植物逆境生理 第四章 植物与病原菌之间的生理生态关系

植物逆境生理 第四章 植物与病原菌之间的生理生态关系 第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系 第一节 致病毒素和植物抗毒 素 第二节 病原菌侵染植物的过 程及对寄主植物的影响 第三节 植物与病原菌互作 和 抗病性的分子机制 第四章植物与病原菌之间的 生理生态关系 ? 植物除受食草动物(包括昆虫)的取食危害外， 还经常遭到真菌和细菌等病原菌的侵染而罹病。真 菌是侵染植物的主要类群。真菌门属低等的真核植 物，有10万余种，它们都无叶绿素，营寄生或腐生 活。营寄生的多数真菌寄生在植物体上。根据真菌 的形态、生殖和孢子等情况，把它们分为4个纲:藻 菌纲(Phycumycetae)、子囊菌纲(Ascommycetae)、 担子菌纲(Basidiomycetae)和半知菌纲 (Deuteromycetae)。 在漫长的进化过程中，植物发展了各种各样 的抗病机制，筑起了一道又一道防线，部分有效 地抵御了病原菌的侵染;而病原菌在同植物的斗 争中，也发展了各种方式来攻破植物的防御使侵 染成功，得以在植物体上定居下来并繁衍后代。 植物和病原菌之间的相互关系是动态的，处于不 断的进化之中。在这种侵染和防御的对抗中，化 学手段是最重要的，同时环境因素也是很重要的。 德国植物病理学家Wheeler曾用了一句形象的话， 概括地说明了这个复杂关系。他说“可以把植物 的发病过程，看成是植物和病原菌之间进行的一 场战斗，环境是这场战斗的仲裁者。”的确，有 时侵染的成功与否，在某种意义上取决于当时的 环境条件，主要是温度和湿度。 植物对病害的抵抗力是相当强的，它们受伤 后，伤口会很快愈合;侵入的微生物也会被杀死。 而且整株植物外面被角质层保护着，顶盔穿甲， 绝大多数病菌都不能透过这种角质层。许多植物 还会产生抑制微生物生长的物质，如亚麻根分泌 物中含有氰化物，燕毒叶中含有毒的糖苷。同时， 当细菌侵入植物体内时，植物会产生特殊的能杀 死病原微生物的物质,,植物抗病毒素。人们已 经发现多种植物抗病毒素，如四季豆产生的菜豆 素，豌豆产生的豌豆素等。 对植物抗病和染病的研究属于植物病理学的 范畴，由于农业生产实践的要求，人们期望能找 到更有效防治植物病害的手段，因此，植物病理 学在近代有了较大的发展。植物病理学包括很多 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 ，生理生态学主要是从生态学角度讨论植物 和病原菌相互关系之间的生理生化因素。 第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系 第一节 致病毒素和植物抗毒 素 第一节 致病毒素和植物抗毒素 一、致病毒素 ? 二、植物抗毒素 ? 第一节 致病毒素和植物抗毒素 一、致病毒素(pathotoxin) 致病毒素专指植物病原物产生的对其它寄主有 毒的次生代谢物，是病原物与植物间相互识别、相 互作用过程中的产物，在植物病程中起着决定作用。 按照致病病原菌的种类，可分为植物病原细菌毒素 和植物病原真菌毒素。 (一)植物病原细菌毒素 目前研究较多的植物病原细菌毒素是棒杆菌 (Clavibacter michiganesis)、火疫病菌 (Erwiniaa mylovora)等病原细菌所产生的毒素。 棒杆菌毒素都是致萎毒素，已发现有3个亚种产生 毒素，包括马铃薯环腐病菌 (C.m.Subsp.sepedonicus)毒素，苜蓿萎蔫病菌 (C.m.Subsp.insidiosus)毒素和番茄溃疡病菌 (C.m.Subsp.michiganesis)毒素，在60年代就有 人报道马铃薯环腐病菌产生一种致萎糖肽，以后 又相继发现后两种毒素的化学结构均为糖肽。 对于火疫病菌毒素在1974年证实了火 疫病症状与病菌产生的多糖毒素有关。对 于棒杆菌毒素的致病机理，认为马铃薯环 腐病菌毒素在细胞膜上有作用位点，苜蓿 萎蔫病菌毒素致萎的原因在于阻塞导管纹 孔膜孔，而番茄溃疡病菌毒素主要作用于 小叶导管部位。火疫病菌毒素的作用方式 已证明是由于使木质部水流阻力加大所致。 1987年发现了一种植物细菌病的新病 原菌为xylella fastidiosa，它侵染葡萄、桃、 李、偏桃等许多观赏及莠草植物，还有桑、 无花果、榆、栎树、豚草、长春花等。病 害的症状是丛生、缺绿、叶缘坏死、叶片 和果实变小而脱落，树冠向顶性，新梢萎 蔫，树枝和根系枯萎，植株死亡。目前有 关这种病原细菌的毒素及致病机理还不清 楚。 (二)植物病原真菌毒素 1(寄主专化性真菌毒素 迄今为止已报道有9个属的21种植物病原真菌可以产 生寄主专化性毒素，其中15种明确了其化学结构。 这些寄主专化性毒素主要是由蠕孢菌和链格孢菌产 生的。蠕孢属寄主专化性毒素主要包括HV、HC、 , MT、HS、HMC、,。HV毒素是由燕麦维多利亚叶枯病 菌产生的，该毒素对抗病品种和感病品种的毒性差 异很大。关于它的化学结构是由一个肽基和一个含 氮杂环组成，肽部由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、 缬氨酸、亮氨酸组成，是毒素的专化性部分，而含 氮杂环是一种萜类化合物，无专化性;HC毒素是由 玉米圆斑炭色蠕孢菌1号小种产生，1967年分离了此 毒素，1982年确定了其化学结构为一环状四肽 ，层 析发现HC毒素有4种毒性成分，其中分离物1为主要 组分;HMT毒素是由玉米小斑菌的,小种产生的，据 推测HMT毒素是由直线状的多酮醇组成的混合物，其 中一组分含有5个羟基和7个酮基，另一组分含6个羟 基和6个酮基;HS毒素是由甘蔗眼斑病菌产生的，它 是在1971年分离出来的，经理化分析，现已鉴定出 是一种环丙基-α -半乳糖苷，该毒素有,、,、, 三种异构体，其中,异构体对甘蔗毒性最强;HMC毒 素是由玉米小斑菌,小种产生的，通过柱层析从玉 米小斑病菌,小种培养滤液中分离到了4种分离物， 并定名为HMC-亚毒素;HT毒素是由玉米大斑菌 1号和2号生理小种产生的寄主选择 性毒素，通 过硅胶层析发现2号小种毒素有3种毒性成分， 而1号小种只有2种毒性 成分。 HO H HO C C NH Cl Cl H 2N HN OH O OH O O O COOH NH HN HN O O CHCl O 维多利亚长蠕孢毒素 链格孢属的寄主专化性毒素主要包括:AK、 AM、AL、AF、ACT毒素。1933年报道的菊池链格 孢产生的毒素是报道最早的寄主专化性毒素，现 已发现AK毒素是两种毒素主成分和一种毒素次要 组分的混合物，主组分毒素已结晶提取，并定了 结构式。AM毒素是由苹果链格孢产生的一种寄主 专化性毒素，它是一环状四肽，由3种组分组成， 以?毒性最强，III最弱。AL毒素是由番茄链格 菌产生的，由两种组分组成，经碱解成丙三羧酸 和氨基戊醇两部分，前者对番茄无毒性，后者则 保留了寄主选择性毒性。AF毒素是由草莓黑斑病 菌的簇生链格孢产生的一种寄主专化性毒素，该 菌产生的毒素含有3种组分，这3种组分结构上相 似，但其生物活性不同。ACT是由柑橘黑腐菌宽 皮橘致病型产生。该毒素有两种组 分，,组分 对柑橘有毒，,组分对柑橘无毒却对几个日本 梨品种有毒。 C CO NH R CH CO NH C CO O CO C NH AM病毒 I:R=OCH3 ?: R=H III: R=OH 2(非寄主专化性真菌毒素 近年来，有关非寄主专化性的植物病原真 菌毒素的研究报道很多，但大多都限于镰刀菌属 (Fusarium spp.) 、 长 蠕 孢 (Helminthosporium spp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、轮枝孢菌 (Verticillium)、尾孢菌(Cercospora)等产生的 毒素研究。 镰刀菌毒素包括单端孢霉烯类毒素和玉米 赤霉烯酮类毒素。常见的单端孢霉烯类毒素有雪 腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)，去氧雪腐镰刀 菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，乙酰去氧雪腐 镰刀菌烯醇(Acetoxydexynivalenol，AcDON)， 木霉毒素(Trichodermin)等。