氰衅?”.。一~一一?一一?~一二.一罗非鱼免疫记及体外淋巴细胞增殖的研究 摘要 为研究对象,对其进行腹腔二扶注 本研究以罗非鱼 射外源性蛋白一人后,分离其头肾、脾脏及外周血淋巴细胞进行体内外检测罗非鱼 免疫应答。 罗非鱼首次及二次免疫后,利用技术检测其头肾、胂脏和外周血中特异 性的分布以及用检测血清中抗体水平.发现首次免疫后可在头肾中检测 出:头肾、外周血以及脾脏中的都在第达到最大值,头肾中的数量 要显著大于外周血及脾脏的数量;血清中的抗体也在第达到虽大值。二次免 疫后检测到罗非鱼的头肾、血液和脾脏中数量达到最大值的时间均比首次免疫最 大值时间要提前,头肾、外周血及脾脏中数量的最大值分别是首次免疫最大值 的倍、倍和倍以上,头肾中的数量仍是种组织中是多的,说明头肾是 及抗体的主要来源,并且是鱼类免疫应答的主要器官;二次免疫血清抗体水平显著高于 首次免疫。从各组织中增殖的倍数以及血清中增加的抗体水平来看罗非鱼的二 次免疫比首次免疫更快速,效率更高.证明罗非鱼具有的免疫记忆。 体外培养罗非鱼淋巴细胞。检测发现受免罗非鱼头肾、脾脏和外周血淋巴细 胞在抗原人刺激下均有不同程度增殖,其中外周血淋巴细胞的增殖是三者中最显著 的,其次是头肾,而脾脏淋巴细胞对抗原刺激的反应不明显:用技术检测发 现在未加入抗原条件下,头肾中体外存活的时间比脾脏和外周血中存活的时 间长.而且培养液中抗体水平持续增加,说明头肾中的属于长寿命浆细胞 ;加入 ,;而脾脏和外周血属于短寿命浆细胞 抗原人后并投有看到明显的增殖,而且由于抗原抗体的中和作用,种组织淋 巴细胞的数量迅速减少,相应抗体水平检测也说明外源性蛋白抗原在体外对淋巴 细胞无刺激增殖作用;加入非特异性抗原刺激后,种组织中的均有明显增 ,说明外周 殖,第达到最大值,其中以外周血中增殖的数量最显著 血中存在较多的浆母细胞,能在刺激下转化增殖为特异性。 本研究 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了罗非鱼首次和二次特异性免疫应答,建立了罗非鱼淋巴细胞体外刺激 后增殖转化实验的基础数据,进一步研究了罗非鱼淋巴细胞的体外增殖水平,为探讨 鱼类的免疫记忆提供了一定的科学理论依据.并丰富和发展了鱼类免疫学的研究内容。 关键词:罗非鱼.抗体水平,,体外增殖.免疫记忆 , ;, ’, , ,,;.?, ,. 曲”, , : ,” ’, , ; ,, 口 ’ , ; , , 曲 ,? 山 , :,,, .. ? ?。。’却嘲怫。’扣..‘?,一’~一~????’~?.一;.英文缩略语注释 英文全称 中文全称 缩略语 抗体分泌细胞 长寿命浆细胞 ? 短寿命浆细胞细菌脂多糙重力加速度 显著性差异水平 / 值 酶联免疫斑点法酶联免疫吸附试验 ? 四甲基偶氮唑盐比色 一,一? 法 磷酸赫缓冲液 二甲基亚砜小时纳米 微克 天 升?培养基 一 . 分钟 毫升 光密度 微升 一氨基一一乙基咔唑 一一“ ...四甲基联苯 ,咒, 胺‘警辩:’薹 萨~ 咛叫:’‘耸啦 ,蒜.如’: 。 。’’杆 ’。’?一彳????~??‘ 』目录 摘 要?.。??............................................................. .................................................................. 文献综述??.鱼类体液免疫概述鱼类免疫器官?.. 月目腺肾脏? 脾脏 .黏膜相关淋巴组织.鱼类免疫细胞? 淋巴细胞特性 .浆细胞类群 鱼类抗体的研究 鱼类体液免疫记忆 鱼类免疫研究方法及进展 检测抗体效价淋巴细胞的分离技术 检测免疫细胞 研究日的及意义 罗非鱼淋巴细胞分离引言 实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 .主要仪器设备? . 主要试剂主要溶液配制? 实验鱼实验方法 尾静脉采血 一 淋巴细胞分离 . 细胞计数? 数据整理 .结果与分析一 . 罗非鱼外周血淋巴细胞分离结果 . 分离细胞的形态观察讨论 稀释倍数对外周血淋巴细胞分离的影响离心力对外周血淋巴细胞分离的影 响 试验最优条件的确定..实验材料一 仪器设备主要试剂 溶液配制 实验鱼免疫 .实验方法 . 鼠抗罗非鱼与羊抗鼠最佳结合比例 外周血淋巴细胞的分离 . 细胞计数 . 包被浓度的确定 .细胞孵育时问的确定 一数据整理 ~ 结果与分析?.. . 鼠抗罗非鱼州与羊抗鼠?最佳工作浓度 .? 包被抗原浓度的确定 .细胞孵育时削的确定 .讨论? .. 首次和二次免疫后罗非鱼特异性及血清抗体水平检测 实验材料 ..仪器设各 .主要试剂 一 溶液配制 实验鱼 免疫 实验方法 ~ 淋巴细胞悬渡制各细胞计数 .特异性检测血清抗体水平检测数据整理 一 结果与分析 .首次免疫后三种组织中特异性的检测 .二次免疫后三种组织中特异性的检测 . 首次免疫技二次免疫后血清中特异性抗体水平检测讨论 法检测罗非鱼淋巴细胞体外增殖?. ~ 占实验材料 仪器设各 . 主要试剂 . 溶液配制 实验鱼 一 免疫 实验方法.淋巴细胞悬液制各 细胞计数 正交试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 一 . 法筛选最佳培养条件. 