微生物接种

微生物接种 一、实验目的 1、初步掌握微生物的分离、培养和菌种的基本方法。 2、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各种方法分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 三、仪器设备 样品:新鲜土壤。 培养基:灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 无菌水:带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。 其它:无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。 四、相关知识点 接种方法:常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具:常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。 五、实验步骤 (一)实验程序1 制备土壤稀释液:(无菌操作过程见教师示范) 1、称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10,1的土壤悬液。 2、 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10,2、10,3、10,4、10,5、10,6。取已稀释成10,1的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10,2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10,2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10,4、10,5 、10,6土壤稀释液。 吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10,4、10,5、 10,6土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 1 计算出每克土壤中细菌的数量。 即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。 挑取单个菌落，进行划线分离。 (二)实验程序2 制平板 吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10,4、10,5 、 10,6土壤稀释液0.1mL，加在空培养皿中。 混菌 水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。 计算出每克土壤中放线菌的数量。 挑取单个菌落，进行划线分离。 (三)实验程序3 制成平板。 凝固后，用接种环取相应的菌液一环(10,1)在平板上划线。 1、连续划线法:将挑取有样品的接种环在平板培养基 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面作连续划线。完毕后，倒置于28,300C温室培养。 2、分区划线法:用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。 六、实验报告要求 1、根据实验要求，在实验时间内到实验室进行实验时，一边测量，一边记录实验数据。报告要求准确、美观。 2、 在实验中，如果发生实验测量数据与事先的计算数值不符，甚至相差过大，此时应该找出原因，不能不了了之。同时要把通过实验所测量的数据与计算值加以比较，如果误差一般5,以下。 3、在报告的最后要完成指导书上要求解答的思考 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 七、思考题 1、平板培养时为什么要把培养皿倒置, 2、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉, 2 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。 2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。 3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 1. 简单染色法: 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为:在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用+-G表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏染色阴性细菌，用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫,碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫,碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95,的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜+-色，从而将细胞区分成G和G两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12,20h斜面培养物;革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14,16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹;滴蒸馏水和取菌不宜过多;涂片要均匀，不宜过厚。 3 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰2,3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4. 染色 (1)简单染色法: ? 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1,2min;石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。 ? 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 ? 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ? 镜检 涂片干燥后镜检。 (2)革兰氏染色法: ? 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1,2min，水洗。 ? 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95,酒精滴洗至流出? 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20,30s，立即用水冲净酒精。 ? 复染 用番红液染1,2min，水洗。 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫? 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法: 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 4 5