这类毒素都是倍半 萜，可引起致命的人畜病，有些对植物也有害。 玉米赤霉烯酮类毒素包括玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEA)，玉米赤霉烯醇 (Zearalenol，ZEN)，4-酰基玉米赤霉烯酮(4Acetylzear-alenol，4-AcAEA)等。长蠕孢菌毒 素包括蛇孢腔毒素，麦根长蠕孢毒素及玉米长蠕 孢毒素等。蛇孢腔毒素是一种二倍半萜类毒素， 在水稻胡麻斑病菌及玉米小斑病菌中发现。链格 孢菌可产生细链格孢毒素和链格孢酸等非寄主专 化性毒素。前者是一种环四肽，后者是一种四酰 胺醇类化合物。引起棉花、番茄、马铃薯黄萎病 的大丽轮枝孢菌可产生轮枝孢毒素，可使棉花、 番茄和马铃薯等植物致萎。国内外的研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明， 这类毒素实际上是蛋白质、多糖和脂类的混合 物，而以蛋白质组分最为重要。尾孢菌产生的 毒素主要包括尾孢毒素、甜菜褐斑病菌毒素、 花生黑斑病菌毒素等。 80年代以来，随着分子生物学的研究进展， 在寄主专化性毒素和非寄主专化性真菌毒素作 用机理的研究上取得了一定的成果。HV、HS、 AK、AF及尾孢病菌毒素这些寄主专化性毒素的 作用位点是植物细胞质膜部位;玉米小斑病菌 毒素、粗皮柠檬黑斑病菌毒素及烟草赤星病菌 毒素的作用位点是线粒体;细链格孢毒素、HC 毒素、AM毒素对叶绿体的生理作用有所影响; 还有些毒素对酶、蛋白质及细胞内的超微结构 有抑制、破坏作用。尤为指出的是HMT毒素对 寄主植物不仅可以影响细胞质膜，还可影响到 线粒体及叶绿体。 (三)致病毒素在植物及病原菌遗传工程中的应 用 1(用于抗病植株的筛选 不论是利用传统方法或是遗传工程技术所 获得的抗病性遗传变异，都要求在感病植株的 群体中鉴定出抗病个体。这项工作通常采用接 种病原茵进行，是一个烦琐而低效的过程。因 此，有的研究工作者认为利用致病毒素是更有 效地鉴定活体植株或植株组织、细胞等器官和 原生质体的手段。 利用致病毒素成功地筛选抗病植株或群体的例 子很多。其中由Helminthosporium victoriae 产生的HV毒素是研究早而且深入 的植物致病毒素。HV毒素是致病性因素，因为 缺乏产毒能力的分离菌不致病。而且HV毒素是 寄主专化性的，只侵染对该菌感病的植株。在 感病的群体中，这种毒素是鉴定极少数抗病植 株的强有力的工具。Wheeler和Luke用HV毒素 从—块感病的燕麦地的100丛中选择出973株抗 病个体。这项研究和其它研究表明，所有高抗 HV毒素的植株都完全抗这种病原茵，而部分抗 毒素的植株对病原菌的反应是中等抗病性，由 于HV毒素是一个致病性因素，抗毒素的水平与 由该菌所致的病害的量是一致的。 2(用于杂草防治 将微生物用于杂草防治的设想可追溯到十 七世纪。其途径之—是引入外来病原菌到当地 杂草群体中，使其变为地方流行病;另一个途 径是把病原菌的繁殖体的配方象化学除草剂一 样直接用于杂草防治。尽管杂草生防至今为止 成功的例子很有限，但借鉴微生物在其他有害 生物防治中成功地应用，其途径和方法是可行 的。 病原微生物致病力强弱是防治杂草成败的 主要原因之一。根据当今生物及遗传工程技术 的发展水平以及在其他领域的应用成果，通过 基因操作，完全有可能使低致病力菌系获得较 强的致病能力。正如前面已经涉及的，已知某 些由病原菌产生的毒素能增强病原菌对寄主的 致病力。目前用传统的方法已经鉴定出一些控 制毒素产生的专性基因，如果控制一种毒素产 生的一个基因或一组基因能人工复制并转移到 对某种杂草是专性的病原菌中，增强的致病力 就能有效地降低杂草群体。考虑到杂草寄主病 原专化性毒素的发现不多，所以更有希望的工 作重点应放在控制非专化性毒素基因的复制和 转移上。 (四)根据致病毒素研制杀菌新药 植物致病毒素 ，特别是寄主特异性毒素 (host specific toxin)在病害发生发展过程中具有重要的 作用。采用化学的方法中和毒素消除其有害作用或抑 制毒素产生，必然干扰病原菌的致病过程，从而达到 防治植物病害的目的。 1(中和植物致病毒素 很早以来，人们就曾设想通过中和或钝化植物病 原菌毒素的方法达到防治植物病害的目的。 Zentmyer(1954)发现8-羟基喹啉苯甲酸酯可以通过内 吸治疗作用减轻油梨根腐病(Phytophthora cinnamomi)的发生。其原理被认为是中和了致病毒 素。 Feldman等(1950)曾设计出一种针对中和毒素筛 选化学治疗剂的方法，并且开发出以水杨酸盐、 尿素、二氨基偶氮苯和熟石灰为组分防治荷兰 榆树枯萎病的化学治疗剂。Tamari等(1966)发 现，阿魏酸可明显提高水稻对稻瘟病的抗性。 侵入菌丝生长受抑制，叶组织呈现抗病的过敏 性反应。离体实验表明，阿魏酸对稻瘟病菌分 生孢子萌发完全没有影响，含有500 ppm阿魏 酸水稻汁液对孢子萌发及其以后的生长也无任 何作用。实验证明，阿魏酸提高水稻组织抗病 性的原因是由于阿魏酸及其氧化物对稻瘟病菌 产生的毒素――稻瘟菌素(piricularin)具有 解毒作用。稻瘟菌素中添加一定剂量阿魏酸可 以抵消对稻种芽长及根长的抑制作用，水稻植 株吸收一定量阿魏酸后同样具有这种作用。 一般认为，许多镰刀菌产生的镰刀菌酸毒 素对植物的有害作用是由于与呼吸酶中铁离子 形成络合物抑制呼吸所致。这种作用可用铁、 镍、锌、铜、锰等金属离子解除。其原理可解 释为是镰刀菌酸直接与金属离子形成络合物不 再与呼吸酶中铁离子发生反应的缘故。奥等 (1988)从蚕豆褐斑病菌(Ascochyta fabae)中 提取的毒素――壳二孢素(ascochitine)同时 也是一种抗菌性物质，其毒性和抗菌活性可被 蛋白质、胨、天门冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、 铁离子等物质解除。 某种化学物质若能促进植物病原菌毒素在 寄主体内代谢，也可减轻病害的发生。 Jost(1965)发现，萎蔫酸在番茄组织内代谢为 N-甲基萎蔫酰胺和5-甲基吡啶羧酸后无毒化， 将吲哚基醋酸稀溶液施与番茄后可增加对镰刀 菌属引起的萎蔫病的抗性，是由于促进了萎蔫 酸毒素的分解过程。 有时某种毒素对植物的毒性是由于抑制了 寄主代谢系统的某个环节使代谢中止，造成某 种中间代谢产物不能合成而引起的。此时若从 外部补充不足成分即能消除或减轻其有害作用。 例如，烟草野火病极毛杆菌(Pseudomonas tabaci)产生的野火毒素(wild fire toxin)的有害作 用是由于抑制了谷氨酰胺合成酶(glutamine synthease)，若人为地给予谷氨酰胺，就可保 护烟草不受其害。此外，菜豆叶烧病菌毛杆菌 (Pseudomonas phaseolicola)产生的菜豆毒素 (phaseotoxin)可抑制寄主鸟氨酸氨甲酰基转 移 酶 (ornithine carbamoyl transferase) ， 导致瓜氨酸、精氨酸缺乏，引起组织黄化。若 在病斑部添加瓜氨酸或精氨酸，则48 h内黄化 病斑消失。 交链孢酸(alternaric acid)是茄链格孢 (Alternaria solani)的致病因子。李树正等 (1994)就多种化合物对交链孢酸的解毒作用进 行了研究。结果表明，KMnO4、FeCl3、 FeSO4、MnSO4柠檬酸铁等化合物具有这种作 用。将交链孢酸分别与上述化合物混合接种番 茄叶片，可不同程度地减弱交链孢酸的植物毒 性。这种解毒作用随化合物浓度提高而增强。 将这些化合物制成一定浓度溶液喷施在番茄叶 片上然后接种番茄早疫病孢子悬浮液，可在一 定程度上减轻番茄早疫病的发生。交链孢酸溶 液中加入KMnO4等化合物后，其紫外吸收光谱图 发生明显的变化。已知交链孢酸对某些植物病 原真菌有抗菌作用，实验证明，KMnO4等化合物 可 明 显 逆 转 交 链 孢 酸 对 Botrytis cinerea 、 Sclerotinia sclerotiorum的抗菌活性。 