最佳培养条件榆测淋巴细胞增殖? . 数据整理 .结果与分析.正交试验结果 .最佳条件下三种组织淋巴细胞增殖结果 .. 讨论 检涮淋巴细胞体外增殖??. 引言 .实验材料 ..仪器发各主要试剂溶液配制实验鱼 免疫 实验方法? .淋巴细胞悬液制各? 细胞计数细胞体外培养及加入抗原刺激 淋巴细胞中特异性检测 细胞培养液中抗体水平检测? 数据整理 ~? .结果与分析 . 特异性体外存活检测结果. 加入抗原人孵育培养结果 . 加入刺激培养结果 讨论头肾、脾脏和外周血中浆细胞的种类外源性抗原对 三种组织中淋巴细胞的增殖作用 “抗原对三种组织中淋巴细胞的增殖作用 结论???.一 参考文献??. 鼗 谢. 作者简历”.?.导师简介?...??一 ,掣譬霸 ..?皿,。口 千 恤 .戳赫誊氐 .??蔫港匿 ???, ? 一??一?~』奎塞童查兰竺里型童查型堡圭兰堡丝三 文献综述 .鱼类体液免疫概述 体液免疫是鱼类免疫的一个重要部分,它包括非特异性体液免疫和特异性体液的 免疫?,根据发挥主要作用物质的不同而分:非特异性体液免疫主要是由体液因子参 与作用,包括溶菌酶、补体、天然溶血索、.反应性蛋白、干扰素一等口叫;而特异 性体液免疫的作用主体则是细胞所分泌的抗体分子.因此由细胞介导的免疫应 答称为特异性体液免疫应答口】,其免疫机制为:外源性抗原进入体内后被巨噬细胞的 吞噬将抗原递呈给淋巴细胞,在辅助淋巴细胞如细胞、细胞的作用下产生相对 应的效应淋巴细胞.避一步进行增殖,分化并产生抗体【。】。简而言之,特异 性体 液免疫应答过程为细胞通过对抗原的识别,活化增殖.最后分化成浆细胞并合成 分泌抗体吼 鱼类免疫器官 与哺乳动物免疫研究相比,鱼类的免疫学研究起步较晚,而且研究方法也主要借 用哺乳动物的研究方法”,因此国内外学者对鱼类免疫学做的大量研究工作都以哺乳 动物的研究成果为基础。现己知鱼类的免疫器官与组织主要包括胸腺、头肾、脾脏、 肠道及粘膜相关淋巴组织【。与高等脊柱动物相比,硬骨鱼类的免疫系统不同之处 在于它不具备骨髓或典型的淋巴结【”】,代替的是骨髓样组织。头肾发挥着相同的免疫 功能,可以说鱼类是最早拥有适应性免疫系统的原始脊椎动物【”。 胸腺 在硬骨鱼类中.胸腺位于鳃腔背外侧区域的成对器官。胸腺是个体发育过程中较 早出现的淋巴组织. 在罗非鱼卵受精后内即可观察到胸腺原基形态标 志的出现,位于第三和第四鳃囊。从这个原基发育而来的细胞进一步分化为胸腺细胞 和上皮细胞【“】。鱼类的胸腺被认为是鱼类的中枢免疫器官。鱼类的胸腺由淋巴细胞、 浆母细胞等以及其它游离间充质细胞组成【“。胸腺在鱼类免疫应答中主要负责 淋巴细胞的成熟分化,进而发挥细胞免疫的功能。不同种类鱼的胸腺组织学之间有很 大的不同。如:卢全章【通过对草鱼的研究发现草鱼的胸腺在免疫系统发育成熟的时 期反而会出现胸腺退化的现象,同时胸腺的发育还会受到环境与季节变化的影响 。 肾脏 肾脏是成鱼最重要的淋巴组织.可分为头肾、中肾加印和 后肾【】。鱼类的肾脏一般位于腹部,紧贴脊柱,从头骨底部前肾延罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 伸到近尾韶后肾口”,其中头肾失去肾的透析及排泄功能转而具有造血功能。因此 头肾是硬骨鱼类主要的造血器官口?。而一”肾和后肾同时拥有肾的排泄功能和免疫组 织‘?。此外,鱼类肾脏具有集中和独立的巨噬细胞系统,称之为网状内皮系统四, , 由淋巴细胞、造血细胞、粒细胞及黑色素巨噬细胞中一 与血管紧密相连而组成并在免疫防御中发挥协同作用四。而且在鱼类的头肾中 可咀检测到/、以及转录因子锌指蛋白的大量表达,充分说明头肾是淋 巴细胞发育成熟的场所”】。 此外鱼类的肾脏还是 个极小寻常的,复杂的器官,拥有四个不同结构和功能的 系统,包括造血系统,网状内皮系统,内分泌系统以及排泄系统洲。但目前对于这些 系统之间的相互作用的水平还知之甚少。鱼类的头肾主要由淋巴组织构成,例如鲤 ”“阳的头肾中主要为淋巴细胞聚集的深染淋巴样组织,没有淋巴区、 非淋巴区之分;以及等人.则报道了罗非鱼盯、硬 头鳟,曲抽等硬骨鱼的头肾也均由淋巴组织构成。 .脾脏 有颌鱼类才出现真正的脾脏。脾脏有一个纤维囊和骨小粱延伸到实质,软骨鱼 的脾脏可划分成红髓和白髓。其中红髓占据了整个脾脏的大部分,由众多网状细胞组 成网络来支持充满血液的血窦,血窦中包括有巨噬细胞和淋巴细胞””;白髓往往不发 达,但可分为两个隔室:黑色素巨噬细胞中心累积物和椭圆体:黑色素巨噬细 胞中心 主要是红细胞进行新陈代谢的场所。并且能以免疫复合物的形式长期维持抗原刺激 。由于缺乏树突状细胞,鱼类的免疫记忆的机制也有别于高等脊柱动物;椭圆 体是微动脉的终端部分,具有狭窄的内腔通过一个由网状纤维.网状细胞和巨噬细胞 形成的鞘四。 硬骨鱼类脾脏虽没有明显的红髓和白髓之分.但也是鱼类重要的造血和免疫器 官,同时是鱼类的红细胞、中性粒细胞产生、贮存和成熟的主要场所。硬骨鱼类脾 脏的体液免疫也发挥着较重要的作用,脾脏可对抗原以抗原.抗体复合物的形式贮存, 脾脏被认为是记忆细胞的原始发生中心【”。 .黏膜相关淋巴组织 碗骨鱼类的黏膜相关淋巴组织包括肠道,皮肤和鳃。这些组织拥有一层粘液和一 系列暴露于外部环境的非特异性免疫防御系统,构成了抵御病原体等入侵的首道屏障 ””。硬骨鱼类缺乏哺乳动物肠道淋巴组织中的集合淋巴结,,但肠道 具有大量的白细胞,包括巨噬细胞.