研究认为，寄主特异性毒素敏感性寄主， 其组织细胞膜内存在与毒素结合的毒素受体， 抗病品种不存在这种受体。若使毒素受体发生 物理化学变化可降低感病组织的感病性。 Otani(1974)证实，对梨黑斑病敏感性梨叶组 织用二硫键还原剂DTT处理，或者用55?热处 理2秒，均可降低叶组织对毒素的敏感性。若 用DTT处理后再用巯基氧化剂5,5-二硫代-双-2硝基苯甲酸酯(DTNB)处理，可消除DTT对毒素 的保护作用，这些研究结果间接证明，感病性 梨组织细胞膜内存在的毒素受体可能是含有二 硫键的蛋白质。另有研究结果证明，巯基化合 物(sulfhydryl)、羧基化合物(carbonyl)、亚胺环 己醇化合物(cycloheximide)等对 Helminthosporirm victoriae的毒素具有保护作 用。但有报导指出，亚胺环己醇和磷酸酯酶 D(phospholipase D)对Periconia circinata毒素 起保护作用，而巯基化合物不起保护作用。这 些研究结果说明三种毒素的毒素受体或作用机 制似有不同之处。如何利用这些研究结果研制 新的解毒剂，干扰毒素的寄主选择特性是值得重 视的研究课题。 2(抑制毒素的生物合成 植物病原菌产生的毒素，其种类及能力因菌 种不同而受基因控制。抑制毒素的生物合成，从 理论上讲可减轻病害的发生。 许多研究表明，碳源、氮源、微量元素以及 氨基酸可影响毒素的产生。许多镰刀菌产生的萎 蔫酸毒素因改变培养基锌离子浓度或氮源而得到 控制。Rouxel等(1990)报道，把ZnSO4添加到油 菜黑胫病菌(Leptosphaeria maculans)生长的培养 基中，可降低致病毒素sirodesmin PL的浓度。把 ZnSO4施加到植株上能抑制子叶和真叶毒素的产 生。若将EDTA-Zn、ZnSO4或ZnCl2喷施到温室植 株上可提高对黑胫病的抗性。Fernando(1986) 认为，高浓度钼对Myrothecium roridum 有毒 代谢产物roridin E的产生有抑制作用。 Hansa(1988)报道，Aspergillus flavas在以 山梨糖或乳糖为碳源的培养基中不产生黄曲霉 毒素而葡萄糖和蔗糖是菌体生长、孢子形成及 毒素产生最好的碳源。小麦链格孢叶枯菌 (Alternaria triticina)毒素产量受碳、氮及 生长调节剂的影响，将葡萄糖、谷氨酸和2.4D添加到培养基中可获得大量的毒素。Takashi 等(1985)研究了26种化学物质对Alternaria alternata菌群致病性及分生孢子萌发时产生 毒素的影响。在A. alternata日本梨变种分生 孢子悬浮液中添加20 ppm蛋氨酸，对孢子萌发、 芽管伸长、附着胞形成以及致病力等几乎没有 影响，但是却明显抑制孢子萌发时寄主特异性 毒素AK毒素的产生，同时对感病的二十世纪日 本梨致病性也降低。进一步研究表明，这两种 化学物质也可抑制A.altetanta苹果变种AM毒 素及草莓变种AF毒素的产生，并使两菌致病力 降低。此外，KH2PO4、NH4Cl、酵母浸膏及半胱 氨酸等对A.alternata梨变种孢子萌发也几乎 没有影响，而能抑制孢子萌发时AK毒素的产生 及其致病力。但是这几种化学物质不象变兰菌 素、蛋氨酸那么明显，需要在较高浓度下才有 抑制作用。研究认为变兰菌素对AK、AM及AF毒 素的抑制作用是干扰了毒素合成过程中脂肪酸 及其相关中间产物的合成。在发酵技术中在培 养基中加入高浓度磷酸盐和氮源通常可抑制次 生代谢物的合成，其原理是由于磷酸可抑制能量代 谢。KH2PO4 对毒素合成的抑制作用可用相似的机制 解释，酵母浸膏的抑制作用说明大量营养物可能对 毒素产生不利。含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸对 毒素合成的抑制作用，原理可能不同于磷酸盐及氮 源，因为它们可在相对较低浓度下产生抑制。 除此之外，某些植物提取物以及化学农药也可 影响毒素的产生。Poutean- Thouvent(1968)发现， 某种菌科植物(Helichrysum arenarium)花汁中的萜 酸(terpene)可抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)毒 素番茄菌肽(lycomarasmin)的生物合成。 Reddy(1987)报导20种植物提取物均有抑制黄曲霉 毒素产生的作用。Mccormick (1988)报道，幼嫩棉 籽皮中含有一种明显抑制黄曲霉毒素形成的化 合物，它可能是一种阴离子蛋白。Draughon等 (1985)证明，把代森锰、西维因、三溴磷等农 药加入玉米培养基中，再接种小麦赤霉菌 (Gibberella zeae)可抑制有毒代谢产物赤霉 烯酮(zearalenone)的产生，田间施用代森锰、 西维因后也可明显减少赤霉烯酮的产生。杀菌 剂百菌清、氯硝胺和代森锰锌可抑制 Myrothecium roridum 有毒代谢产物roridin E 的产生，其中百菌清作用最显著。 某些微生物代谢物也可抑制毒素产生。西 村(1975)发现，丧失梨黑斑病致病性菌株，其 培养滤液可显著抑制致病性菌株寄主特异性毒 素产生，但滤液不影响孢子萌发。将致病菌株 孢子悬浮在该滤液中然后接种梨叶片，孢子虽 正常发芽但不能侵入寄主细胞，叶片不出现病 症。 3(毒素间的保护作用 利用寄主特异性毒素间的相互作用可以减 弱某种毒素的致病作用，为阐明毒素的作用机 理及化学防治提供线索。草莓黑斑病菌 (Alternaria alternata)产生的寄主特异性毒 素AF毒素其化学结构由AF-I、AF-?、AF-?构 成。Fumio等(1986)研究指出，若在AF-I毒素 处理前18小时用AF-?(2.6×10-5 mol/L)处理 草莓叶片，则叶组织因AF-I引起的K+外漏显著 减少。将离体草莓叶片先用AF-?处理，18小 时后再用AF-I处理，再经24小时测量坏死叶脉 面积。结果表明，AF-?可有效地保护感病性 草莓叶片不受AF-I的侵蚀作用。AF-?与AF-I 为10:1时有80%的防治效果。进一步实验，先 用AF-?喷施感病性草莓离体叶片，一定时间 后接种A. alternata孢子悬浮液(每亳升5×105 孢子)，结果表明，因 A. alternata引起的黑 斑数明显减少。 樊 慕 贞 等 (1990) 就 白 菜 黑 斑 病 菌 (Alternaria brassicae)产生的AG毒素(来自 青邦白菜菌株)、AW毒素(来自白邦白菜菌株)。 与 AK 毒 素 ( 来 自 桃 黑 斑 菌 Alternaria kikuchiana)之间相互作用进行了研究。结果 发现，AK毒素对AG和AW毒素的植物毒性有抑制 作用，可降低对种子根抑制率，并使症状减轻。 近年来，植物致病毒素化学结构及其生理 作用的研究使从化学生态学角度开发新型杀菌 剂不断进步。但这一领域的研究国内外均处于 实验室阶段。其难点之一是，若某种化合物仅 能中和毒素但不能抑制毒素的产生，那么只要 病原菌还存活它将继续分泌毒素危害作物，因 此这类物质药效持续期较短。此外，一种病原 菌往往可分泌数种化学结构相似或完全不同的 毒素，而实验室通常仅以一种毒素作为筛选对 象。这也是实际效果不稳定的原因。不过， “从基础到应用”是科学发展的规律。作为新 领域的研究具有十分重要的意义。 二、植物抗毒素 植物抗毒素(phytoalexin)又叫植保素， 是植物体被病原菌侵染后新产生的抗菌物质， 用以对抗病原菌的侵染，而在健康组织里基本 上测不到。 (一)植物抗毒素的概念及研究历史 早在1911年，法国植物学家Noel Bernard 证明植物受真菌侵染后会产生一些抗真菌物质。 他发现当果树芽受丝核菌(Rhizoctonia repens)侵染后，对后继感染的其它真菌有拮 抗作用，但遗憾的是限于当时的科研条件和科 技水平未能分离、鉴定出抗菌物质。1940年， Mülle和B?rger发现类似的现象，他们发现马铃 薯 ( Solanum tuberosum ) 芽 管 受 晚 疫 病 菌 (Phytophthora infestans)侵染后，会产生了一 种被称作“植物抗毒素”的物质，并将该类物质定 义为“由寄生物侵入活细胞所产生的化学物质”。 之后的大量研究表明，植物抗毒素不但可以通过真 菌诱导产生，而且许多物理(如紫外线等)和化学 (如CuCl2 等)因素也可诱导植物抗毒素的产生。 当前普遍接受的观点认为:植物抗毒素是植物受到 生物、化学或物理胁迫后所产生的抗微生物的植物 次生代谢物质，是植物重要的抗病物质基础之一。 其内涵主要包括三方面:1)植物抗毒素是植物通 过外来物诱导产生的;2)植物抗毒素是植物的次 生代谢产物;3)植物抗毒素具有抗病，尤其是抗 真菌病害的作用。 植物抗毒素的种类很多，但习惯上将分子 量小于1000的次生代谢物质称为植物抗毒素。 因此，一些具有抗菌作用的多肽或蛋白质，虽 然它们也是诱导所产生，但一般不把它们视为 植物抗毒素。事实上，判断一种化合物到底是 否为植物抗毒素并不容易，其困难主要在于: 1)有些物质是植物的固有成分，在正常条件 下，它们在植株体内的含量很低，但当植株受 到外来因子的刺激后，这些物质的含量会大幅 度增加。因此，严格地讲，这种物质不属于植 物抗毒素，因为它们并不是植物受到刺激后所 产生的新物质。但由于其含量甚微，在一般条 件下检测不到。因此，有人建议将该类物质也 算作植物抗毒素，并据此建议将植物抗毒素定 义为“植物抗毒素是高等植物的代谢产物，它 们在健康的植物组织中没有或很少，但当植物 受到真菌或细菌的侵染后才会大量产生的植物 次生物质”;2)有些抗菌物质在一种植物上 为组成(constitutive)物质，但在另一种植 物上则是诱导产生的。例如，二氢黄酮樱花亭 (sakuranetin)是植物黑醋栗固有的抗菌物 质，但在水稻叶片上却是由真菌侵染所诱导产 生的，是典型的植物抗毒素。因此，很难确切 地说一种物质是植物抗毒素，还是植物的固有 成分;3)即使是同一抗菌物质，在同一植株 的不同器官上所表现出的化学性质也可能不同。 例如，momilactone A在水稻谷壳和茎杆上为 组成成分，但在叶片上则是由微生物侵染诱导 产生的。 自Mülle和B?rger提出植物抗毒素假说以来， 科学家已对40多科150多属植物进行了研究，涉及 裸子植物和被子植物(包括单子叶植物和双子叶植 物)。仅从500多种豆科植物中就分离到上百种植 物抗毒素。部分植物抗毒素在植物抗病性方面的作 用也得到了证实。随着分子生物学技术的发展，人 们已从分子水平上阐述了植物抗毒素在植物抗病过 程中的作用。其中最有说服力的证据是:Hain等 (1993)利用转基因技术将二苯乙烯合成酶的基因 从葡萄树转移至烟草中，所获得的转基因烟草对灰 霉菌(Botrytis cinerea)的抗性明显提高，在灰 霉病菌侵染点处不仅合成了烟草原来就可以合成的 倍半萜类植物抗毒素，而且合成了烟草原来不能合 成的藜芦醇(resveratrol)，含量高达每克鲜重 40 μ g，从而提供了植物抗毒素是重要的植物抗病 机制之一的直接证据。 (二) 豆科植物的抗毒素 1960年Cruickshank和Perrin把褐腐病菌 (M.fructicola)的分生孢子液，滴加到豌豆 ( Pisum sativum ) 豆 荚 的 内 表 皮 上 ， 于 是 Cruickshank等从这些液滴中分离并鉴定了第 一个植物抗毒素豌豆素(pisatin)，它是一 种紫檀烷(pterocarpan)的衍生物。 现在知道多种真菌都能诱发豌豆产生豌豆 素，豌豆素对多种真菌也都有抑制效应，其有 效浓度大约在10,4,10,5 mol/L之间。豌豆素 能抑制豌豆白粉病病菌( Erysiphe pisi )对 豌豆的侵染。无豌豆素存在时，侵染率达 27.4%，若接种病菌孢子液中含有1?10-5的豌豆 素，侵染率下降到9.6%，若含1?10-4 的豌豆素， 侵染率仅为1.1%。豌豆素对细菌也有一定的抑 制作用。Cruickshank曾实验了24种细菌，对 其中的11个种有抑制作用。 随后，在豆科植物中又分离出多种抗毒素， 大多数是紫檀烷类化合物。如从菜豆中分离的 菜 豆 素 ( phaseollin ) 、 大 豆 中 的 大 豆 素 ( glyceollin ) 和 苜 蓿 中 的 苜 蓿 素 (medicarpin)等，也有不少其他结构类型的 抗毒素。 HO O O O OH O O O O O 豌豆素 菜豆素 豆科植物中蝶形花亚科(Papilionoideae)有着重 要的经济意义，有关豆科植物抗毒素的研究主要集中在 这个亚科的植物里。1960年以来，已有500余种蝶形花 植物被研究过，从中已分离和鉴定了100余种结构不同 的植物抗毒素，主要是异类黄酮类(isoflavonoid)化 合物，也有少量非异类黄酮类化合物。异类黄酮如从洋 刀豆(Canavalia sp.)提取的木豆素(cajanol)等。非 异类黄酮结构的抗毒素，如从豇豆分离 的 豇 豆 素 ( viganfuran ) 和 从 花 生 ( Arachis hypogaea )分离的三羟二苯 乙烯(resveratrol)等。 O HO O O OH OH O OH O O OH 三羟基异黄酮 木豆素 HO O HO OH O O OH 豇豆素 三羟二苯乙烯 (三) 茄科植物的抗毒素 Müller所预言的马铃薯的植物抗毒素，在 他 提 出 抗 毒 素 学 说 近 30 年 后 ， 1968 年 才 被 Tomiyana等分离出来，并由Katsui鉴定了结构， 它是一种去甲倍半萜类化合物，称为日齐素 (rishtin)。在接种马铃薯晚疫病病菌7,8 h，可以测到其存在，24 h后，在侵染点附近 鲜重含量达到了100 ?g/g。这个浓度对马铃薯 晚疫病病菌生长的抑制作用是很明显的，在体 外能使孢子的芽管停止生长。 除了日齐素外，还陆续从接种马铃 薯晚疫病的块茎中，分离出留宾素 (lubimin)、茄歪惕酮(solavetivone)和 日齐醇(rishitinol)等十多个结构相似的 萜类化合物。其中日齐素、留宾素和茄 歪惕酮等3种成分成了萜类抗毒素成分的 85,以上。 HO HO HO CHO O 日齐素 留宾素 茄歪惕酮 马铃薯晚疫病病菌的细胞壁含有抗 毒素的激发子，通常认为是一种多糖成 分。1981年Bostock从这个菌中提取出两 种不饱和脂肪酸二十碳四烯酸和 cicosaoentaenoil acid，能诱导产生大 量抗毒素。脂肪酸和多糖的结合提高了 激发活性，并具有了 特异性。 (四)其他科植物抗毒素 除豆科和茄科外，还有10多个科的植物抗毒 素被研究过。旋花科的甘薯(Ipomoea batatas) 黑斑病是由感染黑斑病病菌(Ceratocystis fimbriata)引起的。染病的甘薯变黑味苦，并 失去了食用价值。从染病的甘薯中分离并鉴定出 甘薯酮(ipomeamarone)，甘薯酮对病原菌是非 特异性的，并且对动物也有很高的毒性。 锦葵科的棉花( Gossypium barbadense ) 受病原菌侵染时，能产生多个和棉酚有关的抗 毒 素 ， 如 棉 素 ( gossyvertin ) 和 半 棉 酚 (hemigossypol)等。蔷薇科苹果的抗毒素是 苯 甲 酸 。 菊 科 植 物 红 花 ( Carthamus tinctoria)中的红花醇(safynol)则是一种 炔类化合物。禾本科的水稻叶片被稻棘壳孢 (Pyricularia oryzae)侵染时，产生了两个 二萜内酯化合物momilactone A和B。燕麦在受 到病菌( Puccinia coronata )侵染时产生了 燕麦宁(avenalunin)，它是一个含氮化合物。 O O O CHO HO OH O 薯酮甘 CH3CH CH(C C)3CH monilactone A CHCHCH2OH OH 红花醇 HO N O O O O OH 棉索 燕麦宁 (五) 植物抗毒素的合成 1(植物抗毒素的生物合成 植物抗毒素的合成实际上是在外源因子的 作用下，植物体内产生的一系列抵御病原菌侵 入的过程，包括:信号激活 ? 信号因子转移、 扩散 ? 防御基因的转录活化 ? 相关物质的 表达 ? 形成化学屏障。能够诱导植物产生植 物抗毒素的因子很多，根据来源可分为生物诱 导子(biotic elicitor)和非生物诱导子 (abiotic elicitor)。