淋巴细胞,肥大细胞,粒细胞和浆细胞【”。 鱼类的皮肤和鳃中也存在巨噬细胞及浆细胞,通过巨噬细胞对痛原的处理和 呈递 作用,浆细胞分泌抗体对抗原进行中和作用以及粘液中的溶菌酶和补体等非特异性的 保护物质一起组成抵御病原入侵的有效防线虽然已有研究表明在鱼类的皮肤和肠广东海洋大学全日制学术型硕士学位论文 类 道中存在免疫活性细胞?】.进一步研究发现在大西洋鲑鱼的鳃中大量表达 链 ?】,但对于抗原在皮肤和鳃中的处理过程目前仍不清楚。鱼类粘膜免疫 系统是非特异性的,具有一定的自主性,这在鱼类养殖中的病害防治和疫苗免疫方面 有重要意义。 .鱼类免疫细胞 凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞均称为免疫细胞。鱼类的免疫细胞与 哺乳动物一样也可分为两大类【:一类是淋巴细胞,主要参与特异性免疫反应:另一 类是吞噬细胞、单核细胞、粒细胞等.参与非特异性免疫和特异性免疫。鱼类免疫细 胞主要存在于免疫器官和组织以及血液和淋巴液中。 鱼类的淋巴细胞研究于上世纪年代以来陆续展开,早期等人认为 鱼类是由单一类型的淋巴细胞担负机体的免疫功能,而淋巴细胞的异质性反跌在同一 类淋巴细胞的不同发育阶段;随后等”用抗斑点叉尾鲴衅 免疫球蛋白的抗体从外周血细胞中分离出细胞。能与作用,而。细 产生应答。到本世纪初利用半抗原 胞只有当辅佐细胞存在时才能对或 载体效应技术”】和个体发生学的研究已经证实鱼类的淋巴细胞与哺乳动物一样也 包括细胞和细胞两个亚群。 国内科研人员也对鱼类细胞的异质性进行了大量的研究:如卢全章“通过光镜 和电镜观察到草鱼头肾器官含有大量的免疫细胞,主要包括淋巴细胞、浆细胞、粒细 胞、单核细胞和巨噬细胞。其中介导体液免疫的淋巴细胞就是能表达表面膜免疫 球蛋;的淋巴细胞,而不能表达的则为淋巴细胞。根据这一特性,罗晓春 【‘通过尼龙毛柱分离两种淋巴细胞方法再结合扫描电镜观察发现能吸附在尼龙毛上 %,而这点也与哺乳动物的淋巴细胞 的表面粗糙淋巴细胞约占粘附性细胞的 被尼龙毛吸附的情况类似,其原理就是由于淋巴细胞表面富含膜表面免疫球蛋白 导致膜表面粗糙而易粘跗在尼龙毛上。淋巴细胞特性 .个抗原受体. 细胞是体液免疫应答的核心细胞。一个细胞表面约有 可以和大量的抗原分子相结合而被选择性激活旧。细胞对抗原的识别处理过程视抗 原不同而异:由非细胞依赖性抗原引起的体液免疫不需要抗原呈递细胞和辅助性 细胞的协助,抗原能直接与细胞表面抗原受体特异性相结合,从而引起细胞活 化【”】;而由细胞依赖性抗原引起的体液免疫,抗原必须经过抗原呈递细胞的捕捉, 吞噬,处理,然后把含有抗原决定簇的片段呈送到抗原呈递细胞表面只有辅助性 细胞识别带有抗原决定簇的抗原呈递细胞后,细胞才能与抗原结合被激活畔】。细 胞被激活后,细胞代谢旺盛,体积增大,处于淋巴母细胞化,然后增殖分化为浆母细罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 胞,浆细胞分化成熟后能合成并分泌免疫球蛋白。在正常情况下,抗体产生后很快排 出细胞外,进入血液循环,并在全身发挥免疫效应【”。浆细胞类群 高等脊椎动物淋巴细胞存在多种细胞类群。活化后的细胞分化为分泌抗 ,。细胞亚群包括: 体的浆细胞,称为抗体分泌细胞 及长寿命浆细胞 浆母细胞、短寿命浆细胞 三种”。”】。 尽管之前的观点认为硬骨鱼类的抗体分泌型细胞只有一种统一的浆细胞群”。 随后的许多研究发现一些包括硬骨鱼类在内的低等脊柱动物也存在多种类群, 包括浆母细胞、短寿命浆细胞及长寿命浆细胞】。其中浆母细胞又称原浆细胞,为 未成熟的浆细胞前体,体积较大,可进一步分化增贿而成浆细胞,是可复制的淋 巴细胞:而分化成熟的浆细胞是末端分化细胞,不可复制,按照在有机体内存活时间 的长短分为短寿命浆细胞及长寿命浆细胞。短寿命浆细胞足特异性免疫应答阶段 的主体,大量浆细胞通过分泌抗体进入血液循环达到中和及清除抗原的目的.随之进 入细胞凋亡的程序;而有一部分浆细胞在经历细胞捅亡程序后能在机体内存留数月 之久,并最初抗原的刺激下持续不断地分泌抗体,与短寿命的浆细胞不同,称为长寿 命浆细胞,能长期的存活并分泌抗体,发挥机体氏期免疫作用。因此,免疫记忆 的定义也可以用另一种表达形式,即初次免疫刺激产生的浆细胞所发挥的长期维持作 用【“】。 鱼类的头肾能为淋巴细胞成熟分化提供良好的场所。因此同高等脊椎动物一 样,鱼类淋巴细胞也存在很多种细胞类群。关于鱼类类型的研究逐渐成为 新的热点,这对阐述鱼类的免疫机理以及水产疫苗的研究具有重要意义。 .鱼类抗体的研究 抗体主要以分泌形式存在于血液和其它体液中介导体液免疫,也可以结合于 淋巴细胞膜上作为表面受体。根据免疫球蛋白上重链连化学结构的不同,可将 分成多种类型,鱼类的与高等脊椎动物的在类型上有较大的差异,高等脊椎 动物的是五聚体,而硬骨鱼高分子量却为四聚体婶】。由两条重链和两条轻 链组成的单体在血清中通过?’键组合成一个四聚体呻。软骨鱼有和两种 抗体,而真骨鱼则可能只有一种抗体【叫,但存在多种异构型,【”曾发现鲒 鱼的轻链分子量为外,还存在着分子量为和以及个异构型。 由于鱼类的细胞分化过程中并没有涉及到类型转换.因此基本不存在高等脊椎动 物在免疫应答过程中出现的由转变为低分子量的现象【”。最近一些研究有 在斑马鱼、鲑鱼以及鲶鱼体内分别鉴定到、、和删。广东海洋大学全闩制学术型硕士学位论文 此外.鱼类不仅存在于血清中,在鱼类的皮肤和肠粘液、胆汁和卵均发现 免疫球蛋白的存在.分别以四聚体和二聚体两种形式存在”。鱼类粘膜免疫系 统抗体 与血清抗体是否存在同源性尚有争议。由于鱼的种类很复杂.不同种鱼的免疫应答又 具有特异性,因此研究的方法和技术还有待进一步完善。 .鱼类体液免疫记忆 现有研究已先后证明鲤鱼、鲫鱼及鲑鱼等也具有类似哺乳动物的免疫记忆反应 将鱼类记忆应答定义为一次在形式与 。在研究鱼类的免疫记忆时, 功能上都与初次免疫应答有所币同的免疫反应。这使得哺乳动物与硬骨鱼类的记忆 细胞系统在基于它们的系统功能的有效性上进行比较。在这样抽象的定义之下,鱼类 当然也拥有相同抗原再次刺激而产生的记忆应答,只是免疫记忆机制可能有别于哺乳 动物,具有鱼类本身的特点。 有相当多的证据证明鱼类具备产生免疫记忆的条件:有学者认为鱼类的黑色素巨 噬细胞中心类似于哺乳动物的生发中心【鲫。这个推测通过对三种硬骨鱼类的肾脏和脾 脏分离出的游离的黑色素巨噬细胞中心及黑色素巨噬细胞用一进行标记而证 实?。此外,田敬云等旧通过整体连续切片,研究了鳜鱼不同发育时期的头肾结构. 发现黑色素巨噬细胞散布于头肾中,大都集中于头肾静脉及门静脉边缘区形成黑色 素巨噬细胞中心。李珠等采用免疫组化方法分析红笛鲷成鱼的胸腺、头肾和 脾脏中细胞,观察到脾脏中细胞较多聚集干动脉、黑色素巨噬细胞中心 外周,头肾内细胞在黑色素巨噬细胞中心外周、静脉、血窦外周呈密集分布。 这一结果也提示,细胞及血管在免疫防御中协同作用口”,表明鱼类存在细 胞发生记忆性选择的微环境。 ““在对虹鳟鱼用细胞依赖性抗原进行初次和二次免疫后发现第二次 免疫反应比第一次更快,反应更强烈,但二次免疫后其免疫细胞克隆增殖的数量变化 并无显著差异。因此认为鱼类的免疫记忆只是抗原敏感性细胞池的扩张。一些研究也 认为抗体没有发生性质上的变化.因而不同于哺乳动物淋巴细胞是与功能相联系 的记忆表达拍。等在对虹鳟鱼进行体外及体内的抗体反应的研究分析后证 实鱼类也存在免痘记忆,并把鱼类的免疫记忆定义为一次在形式与功能上都与初次免 疫应答有所不同的免疫反应:。这些证据说明鱼类的免疫记忆与哺乳动物的免疫记忆 机制不同,即哺乳动物淋巴细胞是与功能相关联的记忆表达,而鱼类的可能 只是 简单的抗原灶扩散。另外一点较为重要的是鱼类一直生活于水环境中,属于变温动物, 水温也会对鱼类免疫应答产生很大的影响,因此鱼类的免疫记忆还会受到水温的影 响。如发现鳗鲡在?的水温中检测不到对鳗弧苗的凝集抗体,而在? 时则检测得到。随后许多不同的试验都证明低温会限制浆细胞释放抗体””。罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 鱼类免疫研究方法及进展 检测抗体效价 年和首次报道建立酶联免疫吸附试验‘? ,,基本原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相 载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分 洗除。常用的法有双抗体央心法和问接法,前者用于检测大分子抗原,后者 用于测定特异抗体。主要分类:测定抗体的接法检测抗原的双抗体 央心法测定抗原的竞争法。由于具有快速、敏感、简便、易于标准化等优 点使其得到迅速的发展,随着方法的不断改进、材料的不断更新,大大提高了 的特异性,使更为简便实用和标准化,目前已经广泛应用于临床医学、生物 学、分析化学等领域。其在水产领域中的应用,如在水产品安全检测中的应用以及在 鱼病诊断中的发展等近年来也逐步得到推广【则。 .淋巴细胞的分离技术 在其专著《鱼类免疫学》中介绍了三种分离鱼类淋巴细胞的方法:直接 从血液中离心分离法、用?梯度离心分离法和用梯度离心分离法 “。目前主要采用细胞分离液进行密度梯度离心对鱼类进行淋巴细胞分离。分离液主 ,商品名,也称基淋 要有两种:一种是聚蔗糖溶液 ,可直接用于哺乳动物淋巴细胞的分离【”,而分离鱼类 巴细胞分离液,比重为 等低级脊柱动物的淋巴细胞时,要在基础淋巴细胞分离液中加入一定比例的泛影葡胺 出 ,商品名,也称.配成不同的比重才能分离鱼 类的淋巴细胞。比较常用是混合聚蔗糖一泛影葡胺..分层液,该方法 是先通过体积称量法算出%泛影葡胺的密度,然后将将标准人淋巴细胞分离液密 度为 /和泛影葡胺按照不同体积比混合在一起,配制成密度分别为 . /的淋巴细胞分离液,随后加入血液进行离心,比较各个密度分离液 的得率和存活率,得出晟佳分离条件。该方法需要进行密度的调配.步骤较繁琐, 且容易增加污染的概率,但所分离的淋巴细胞的纯度、得率和活力都比较高, 是目前 鱼类淋巴细胞分离普遍采用的分离方法。 由于鱼的种类不同.配制?分离液的密度也要随之进行适当调整。 时可 陈全震唧等人在基础分离液中加人,将比重调整为.? 的 将草鱼外周血中的淋巴细瓶完全地分离出来;而秦玉丽’等人采用比重为 %一 %的淋巴细胞分离出来,且细胞的存 ? 可将鲫鱼外周血中 活率为%:丰培金”肄人同样用比重为 的分离液可将鲤鱼外周血中淋巴细胞 有效的分离出来.但存活率较低;刘岑杰等人分离同本七鳃鳗时采用分离液的比重东海洋大学金门制学术型硕士学位论文 为.,分离到的淋巴细胞能搬好被流式细胞仪进一步分选为淋巴细胞、淋巴 细胞。