生物诱导子包括各种 病原菌(真菌、细菌、病毒及其代谢物)和植 物细胞壁的分离物，非生物诱导子包括物理和 化学因子，如重金属盐类、去污剂、乙烯、氯 仿、水杨酸、杀真菌剂、紫外线、冻融等。按 化学组成诱导子可以分为多糖类、糖蛋白类、 多肽类和脂类(不饱和脂肪酸类)。按植物的防 卫反应，可以将诱导子分为内源诱导子 (endogenous elicitor) 和 外 源 诱 导 子 (exogenous elicitor)。前者是指植物细胞壁 的果胶多糖类，后者包括各种病原菌的表面结 构成份及分泌的代谢物。根据专化性，诱导子 可分为特异性诱导子和非特异性诱导子。特异 性诱导子的作用依赖于植物品种的基因型及其 潜在的抗性，而非特异性诱导子的作用不依赖 于植物品种的基因型及其潜在的抗性。 植物抗毒素是参与植物防御反应的重要生 理活性物质，不同结构类型的植物抗毒素具有 不同的合成途径和抗病机制。以豆科植物产生 的异黄酮类植物抗毒素为例，该类物质能够直 接阻止病原物的生长、发育和侵染，其作用机 制是干扰真菌的甾体营养或影响真菌细胞膜的 透性。大量的研究证实，异黄酮类植物抗毒素 的合成与苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)有关。PAL是该类植 物抗毒素生物合成的关键酶，它催化苯丙氨酸 直接脱氨基转化为反式肉桂酸。例如，菜豆素 的生物合成与PAL的活性呈正相关，随着PAL 活性增高，菜豆素的合成增加。 相反，用PAL抑制剂L-2-氨氧基-3-苯丙酸和 α -氨氧基乙酸处理植物幼苗，植物体内的植 物抗毒素的合成和累积则受到抑制。现已证明 PAL的活性受产物的反馈调节，其表达受苯丙 烷类代谢途径产物的调节，如果将外源反式肉 桂酸加到经病原菌诱导物处理过的菜豆悬浮细 胞系中，则会导致PAL迅速失活，编码PAL及其 它植物抗毒素合成酶的mRNAs合成受到抑制， 从而影响了基因的转录和翻译。因此，认为肉 桂酸可能是植物体内苯丙烷类代谢途径酶类合 成的调节剂。有关黄酮类天然产物(包括植物 抗 毒 素 ) 的 生 物 合 成 途 径 详 见 Dixon 和 Steele(1999)的评述。 另一类比较重要的植物抗毒素是倍半萜类 物质，其生物合成与植物的异戊二烯途径有关。 近年来的研究证实，该类植物抗毒素的生物合 成受3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase ， HMGR)基因表达的调控。HMGR的活性变化与倍 半萜产物的合成密切相关。进一步的研究表明， HMGR是由一类HMGR基因家族编码的，在这些基 因家族中，不同同源基因的表达可能控制着细 胞质中甲羟戊酸代谢中的“碳流”流向，从而 在转录水平上决定了终产物萜类物质的变化， 进而调控细胞质中萜类物质的含量。 有关植物抗毒素形成的假说很多，从分子 水平来看不外乎有如下机制:1)植物抗毒素 的形成是由于酶合成的去阻遏。低浓度的诱导 物可使植物抗毒素合成中的控制合成调节酶的 DNA片段去阻遏;2)寄主植物特异性代谢物 和病原物质膜上的特异性受体相互作用，使寄 生物产生激发子后，激发子又和寄主细胞相互 作用，刺激植物抗毒素的形成，其中寄主植物 抗性基因与病原物无毒基因分别控制寄主代谢 物和病原物质膜受体的合成;3)植物抗毒素 的合成和控制取决于早期识别阶段，病原物产 生的特异性激发子和寄主膜上特异性受体之间 的相互作用。特异性激发子是病原物的显性无 无毒基因编码的，而特异性受体是寄主植物显 性抗性基因编码的;4)“双重诱导作用”假 说认为植物代谢物在侵染时调节激发子形成的 质和量，激发子在原位通过重新合成酶，或通 过活化已存在的酶而调节植物抗毒素的合成; 5)植物抗毒素的形成受特异性阻遏子的调节， 植物抗毒素的特异性是受激发子和阻遏子之间 的平衡所决定的。 简而言之，在病原菌或一些非生物诱导因 子与植物相应受体结合的作用下，通过信号传 导受体系统，激活了植物的防御体系，使其产 生了一系列的生理生化反应，合成对致病菌有 抑制作用的小分子化合物——植物抗毒素，进 而阻止致病菌的侵入、繁殖、扩展，实现防病 的目的。 2(植物抗毒素的诱导合成 生物诱导子主要是一些植物病原真菌和植 物害虫，其中病原真菌诱导子研究较多。接种 和侵染目标植物遣? 婢 盏贾参锟苟舅厣?成的主要方式。病原真菌接种和侵染目标植物 的部位因研究目的不同而有所差异，可以是植 物的叶片、果实、根系以及茎杆，其中叶片和 果实是较常见的接种部位。研究植物果实植物 抗毒素一般有未成熟的果实，先用70%的乙醇 洗净果实表皮，再用沙纸轻擦果实的表皮，使 其表皮有轻微破损，然后将该果实浸于病原真 菌的孢子悬浮液中，浸泡时间与孢子悬浮液的 浓度有关，浓度高则浸泡时间短，浓度低则浸 泡时间可稍加延长。接种了病原真菌的果实应 再培养一段时间，培养时间和温度因植物而异。 经过接种和培养的果实便可用于植物抗毒素的 分离、纯化及结构鉴定。叶片的接种和侵染与 果实的接种和侵染相似，具体可参见Pedras等 (2000)介绍的方法。线虫作为植物害虫也可 作植物抗毒素生物诱导子，其诱导方法与病原 真菌诱导方法略有不同，具体操作可参见 Yamada等(1993)方法。 非生物诱导子包括重金属离子(如Cu2+、 Fe2+、Hg2+、Co2+等)、紫外线以及有机分子 (如N,乙酰壳聚糖、茉莉酸等)。与生物诱 导子相比，非生物诱导子研究较少。重金属离 子作为植物抗毒素的诱导子，一般是将目标植 物的茎杆、叶片或其他组织加到含该重金属离 子的盐溶液中，盐的浓度及处理时间因 植物而异。紫外线诱导方法是用能发射 特定波长的紫外灯照射处理植物，波长 范围一般为254,345 nm，处理时间一般 为15,60 min。茉莉酸诱导方法是将一 定浓度的茉莉酸溶液滴于植物叶片的受 伤部位，经过适当时间的培养后取样进 行分析。N,乙酰壳聚糖的诱导方法与茉 莉酸诱导方法相似。 (六)植物抗毒素的应用前景 随着人类生活质量的提高，人们强烈要求生产 没有农药残留的绿色食品，而实现绿色食品的最好 的方法就是提高寄主植物的抗病性(对病害而言)， 具体措施主要有三条:一是利用传统育种手段直接 培育抗病品种;二是利用基因重组技术培育转基因 抗病植株;三是利用各种物理、化学或生物手段， 诱导植物产生抗病性。比较而言，采用常规育种或 转基因技术育种难度较大，成功比例较低，而采用 诱导技术相对容易，成功率较高，且一旦方法建立， 可用于多种相关作物。因此，在目前强调可持续发 展农业阶段，关注环境保护的二十一世纪，开发和 研制能够诱导植物产生抗菌物质的诱导剂作为无公 害农药是一个重要的发展方向。 实验证明很多植物抗毒素具有抑菌作用， 因此有关植物抗毒素结构和活性等的深入研究， 会给新型杀菌剂的研制提供新的线索。有时一 种植物产生的抗毒素，能更有效地抑制病原菌 对另一种植物的侵染，这样抗毒素也可直接用 于杀菌剂，以对不同植物提供交叉保护。 Ward等人发现，马铃薯晚疫病病菌在体外 对辣椒素特别敏感。他们进一步实验用从辣椒 提取来的辣椒素防治马铃薯晚疫病病菌对番茄 的侵染。在有3,4个展开叶片的番茄苗上喷洒 病菌孢子液，1.5 h后再喷洒不同浓度的辣椒 素，72 h病斑清晰可见而又未互相愈合，统计 3个叶片上的病斑总数。对照病斑数为135个， 辣椒素浓度为5?10-4 mol/L为16.6个，2.5?10-3 mol/L仅为1个，抑制效果是很明显的。 近年由于植物基因工程技术的兴起，又为 植物抗毒素的研究开辟了新的天地。许多不同 科植物受到病原菌侵染时，都能产生二苯乙烯 型的植物抗毒素，如花生、葡萄和松等。植物 中一般也都有二苯乙烯的前体化合物，只是缺 少特殊的二苯乙烯合成酶。Hain和Reif(1993) 从葡萄分离出二苯乙烯合成酶基因，它的表达 能力很强，把它导入并整合到烟草的染色体上， 获得了烟草转基因抗性植株。在温室中，对转 基因植株和对照植株上接种灰葡萄孢 (B.cinerea)，7天后测量各自的发病率，和 对照相比，转基因植株下降了50,以上，最多 的降低了81.6%。但转入的基因若是花生和葡 萄嵌合的二苯乙烯合成酶基因，抑菌的效果就 很小。 生化测定表明，在病原菌侵染转基因抗性植株48 h时，三羟二苯乙烯含量达到了鲜重400 ?g/g，这个 浓度在体外对真菌的生长即有抑制作用 。