也有只用基础淋巴细胞分离液分离鱼类淋巴细胞的.但报道不多。如罗晓春”” 等人用基础淋巴细胞分离液直接分离草鱼外周血液中淋巴细胞,效果 较好。浚方法简便快捷,可以省略配制不同密度分离液的麻烦从而减少操作步骤.只 需改变离心力及离心时间即可适用于不同种类的鱼淋巴细胞分离,能避免源头上使细 胞受到污染,而且保证目的细胞的分离纯度以及存活率。 检测免疫细胞 对抗体分泌细胞进行检测常用的方法有溶血空斑形成试验、酶联免疫斑 点法、流式细胞仪检测等。其中酶联免疫斑点法是一种在细胞悬 液中定量检测细胞因子生成细胞的分析方法”.它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸 附技术.其最大优点是高精确度.能在万个细胞中检测出个阳性细胞灵 敏度比普通技术、流式细胞技术和技术至少高了?个数量级州。 因此,常用来检测细胞分泌因子或者淋巴细胞的前体细胞分化频率。检测 法与双抗体央心法类似,但结果却与完全不同:是通过测量每 个孔的显色液的光密度来得到真实的细胞因子的浓度,而是通过对形成斑 点进行计数而得到释放细胞因子的细胞个数,因此,最大可能降低底板背景的非特异 性显色是至关重要的,否则会导致计数结果不准确。 的原理是抗待测细胞因子的特异性捕获抗体预先包被在微孔板 的膜上。将细胞及其刺激剂加到孔中,微孔板放在孵箱内孵育一段时问,使捕 获抗体与活化细胞分泌的待测因子结舍;洗掉未结合的细胞后,酶标记的特异性检测 抗体加到孔中;洗掉未结合的检测抗体,加入底物溶液,显色沉淀即在细胞因子出现 的位置形成斑点。如果斑点颜色不深或不清晰,也可加入生物素化的特异性检测抗体, 然后加入酶标链亲和素,再加入显色液使结果放大,利于斑点计数。每个斑点代表单 个分泌待测细胞园子的细胞。斑点多少可以在阅读仪上进行自动化计数或 在显微镜下进行人工计数。 可以模拟体内环境,跟踪细胞因子的产生,是检测细胞功能的独特手 段,其现已被广泛运用于疾病诊断和科学研究活动之中【吲。技术应用领域有:移植 中排斥反应的预测、疫苗发展、/分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性 疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选 等等。近年来在水产养殖领域的应用也逐渐展开。. 在医学领域的应用 用于感染性疾病的诊断:由于方法的敏感性和特异性使其在 检测一些病原方面具有独特的优势,通过检测能准确区分某种疾病的感染 人群和疑似感染人群.很大程度上降低假阳性率。如等【”】研究证实,在筛罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 查结核感染的方法中,法比结核菌素试验试验更敏感、特异和方 便。 用于疫苗研究:机体受到病原微生物感染或是经免疫后,体内会产生 一系列的免疫应答,而研究免疫应苔的规律是对疫苗效价评估的关键【洲。 技术是一种很好的评价疫苗免疫原性和免疫应答机理的方法,能客观地反映出抗原的 免疫原性.而且比其他测定方法相对要快速和简便。 等四 研究高致病力禽流感疫苗在小鼠中的免疫应答隋况,应用检测到在 小鼠脾脏和骨髓中分泌抗体细胞的类型和亚类,发现在用疫苗初免主要是 为主,而二免后则主要、 、为主,亚类主要是。 用于器官移植巾排斥反应的预测和用药:目前在器官移植上首要解决 的难题是降低排斥反应.使机体免疫抑制达到最小化和产生免疫耐受【嗨。因此,需 要可靠的器官离体分析技术以检测器官受体的细胞同种异体免疫反应。对于器官移植 者.用监视患者体内的免疫排斥反应,可以有针对地用药。避免盲目地使 用免疫抑制剂。这对于增加移植手术的成功率、延长移植器官的存活率,提高病人的 生活质量有重大意义【仰。 在鱼类免疫的应用 技术用于鱼类免疫的研究近年来较多,主要用于特异性抗体分泌细胞 的定量分析,进而了解鱼类免疫反应动力学及免疫应答机制。如”” 等人分别给近亲杂交的鲤鱼和远亲杂交的鲤鱼用同种抗原免疫.通过检测 两种鱼的特异性抗体分泌细胞,发现远亲杂交的后代产生的的数量是近亲杂交 的两倍。这说明近亲杂交的后代对抗原刺激的反应已经大大减弱。 等人用 分析经口服及腹腔注射免疫比目鱼后的头肾,血液以及腮中的抗体分泌细 胞的数量,发现头肾无论是腹腔注射还是口服免疫反应都是最强烈的;腹腔注射免疫 后,血清抗体效价与头肾的数量密切相关:而口服免疫后血清抗体效价与血液 中的数量密切相关。?”等人用寄生虫感染鲶鱼的皮肤和腮部.在 检测皮肤及腮的抗体分泌细胞,发现免疫后皮肤的数量增加倍,而且再次 感染后周数量持续增加,抗体能维持长期的体液免疫,说明鱼类皮肤含有细胞 跟浆细胞,构成鱼类免疫系统的完整性。 .研究目的及意义 近些年来,鱼类免疫记忆的研究得到了科研人员的广泛重视,目前主要通过体内 和体外捡测鱼类的免疫应答。在一些模式生物鱼类如虹鳟、大 西洋鲑、斑点叉尾鲴、斑马鱼中进行的免疫试验也说明鱼类存在免疫记忆。但可能与 哺乳动物免疫记忆机制相比存在差异,如免疫器官上的不完善.免疫细胞的克隆增殖广东海洋大学全阿制学术型硕士学位论文 倍数,血清抗体水平的增加以及免疫期氏短等。鱼类免疫记忆有其自身的特点,对于 鱼类免疫记忆应答的研究在鱼病的防治、疫苗的研发以及鱼类免疫学上具有重要意 义。