Hain和 Reif的研究结果无疑给植物抗毒素的研究注入了新 的活力，展现了新的前景。 大量的研究证实，植物抗毒素的确在控制植物病 害中具有重要的作用，但在实际应用中还应审慎处 理，因为植物抗毒素与其它化合物一样，也有一些 不尽人意的特性，主要表现在:1)毒性问题:现代 研究表明，许多植物抗毒素是有毒的，且其毒性是 非专化性的，它们既对病菌有毒，也对人类有害， 这样植物抗毒素能否作为新型杀菌剂就受到人们的 普遍质疑;2)杀菌活性较低:与商用合成杀菌剂相 比，植物抗毒素的杀菌活性很低，使用浓度往往大 于100 ?g/ml。也正是由于这一问题，植物抗毒素的 研究虽然已有40多年历史，但目前尚未见真正商品 化的产品。 第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系 第一节 致病毒素和植物抗毒 素 第二节 病原菌侵染植物的过 程及对寄主植物的影响 第二节 病原菌侵染植物的过程及 对寄主植物的影响 一、侵染过程 ? 二、植物抗 病性的类型 ? 三、病害对植物的生理生态影响 ? 四、植物抗病机理 ? 第二节 病原菌侵染植物的过程及对 寄主植物的影响 病原菌孢子通过各种途径到达植物体后， 在合适的条件下就开始了侵染植物的过程。 如能侵染成功，就能在植物体上定居下来并 生长繁殖。在这个过程中，病原菌能产生某 些毒素，而使植物表现出一定的病症。 一、侵染过程 病原菌通过气流、水流或动物的携带，得 以到达寄主植物上，在合适的气候条件下(主 要是温度和湿度)，孢子发芽生出芽管，或由 植物叶面直接侵入，或通过植物的气孔、皮孔、 蜜腺以及伤口等处，侵入到植物的组织内。气 传病原菌孢子落到寄主叶面，并在适当部位黏 着在叶片上，接着生出芽管，有的病菌还能生 出附着泡，由芽管或附着泡直接刺穿角质层， 侵入植物组织内。 油 菜 常 因 核 盘 菌 ( Sclerotinia sclerotiorum)的侵染而罹病。核盘菌在油菜 叶上先形成复合附着器，其小分枝末端生有一 个侵染钉，由它侵入表皮的蜡质和角质层，进 而表皮细胞层，并借助于酶使寄主表面软化消 解。核盘菌侵入后迅速生长导致油菜腐烂。 寄主表面的物理和化学因素、角质层的厚 度和成分、表层细胞壁的结构和厚度等，都和 侵入的成功与否有关。从气孔侵入的还和气孔 的结构、密度和空间排列有关。 病原菌要侵入成功还必须攻破植物的化学 防御屏障。植物除了原有的和被活化了的抗菌 物质外，还能产生新的植物抗毒素，来阻止病 原菌的侵染;病原菌在进化中也不断地形成对 付这些抗毒素的解毒机制，使侵入得以成功。 致病菌一方面对植物抗毒素有很高的耐受性， 另一方面又能将抗毒素迅速脱毒;而非致病菌 对毒素是敏感的，又不能使其脱毒，因而侵染 便不能成功。 二、植物抗病性的类型 (一)植物对病原菌的反应类型 植物受病原菌侵染后，从完全不发病到严 重发病，在一定范围内表现为连续过程，因此 同一植物既可以认为是抗病的，也可以认为是 感病的，这要根据具体情况而定。寄主对病原 物侵染的反应可分为下列几种类型:1)感病 (susceptible)，寄主受病原物的侵染而发生病 害，生长发育受阻，甚至局部或全株死亡，影 响产量和质量。损失较大者为高度或严重感病; 2)耐病(tolerant)，寄主对病原物是敏感的，受 侵染后有发病症状，但对产量及品质没有很大 影响;3)抗病(resistant)，病原物侵入寄主 后被局限或不能继续扩展，寄主发病较轻，对 产量、品质影响不大。发病很轻者为高抗;4) 免疫(immune)，寄主排斥或破坏进入机体的病 原物，在有利于病害发生的条件下不感染或不 发生任何病症，这在植物中较少见。 (二)抗病性反应的几种类型 1(避病，受到病原物侵染后不发病或发病较轻，这 并非由于寄主自身具有抗病性，而是病原物的盛发期和 寄主的感病期不一致，植物即可避免侵染。如雨季葡萄 炭疽病孢子大量产生时，早熟葡萄品种已经采收或接近 采收，因此避开了危害;又如大麦在自花授粉前，花序 始终在旗叶鞘里，由于雌蕊不暴露，结果避开了黑穗病。 2(抗侵入，指由于寄主具有的形态、解剖结构及生 理生化的某些特点，可以阻止或削弱某些病原物侵入的 抗性类型。如叶表皮的茸毛、剌、蜡质、角质层等，此 外如气孔数目、结构及开闭规律、表面伤口的愈合能力、 分泌可抑制病原物孢子萌发和侵入的化学物质等，均与 抗侵入的机理有关。 3(抗扩展，寄主的某些组织结构或生理生 化特征，使侵入寄主的病原物进一步的扩展被 阻止或限制。如厚壁、木栓及胶质组织可以限 制扩展。组织营养成分、pH、渗透势及细胞含 有的特殊化学物质:抗菌素、植物碱、酚、单 宁及侵染后产生的植保素等，均不利于病原物 的继续扩展。 4(过敏性反应，又称保卫性坏死反应，是 病原物侵染后，侵染点附近的寄主细胞和组织 很快死亡，使病原物不能进一步扩展的现象。 三、病害对植物的生理生态影响 (一)病原菌对寄主植物个体的影响 病原菌对寄主植物个体的影响表现在寄主 植物生长发育的各个不同时期(图4-1)。在植 物生长发育的各个不同时期、病原菌的感染致 病均有可能导致寄主植物死亡。病原菌可不同 程度地减少寄主植物的结实率，甚致使寄主植 物完全不育;病原菌对寄主植物个体的另一重 要影响是降低其与同种或他种健康个体竞争的 能力(影响物种竞争的结果，从而改变种群或 群落的基因组成和演化趋势。 病原茵对寄主植物的影响有其可见的一面。 如在寄主植物的茎、叶或花上形成各种形态和 颜色的菌斑。在另一方面，病原菌对寄主植物 还有着间接和深远的生物学影响。Jarosz等 (1989)的跟踪研究表明:病原菌对寄主植物 的适应性有一定的影响，这种影响可延续2,3 代，包括降低寄主植物子代的生命力，减少其 结实率，改变其生态幅等。但是，不同的病原 菌与寄主植物系统的相互作用结果往往大相径 庭。Lee等(1981)研究指出，某些病原菌感 染后可诱导其寄主植物多开花，或促进寄主植 物的营养生长，增强其生命力。Burdon更发现 某些病原茵可增强其寄主植物的竞争能力或减 轻食草动物的啃食。 图 4-1 植物生活周期的4个主要阶段各为病原菌提供不同的生态灶;病原菌在寄主 植物 生活周期的各个不同时期对其发生影响(引自Burdon，1987) 在自然植物种群中，病原茵使其寄主植物 不育的现象比较常见。在这种情况下，寄主植 物体内有机物质的分配发生改变，将原本要分 配到果实中去的有机物质转而用以促进营养生 长或形成更多的不孕花，从而益于病原菌的生 长发育及再感染。例如，紫坚黑粉菌 (Ustilago violacea) 感 染 白 车 轴 草 (Silenealba)后不仅使后者不育，而且自身生 长发育加快，再感染的速率提高。同样是紫坚 黑粉菌，感染 Viscaria vulgaris 后使后者的 花期延长，且花数大大增加。 (二)病原菌对寄主植物种群生物学和种群遗传结构 的影响 病原菌对寄主植物种群生物学的影响大都是 密度依赖(density-dependent)型的，由于这 种影响方式本身的负反馈作用，寄主植物种群的 大小(population size)将最终达到某种动态平衡。 但是，在有些相互作用系统中，病原菌对寄主植 物的影响方式是非密度依赖(densityindependent)的，Burdon和Chilvers对自然植物 种群中病原菌的作用方式进行了统计，结果发现 属于密度依赖型的比例为62,。Jennersten等发 现:自然植物种群中菌病的发生不仅与植物的总 体密度有关，而且与植物的分布类型 (distribution patterns)和分布块大小(path size) 有关。同种寄主植物具有不同分布类型的种群; 或者分布类型相同，但分布块大小有别的种群， 其菌病的发生率有不同程度的差异。病原菌对 寄主植物种群大小、结构和动态的影响及结果 也不同。自然植物种群中菌病的发生与寄主植 物种群的大小存在着正相关的关系，但尚无足 够的研究证据表明其间存在负反馈的关系，所 涉及的问题很难在纯自然条件下找到答案，有 待于在人工控制的温室和其它实验条件下研究 解决。 病原菌作为一种选择压可诱导寄主植物种 群产生抗性基因型，从而改变寄主植物种群的 遗传结构。