由于鱼类生存环境的特殊性、复杂性以及各种鱼类的免疫特异性等因素,给鱼类 免疫机制的研究带来难度。目前鱼类免疫记忆机制尚不能形成系统性的理论,还有待 进一步的完善。 本研究以我国南方重要养殖鱼类之一的罗非鱼作为实验对象,应用技 术分析特异性抗原首次及二次免疫后罗非鱼头肾、脾脏及外周血中的数量变化 规律以及检测抗体水平的变化.进而分析罗非鱼体液免疫记忆;通过体外培养受免后 的罗非鱼头肾,脾脏及外周血淋巴细胞,加入特异性及非特异性抗原刺激后检测细胞 的增殖转化,为罗非鱼淋巴细胞体外刺激后增殖转化实验的基础数据和探讨鱼类的免 疫记忆提供重要的科学依据。罗非鱼免疫忆及体外淋巴细胞增贿的研究 罗非鱼淋巴细胞分离 引言 淋巴细胞在抗原刺激作刚后能被诱导产生相应的抗体和各种免疫因子,从而发 挥细胞免疫作和体液免疫功能【?‘”。因此,鱼类淋巴细胞的研究是鱼类免疫学的 重要内容之一。针对淋巴细胞进行研究首要解决的问题是对其进行分离纯化,必须先 从外周血或者淋巴组织器官中分离提取到数量较多、纯度和存活率较高的淋巴细胞, 爿能进一步对淋巴细胞进行形态特征等方面的研究。因此,分离技术对淋巴细胞的研 究而占是至关重要的【“”。由于鱼类是低等脊椎动物,不同物种之间的血细胞组成差 异较大,导致鱼类淋巴细胞分离方法没有统一的标准。一些鱼类淋巴细胞分离方法也 只适用于所研究过的鱼.用于别的鱼则不能达到最佳的分离效果【”。关于用分离液 分离罗非鱼淋巴细胞的报道不多,如李超?增人分离罗非鱼所用的分离液为标准人 淋巴细胞分离液中加入%泛影葡胺调整比重为.,可以分离到%的淋巴细胞, 并且染色后可明显区分其中的单核细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞和嗜中性粒细胞。 而用基础淋巴细胞分离液分离罗非鱼淋巴细胞则未见报道。 本实验利用作为罗非鱼淋巴细胞分离液,并探索了离心力、离心 时间、环境温度及血液黏稠度等影响淋巴细胞分离的因素,建立了较为可靠方便的罗 非鱼淋巴细胞分离技术, 并进行了显微观察鉴定,对罗非鱼细胞免疫的机制和功能 的研究具有实际应用意义。 实验材料 主要仪器设备 超净工作台:上海汇龙仪表责任有限公司: 超纯水器:英国公司; 型正立荧光显微镜:德国公司; 数码显微镜拍照系统:德国公司; 台式高速玲冻离心机:德公司。主要试剂 淋巴细胞分离液:公司; 液:公司: 培养基:公司; %:公司。 主要溶液配制 ?生理盐水:将 溶于蒸馏水中,分装于血清瓶中,蒸汽高 广东海洋大学全同制学术型硕士学位论文 压灭菌锅在】】。下灭菌,保存于?冰箱中。 ?肝素钠溶液:用生理盐水将肝素稀释成配成咖肝素生理赫水溶液, 高压灭菌,保存于?冰箱中。 ? /台盼蓝:称取台盼蓝粉末充分研磨,加入蒸馏永溶解于棕色玻璃 瓶中室温避光保存。插用前将台盼蓝水溶液与 %的等量混台,离心取上清液 供 细胞染色用,与细胞悬液:混合,内检测。 ?青链双抗:青霉素链霉素溶解于灭菌水中,过滤除葫分装 于 离心管中,一?保存。 国.不完全培养基:烧杯中加八约灭菌水,在室温至 ?的水中加入干粉培养基,水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器 内轻轻 搅拌充分溶解,自 ,加入青链双抗溶液,定容至 %调节最终值为 ,过滤除菌.分装于血清瓶中密封保存于冰箱中。 .实验鱼 体重为左右的罗非鱼,喂养于室内养殖池,每天早晚投喂次人工合成饲 料,水温控制在?左右,每换水次,采样前停止喂食。 实验方法 尾静脉采血 用体积分数为%的酒精消毒罗非鱼尾部,用%肝素润湿注射器从罗非鱼尾静 脉采血后加入?’液稀释,使血液与稀释液之比分别为:、:、:、:。 . 淋巴细胞分离 ?将外周血细胞悬液缓慢叠加于淋巴细胞分离液一上,血液与分离 液体积之比为:; ?分别于/、/、/、/的离心力下离一:; ?将中间淋巴细胞层移至离心管.加.不完全培养基洗涤./ 离心: ?去上清,加入培养基重复洗涤离心次后加入培养基重悬,取.细胞悬液 加入预备好的培养基中稀释倍计数: ?稀释后的细胞悬液以:的比例加入台盼蓝染色液,混合均匀后在内进行 细胞计数。细胞计数 ?用血细胞计数器进行细胞计数。用水稍微沾湿计数室两侧的支持柱; 以推压法将洁净盖片平放在计数室表面,用移液枪吸取稀释后的细胞悬液,沿 盖片与计数室之间的缝隙充入计数室.避免产生气泡;罗非鱼免疫记忆及体外琳巴细胞增殖的研究 在光线稍暗的视野中高倍镜下计数四角及中央个中方格的红细胞数以及四角 个大方格的白细胞数; ?大小方格内压线细胞按“数上不数下,数左不数右”的原则进行计数。同时用 %台盼蓝检测细胞存活率。 淋巴细胞计数公式:淋巴细胞数/:兰竺苎塑塑宣掌里塑旦垫里。?。稀释倍数 淋巴细胞纯度计算公式:细胞纯度;;::警×。。% 存活率计算公式:存活率:;;;::警×?。。% . 数据整理 所有数据均以平均值?标准差表示。 .结果与分析 . 罗非鱼外周血淋巴细胞分离结果 表 种外周血藏稀释比例在不同离心力分离到淋巴细胞个敦, 离心力幢 稀释比】 从表中可以得知在相同稀释度下,每全血分离得到的淋巴细胞细胞数量与所 采用的分离离心力的大小有关。在离心力下淋巴细胞的得率最低,随着离心力的 增加,淋巴细胞的得率也逐渐增加,离心力增加为时,淋巴细胞得率最大,随着 离心力进一步增加到时,淋巴细胞得率反而有所下降。种血液稀释度分别在不 同的离心力作用下每所得到的淋巴细胞数量都基本符合这个规律。同时,血液的 稀释倍数只影响单位体积所分离的血液中白细胞的数量。当全血稀释倍数为:时, 细胞的得率是比较理想的,尽管与全血稀释倍数为 相比,血液中的总细胞数减少 倍,但分离到的淋巴细胞数却比稀释倍数为:时得到的细胞数的一半还要多。而当 稀释倍数为:、:时,淋巴细胞得率分别低于稀释倍数为:时淋巴细胞得率的三分 之一,四分之一。。 数为:、:、 的淋巴细胞纯度之间不存在显著性差异 靶 种外周血灌稀释比倒在不同离心力下细胞存括率% ” 稀释??百广?矿坠地杀??一 另一个重要的指标是分离得到的细胞的存活率,这从表中可以得知,离心力也 是影响细胞存活率的关键因素之一,淋巴细胞存活率随着离心力的增大也逐渐增大, 时,淋巴细胞存活率达到最大.再增大离心力达到时,淋巴细胞存活率反 而下降,因此可以在不同稀释倍数下采用离心力为分离到较高存活率的细胞。当 离心力一定时,稀释倍数越大,细胞的存活率越高,与离心力时.不同稀 释度的细胞存活率差异不显著 ; ,但与、相比差异显著 , 以稀释倍数来看。稀释倍数为:、:、:之『日的细胞存活率无显著差异 。 但者与:稀释度的细胞存插率相比均有显著性差异罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 . 分离细胞的形态观察 圜?同一外周血液稀释比:下不同离心力分离细胞效果.注:箭头所指处为红细胞。 离心力; 离心力::离心力;:离心力 .: : ;: 髓; ”; 从上图中可以看出在离心力条件下,分离得到的白细胞中含有较多的红细 胞.箭头所指处为红细胞并且在视野中所看到的细胞总数较少:而在离心 力条件,红细胞所占的比例有所下降,在离心力条件下,视野中基本看不到红 细胞,细胞边缘较为光滑完整,在离心力条件下也无红细胞存在,但有一些细 胞边缘模糊不清,存在较多细胞碎片。 讨论 本实验通过基础淋巴细胞分离液对罗非鱼外周血淋巴细胞进行分离,探讨影响淋 巴细胞分离的两个重要因素一离心力及血液稀释度,选择重复性较高的分离效果较好 的分离方法。稀释倍数对外周血淋巴细胞分离的影响 通过对全血进行稀释以降低血液粘稠度,可以使各个细胞成分进行很好的分离, 达到细胞分层的目的?”。因此,在分离前大多都对全血进行稀释处理。稀释的倍数 一般采用平衡盐溶液进行倍以稀释,可以很大程度上减少红细胞的干扰【?】。通过广东海洋大学全只制学术型硕士学位文 试验发现血液的稀释倍数对白细胞的纯度咀及存活率影响较大,血液的稀释倍数越 大,越有利于提高分离到的淋巴细胞的纯度以及存活率,并且通过镜检发现 分离到的 细胞中,红细胞占的比例与细胞的死亡率呈比。因此,理论上增大血液的稀释倍数 有助于淋巴细胞的分离,但会使每次分离到的淋巴细胞数较少,因此需要增加分离次 数才能得到足够的细胞用于实验。离心力对外周血淋巴细胞分离的影响 在大多数鱼类细胞分离的实验中会根据鱼的种类的不同而采用不同的分离液 比重,实验步骤比较繁琐,且增加污染的概率,分离淋巴细胞方法的优劣要看分离细 胞的纯度、得率和存活率以及操作技术是否简单易行【删。本实验直接采用的基础淋 巴细胞分离液,通过调整离心力大小即可分离到符合实验要求的淋巴细胞。采用的基 础淋巴细胞分离液分离细胞时,离心力是影响分离效果的重要因素之一在不同的血 液稀释度下仅需要调整离心力的大小,在最适合的离心力条件下,血液中各种细胞因 沉降系数不同可以顺利分层为上层为血浆层,中间层为白细胞层,下层为分离液,底 层为红细胞,而且不会影响细胞的存活率。通过细胞显微观察也可证实所分离得到的 白细胞层包括了血液中绝大部分的白细胞。 综上所述,利用基础淋巴细胞分离液对罗非鱼外周血进行细胞分离,通过调 整度 离心力的大小,获得最佳分离的条件是血液稀释比为:。离心力为.离, 可以在常温的条件下分离出较高纯度和存活率.可供进行下一步实验所需的 淋巴细 胞。 罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究 ,,?,??,?‘,,??,??一 试验最优条件的确定 .实验材料 .仪器设备 .孔扳:公司: 多功能分子杂交炉:美幽公司: 水浴恒温振荡器:上海博迅实业有限公司: .超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司; ?电热恒温培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂; 超净工作台:上海汇龙仪表责任有限公司; 台式高速冷冻离心机:德国公司; 体式显微镜:德国公司; 一自动双重双蒸水蒸馏水器:上海亚荣生化仪器厂; 孔聚苯乙烯酶标板;公司: 紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂; 超纯水器:英国公司: 型电子天平:上海精密科学仪器有限公司; 型精密口计:上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂。 主要试剂 人标准:公司; 鼠抗罗非鱼:英国订大学惠赠; 一羊抗鼠:武汉博士德生物工程有限公司; 弗氏完全佐剂:’?,公司: 弗氏不完全佐剂:,公: 胎牛血清:杭州四季青生物制品公司; 谷氢酰胺:广州威佳科技有限公司: 一巯基乙醇:广州威佳科技有限公司: 显色底物:广州威佳科技有限公司: 显色底物:广州威佳科技有限公司; 二甲基甲酰胺:广州威佳科技有限公司。 溶液配制 细胞培养基 ?谷氨酰胺溶液:称取谷氨酰胺 ,溶于双蒸水.加至,充分搅拌溶 解.过滤除菌,分装到离心管中,保存。 广东海洋大学全日制学术型硕士学位论文 一巯基乙醇: 一巯基乙醇取蒸水中混匀过滤除菌,密封 。 保存,用时培养基加 完全培养基:于的一不完全培养基中加入%灭活 胎牛血清,配制的谷氨酰胺溶液以及 一巯基乙醇, 相关溶液配制 ?显色底物: 粉末溶于:甲基甲酰胺中,避光保存于冰箱 %过氧化氢溶液。 中,临用时取.溶于醋酸盐缓冲液中, 溶于 双燕水 ,. ?: ,. ,. ,定容至,高压灭菌,保 中,搅拌均匀,用磷酸或氢氧化钠调为 存。 洗涤液. %:溶液中加入吐温.定容至,高压 灭菌,密封保存。 溶于双燕水中, ?碳酸氢钠缓冲液: 与 调值为 ,定容至.密封?保存。 ,过滤 醋酸盐缓冲液:.醋酸钠溶于嘶双蒸水中用醋酸调值为 除菌,保存。 的比例混合,过滤除菌,室温 %过氧化氢溶液:%过氧化氯与双蒸水以 保存。 相关溶液配制 加入蛋白一人配制成不同的浓度 ?包被液:用碳酸氢钠缓冲液 %吐温.%胎牛血清 封闭液: ?洗涤液: %吐温一.值调至 ?稀释液:.%吐温,值调至. 浓硫酸加入水中,搅拌散热,定容 攮止液:, 至于室温保存。 实验鱼 的水池中,实验前驯养周,每 体重为左右的罗非鱼,喂养于室内 天早晚投喂次人工合成饲料,水温控制在左右.每换水次。 免疫 取尾罗非鱼作为实验组鱼,用/的.加等量弗氏完全佐剂乳化后每尾 鱼腹腔注射 ,注射等量无菌溶液作为对照组,免疫周后取样。罗非鱼免疫忆 及体外淋巴细胞增殖的研究 实验方法鼠抗罗非鱼与一羊抗鼠最佳结合比例 棋盘滴定法确定鼠抗罗非鱼与山羊抗鼠?:睦佳工作浓度。 ?以包被液:,:,:,:,:稀释的鼠抗罗非鱼单抗包被 孔酶标板,;/于,?过夜; ?甩干后用洗涤液洗次,每次,每孔加满封闭液封闭,孵育: ?洗次。将羊抗鼠?用作:,:,:,;系列 稀释,以?,孔加入各孔,?孵育; ?沈次,每孔加“显色液,室温避光反应, ?加入皿终【液,酶标仪测定备的值。同时设阴性对照 组,以性圳值约为,且阴性?加值较小,稀释倍数最大的稀释度为最适稀 释倍数。外周血淋巴细胞的分离 ?用%盯素润湿注射器,从罗非鱼尾静脉采血后加入倍.’液稀释; ?将外周血细胞悬液缓慢叠加于等量的淋巴细胞分离渡., /离一 ?将中间淋巴细胞层移至离一管,? 一完全培养基洗涤, 离,: ?去上清后.完全培养基重复洗涤离心次,去上清加入完全培养基重悬; 用 %台盼蓝检测存活率%后,将细胞个数调整为×/。细胞计数 见 细胞计数 . 包被浓度的确定 ?室温下每孔加止%的酒精孵育? 孔板后弃 去,无菌洗涤次, 孔板,每 ?分别用、、、/的人包被? 孔此.包被过夜:弃去后. %洗涤次,洗次: ?加入%胎牛血清的培养液封闭 ,弃去后每孔加入细胞悬液,孵 育.后倒去液体,.洗涤次,洗涤次; ?每孔加入此鼠抗罗非鱼单抗.过夜,洗涤次,洗涤 次; 每孔加入止羊抗鼠 孵育,弃去液体,.洗次, 洗次;广东海洋大学全几制学术型硕士学位论文 ?在吸水纸上拍打,吸干残留的洗涤液后缚孔加入皿显色底物,室温 避光反应?; ?弃去显色液,用蒸馏永充分洗涤膜的两边。殁水纸上轻拍,使膜干燥。室温 干 燥后在体式显微镜下进行斑点计数。细胞孵育时间的确定 %的酒精孵育一/ 板】后弃 ?室温下每孔加】叩 去,无菌洗涤次, 用./的人包披 孔板.每孔此,包被 过夜;弃去后.%洗涤次,洗次; 加入%胎牛血清的培养液封闭 ,弃去后每孔加入“细胞悬液, 分 别孵育、、、后倒去液体,洗涤次,洗涤次: ?每孔加入止鼠抗罗非鱼单抗,过夜,洗涤次,洗涤 次; 每孔加入止一羊抗鼠,孵育,弃去液体,洗次 洗次; ◎在吸水纸上拍打,吸千残留的洗涤液后每孔加入乩显色底物.室温下 避光反应? ?弃去显色液,用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍,使膜干燥。室温 干 燥后在体式显微镜下进行斑点计数。数据整理 采用.分析软件对样本进行单因素方差分析?。罗非臼免疫忆及体外淋巴细胞 增殖的研究 结果与分析鼠抗罗非鱼与羊抗鼠?最佳工作浓度 表?鼠抗罗非鱼与羊抗一最佳工作浓度? , 取?值接近于 ,相应的阴性对照嘣值较低的堆大稀释度为最佳工作 浓度由表?中可以看出,当阴性对照删姗值最低 ,鼠抗罗非鱼单抗 稀释度为:”,羊抗鼠?稀释度:时,其数值符合试验要求,作为奉试验 最佳工作浓度。包被抗原浓度的确定 抗原浓度 / 图 种包被抗原浓度对斑点形成的影响 如四 图所展示的是种包被抗原浓度下,经所形成的斑点.每个柱形到案代 表尾鱼,共尾鱼,每一组浓度设组平行,最终结果以平均值?标准差表示。经 过分广东海洋大学全阿制学术型硕士学位论文 析得知:包被抗原浓度为/与其他种浓度相比较均有显著性差异; 其中包被抗原浓度为/与?咖两组之间具有极显著性差异。包被 抗原浓度为“,和咖这两组与包被抗原浓度为?,相比均有显著性差异 , ;包被抗原浓度为‖和‖这两组相比差异不显著 从而得知选择包被抗原浓度为“咖时,得到的数量最多,结果最为理想。 细胞孵育时间的确定 们 《 时间 圈.