从抗病适应的角度讲，抗性基因型 有在种群中居于主导地位的潜势，但遗传的频 度依赖型选择(frequen-cy-dependentselection) 将使得各稀有基因型免遭淘汰，以保持种群的 遗传多样性。实验和模型研究揭示:只有当病 原菌的致病力和寄主植物的抗性均与适应代价 (fitnesscost)负相关时，寄主植物种群的遗传 多态才能保持。当寄主植物抗性与其适应性负 相关时，抗性基因的出现以牺牲其适应性为代 价，如果寄主植物种群全部或大部由抗性基因 型个体组成，那么该种群的适应性势必很差， 在生存竞争和生态适应上将极为不利。事实上， 寄主植物种群中抗性个体的比例总是维持在一 定的水平上，这就保持并丰富了种群的遗传多 态。基于同理，病原菌本身的遗传多态得以保 持，进而促进了寄主植物种群的抗性多样性。 Burdon等为寄主植物抗性与其适应性负相 关提供了进一步的实验证据，他们在研究中发 现，在无病原菌存在的情况下具感受型基因型 (susceptible genotype)的寄主植物在竞争中 优于具有抗性基因型(re-sistantgenotype) 的 寄主植物。来自农业种群的研究表明:在无病 原菌存在的情况下，抗性寄主植物的产量比感 受型寄主植物的产量低5%,10%。但必须指出 的是，不论是在自然植物种群，还是在农业种 群，当病原菌存在时抗性寄主植物在竞争上优 于感受型寄主植物，产量也大于后者。 (三)病原菌对寄主植物生理生化因素的影响 1(水分平衡失调 植物受病菌感染后，首先表现出水分平衡 失调，常以萎蔫或猝倒为特征。造成水分失调 的原因主要有:1)根被病菌损坏，不能正常吸 水;2)维管束被病菌或病菌引起的寄主代谢产 物(胶质、粘液等)堵塞，水流阻力增大。如感 染黄矮病的蕃茄茎杆水流阻力比健康植株大 200倍;3)病菌破坏了原生质结构，使其透性 加大，蒸腾失水过多。 2(呼吸作用加强 病株的呼吸速率往往比健康植株高10倍。 呼吸速率增强的原因，一方面是病原微生物进 行着强烈的呼吸，另一方面是寄主自身的呼吸 加快。因为健康组织的酶与底物在细胞里是间 隔开的，病害侵染后间隔被打破，酶与底物直 接接触，呼吸提高。由于氧化磷酸化解偶联， 大部分呼吸能以热能形式释放，所以染病组织 的温度升高。 3(光合作用抑制 植物感病后，光合速率即开始下降，其直 接原因可能是叶绿体受到破坏，叶绿素合成减 少。随着感染的加重，光合更弱，甚至完全失 去同化CO2的能力。 4(激素发生变化 某些病害症状(如形成肿瘤、偏上生长、生 长速度猛增等)都与植物激素的变化有关。组 织在染病时大量合成各种激素，其中以吲哚乙 酸含量增加最突出，进而促进乙烯的大量生成 如锈病能提高小麦植株吲哚乙酸含量。有些病 症是赤霉素代谢异常所致。例如，水稻恶苗病 是由于赤霉菌侵染后，产生大量赤霉素，使植 株徒长，而小麦丛矮病则是由于病毒侵染使小 麦植株赤霉素含量下降，植株矮化，因而喷施 赤霉素即可得到改善。 5(同化物运输受干扰，感病后同化物比较多的 运向病区，糖输入增加和病区组织呼吸提高是 相一致的。水稻、小麦的功能叶感病后，严重 防碍光合产物输出，影响籽实饱满。 四、植物抗病机理 植物对病原菌侵染有多方面的抵抗能力。例如， 形态结构对病菌不适应，生理代谢对病原菌的限制 以及抗病物质的产生等。植物有类似动物的免疫反 应。如果先用无致病力的菌株或死的病菌接种植物 体内，植物就会产生对病原菌有毒杀作用的物质。 这类物质的产生，可认为是植物的一种免疫反应。 植物抗病的途径很多，主要如下: (一)形态结构屏障:许多植物外部都有角质层 保护，坚厚的角质层能阻止病菌侵入机体组织。苹 果和李的果实在一定程度上能抵抗各种腐烂病真菌， 主要依赖角质层的增厚。三叶橡胶树白粉病菌不侵 染老叶，就是因为老叶有坚厚的角质层结构作保护。 (二)组织局部坏死:有些病原真菌只能寄 生在活的细胞里，在死细胞里不能生存。抗病 品种与这类病原菌接触时，过敏反应 (hypersensitive reaction，HR)的结果是在侵 染部位形成枯斑(necrotic lesion)，被侵染的细 胞或组织坏溃 共? 貌坏胶鲜驶肪扯 ?亡，这样病害就被局限于某个范围而不能扩展。 因此组织坏死是一个保护性反应。 此外，人们发现在局部的HR处植物还产 生一类信号分子，顺着韧皮部传递到整株并使 植物对更多种的病原微生物产生颉颃作用，即 所 谓 系 统 获 得 性 抗 性 (systemic acquired resistance，SAR)，这些SAR的信号分子可能 包括水杨酸、茉莉酸类、乙烯、脱落酸等。 (三)病菌抑制物:植物体原本就含有一些 物质对病菌有抑制作用，使病菌无在寄主中生 长。酚类化合物与抗病有明显的关系，如儿茶 酚对洋葱鳞茎炭疽病菌的抑制，绿原酸对马铃 薯的疮痂病、晚疫病和黄萎病的抑制等。亚麻 根分泌的一种含氰化合物，可抑制微生物的呼 吸。生物碱、单宁都有一定的抗病作用。 (四)植物抗毒素:广义的植物抗毒素是指 所有与抗病有关的化学物质;而狭义的抗毒素 仅限于病原物或其它非生物因子剌激后寄主才 产生的一类对病原物有抑制作用的物质(见第 一节)。 (五)病原相关蛋白:病原相关蛋白(PRs) 是植物被病原菌感染或一些特定化合物处理后 新产生(或累积)的蛋白。PRs的种类很多，如 有的PRs具有β -1,3-葡聚糖酶或壳多糖酶等水 解酶的活性，它们分别以葡聚糖和甲壳素(甲 壳质、几丁质)为作用底物。高等植物不含甲 壳素，只含少量的葡聚糖，但它们是大多数真 菌及部分细菌的主要成分。这两种酶在健康植 株中含量很低，在染病后的植株中含量却大大 提高，通过对病原菌菌丝的直接裂解作用而抑 制其进一步侵染。 此外，植物还通过多种方式来达到抗病的 效果，如加强氧化酶活性。当病原微生物侵入 作物体时，该部分组织的氧化酶活性加强，如 过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶等，它们可以分 解毒素，促进伤口愈合，抑制病原菌水解酶活 性，从而抵抗病害的扩展。苯丙氨酸代谢途径 的产物如木质素、香豆素、类黄酮等也常常具 有抑制病原菌的作用，因此该代谢的第一个关 键酶苯丙氨酸解氨酶的活性强弱可作为抗病性 的重要生理指标。 总之，要提高植物的抗病性，可从多方面 入手。培育抗病品种是防治病害的重要手段， 改善植物的生存环境和营养状况也是提高抗病 能力的重要措施。 第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系 第一节 致病毒素和植物抗毒 素 第二节 病原菌侵染植物的过 程及对寄主植物的影响 第三节 植物与病原菌互作 和 抗病性的分子机制 第三节 植物与病原菌互作和抗病 性的分子机制 一、抗病相关基因 ? 二、病原菌 致病相关基因 ? 三、植物病原菌激发子及与受体的识别机制 ? 四、植物抗病反应 的信号传导 ? 五、抗毒素基因工程 ? 第三节 植物与病原菌互作和抗病性 的分子机制 早在40年代末50年代初，Flor(1947;1955) 在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中，提 出 了 基 因 对 基 因 假 说 (gene-for-gene hypothesis)，这 标志 禁止坐卧标志下载饮用水保护区标志下载桥隧标志图下载上坡路安全标志下载地理标志专用标志下载 着对植物与病原菌互作的 认识深入到了基因水平，从而为应用分子生物学 手段研究植物抗病性奠定了基础。 一、抗病相关基因 根据基因的作用性质，可把抗病反应过程 中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反 应基因。抗病基因是决定寄主植物对病原菌的 专化性识别，并激发抗病反应的基因。即按 Flor的基因对基因理论，它与病原菌的无毒基 因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对 基因理论分子机制的配体-受体模型，它的产 物是抗病反应信号传导链的起始组分，即信息 链的前端，当它与病原菌的无毒基因直接或间 接编码产物互补结合后，启动信号传导激发植 物的抗病反应。防卫反应基因是一类在抗病机 制中最终起作用的基因，它们的编码产物直接 或间接地作用于病原。 (一)抗病基因 接收病原菌信号，启动植物抗病反应信号 转导的是植物抗病基因的编码产物，这是分子 植物病理学研究寄主植物的重点和难点。自 1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 因 Hm1 ，1993年应用作图克隆法分离出第二个 抗病基因 Pto 后，现已至少分离出16个抗病基 因(R基因)。这些基因的克隆为人们从分子水 平上揭示植物抗病的内在机理以及植物的信号 传递机制，并通过基因工程利用R基因快速培 育新的抗病作物品种奠定了基础。 目前已经克隆的R基因可以分为5个大类: STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和 Hm1。STK类R基因如番茄Pto基因，其产物是 一个没有LRR结构域，位于细胞质内的典型的 丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，通过丝氨 酸和苏氨酸残基的磷酸化来传递信号。LRRTM类R基因的产物为锚定于细胞膜上的糖蛋白 受体，包括三个区域:LRR结构域，跨膜区域 和很短的胞内区域(仅有数十个氨基酸残基)。 NBS-LRR类R基因的共同特点是:在它们编码 蛋白的近N端处存在着核苷酸结合位点。而在 它们的近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列。 LRR是蛋白与蛋白相互作用的一种典型结构， 它是由十多个β 折叠-环-α 螺旋基本单位串联 形成的空间构型，呈蹄铁(horseshoe)状的结 构。这些膜受体的LRR结构伸展于细胞外，蹄 铁状结构的凹陷处便是结合多样性配体的部位。 LRR-TM-STK 类R基因，如水稻抗白叶枯病基因 Xa21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶，它的产 物含有 STK 和 LRR-TM 两类R基因的结构特点。 Hm1类R基因为玉米抗HC-毒素基因Hm1。玉米圆 斑病菌( C.carbonum1)号小种产生HC-毒素， 它是一个环状的四肽。当玉米在位点Hm1隐性 纯合时，该四肽是有毒致命的。 (二)防卫反应基因 防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起 作用的基因，受病原等分子的诱导，它们的编 码产物直接或间接地作用于病原。一些已克隆 的防卫反应基因按功能可分为3类:1)抑菌活 性物质:包括:A:抗病小分子物质生成及相 关酶类如活性氧、脂过氧化、毒性不饱和脂肪 酸生成、抗植物毒素生成及相关酶类、糖苷酶 和毒性苷元释放、过氧化物酶、多酚氧化酶和 酚类物质氧化。B:抗病相关蛋白共5类，PR-l、 PR-2、PR-3、PR-4、PR-5。或其中有降解病 原菌细胞壁的酶类，如几丁酶、β -1，3-葡聚 糖酶;有抑制病原菌生长的酶类，如过氧化物 酶、超氧化物歧化酶、脂氧化酶等。大多数抗 病相关蛋白的功能未知;2)结构性变化及相关 的 酶 : 胞 壁 羟 脯 氨 酸 (HPGRP) 及 甘 氨 酸 糖 蛋 (GRP)的生成与凝聚、胞壁木质化及相关酶、 伤口栓质化及相关酶、胞壁胼胝体生成、导管 中侵填体(tylose)的形成等;3)致病因子解除 的酶或小分子化合物:抑制病原果胶酶、蛋白 酶的抑制剂、病原毒素脱毒酶。每一类基因都 已从不同植物及其它物种中分离、克隆出一批。 抗病水平高低不仅要看这些基因的表达时间和 水平，还要看这些基因的累加效应。 二、病原菌致病相关基因 病原菌致病相关基因是病原菌在与寄主植 物互作过程中，决定其对寄主植物致病性的基 因。它决定着病原菌在侵染寄主植物过程中与 植物建立寄生关系，破坏寄主细胞正常的生理 代谢功能，以及调控对植物的吸附、侵染、定 殖、扩展和最终显症等过程。根据致病相关基 因编码产物的功能，致病相关基因可分为:毒 性基因、无毒基因和决定寄主范围的基因。 从70年代明确了引起肿瘤的根瘤农杆菌毒 性因子是T-DNA，并发现了Ti质粒引起T-DNA 切离、转化和整合的毒性基因区(Vir区)开始， 致病基因的分离和鉴定，产物的结构和功能及 表达调控已扩展到其他病原细菌、真菌、病毒 及线虫等。继Lindgren(1984)等首先发现毒性 基 因 Hrp(hypersensitive response and pathogenicity) 表 型 ， Boucher(1985) 提 出 了 毒 性 基 因 的 Dsp(disease specific pathogenicity)表型，Staskawicz(1984)等分 离出第一个病原菌无毒基因 avrA以后，目前从 植物病原菌中克隆的致病基因有150个以上， 仅从细菌中克隆的无毒基因就超过40个。当前， 病原菌致病相关基因的相互关系和表达调控是 新的研究热点。 毒素是一些病原菌在寄主体内定殖和诱发 病害不可缺少的致病因子(见第一节)。1986 年Richard在植物病原细菌 P.syringaepv.phaseolicola中克隆了第一个编 码毒素的基因。1991年Patil等人又研究了细菌 毒素菜豆毒素的基因，发现该基因长度为1.0 kb，并且该毒素的作用模式符合抑制子-受体 学说。通过研究认为，植物病原细菌毒素的基 因多数存在于质粒上，并且成簇排列。和细胞 壁水解酶相比，大部分毒素作为致病因子是明 确的，因此有关它的研究，包括基因克隆，将 会比过去更加受重视。而且，还有越来越多的 报道证明一些毒素是抗病反应的激发子或诱导 子或抑制子，显示了毒素在病害系统互作中 功能的多样性和复杂性，但多为诱导子，诱导 植物抗性增加。如Mayana(1991)证明HV-toxin 诱导PC-2基因的燕麦品种的植保素合成增加， 且 增 加 幅 度 比 病 菌 激 发 子 诱 导 的 高 10 倍 ， Ehrenshaft(1993) 证 明 Cercosporin( 尾 孢 素 ) 诱导寄主产生抗性蛋白，草酸可诱导黄瓜和油 菜多种防御反应酶活性的增加或种类的变化。 胞外水解酶类是病原菌分泌的，在侵染过 程中降解植物细胞壁成分的酶类，如果胶酶 (PG)、纤维素酶、蛋白酶等。已克隆的真菌 PG基因均为1100,1350 bp，大多含1,5内 元，但核盘菌PG基因无内元。不同真菌PG基 因的DNA序列同源性很低。不同真菌PG基因 的氨基酸序列同源性一般在60%,65%，而同 细菌和植物的同源性仅为20%。研究表明，一 个组氨酸残基和一个羧基群是PG活性所必须的， 组氨酸残基及其侧翼的丝氨酸和酰氨酸残基的 氨基酸序列是高度保守的。据DNA序列，所有 PG蛋白质都含有一个长20,40氨基酸的信号肽， 总的分子量为33,38 KD。其它果胶酶基因在 真菌种间的变化和PG基因相似。尽管果胶酶的 初级结构同源性差，但它们的同工酶四级结构 相似性高。如 A.niger的PGII抗体与核盘菌等 多种真菌的PG蛋白有交叉反应。 三、植物病原菌激发子及与受体的识别机制 植物在抵御病原菌侵害的过程中，关键环 节是病原菌与寄主的相互识别及其随后诱发的 一系列防卫反应。植物正是通过细胞表面或亚 细胞表面的受体分子与病原菌的激发子结合， 启动级联信号系统，活化防卫基因的表达，最 终表现对病原菌的抗性。因此，研究植物病原 菌的激发子及其对病菌信号的识别机制，对认 识植物的抗病性，特别是非寄主植物对病原菌 的广谱抗病性具有重要的意义。 1(植物病原菌激发子的种类 激发子是一类能诱导植物产生防卫反应的 化合物，依来源可分为生物和非生物激发子。 前者是指来自病原微生物和其他微生物、寄主 植物，或由寄主植物病原微生物互作后产生。 病原微生物和其他微生物产生的激发子包括真 菌的葡聚糖、糖蛋白、脂类物质和其他细胞壁 组分，细菌细胞壁结构组分中的脂多糖和鞭毛 蛋白，病毒的外壳蛋白，线虫口针和头部的糖 蛋白等。寄主植物产生的激发子主要是细胞壁 组分中的寡糖物质，如寡聚半乳糖醛酸和木聚 糖片段。寄主植物病原微生物互作后产生的激 发子主要是由互作过程中酶对寄主和病原微生 物细胞组分修饰后产生的，如植物中的几丁质 酶和β -葡聚糖酶降解真菌细胞壁组分后释放 的几丁质及葡聚糖片段等。非生物激发子包括 一些非生物来源的化合物，如水杨酸和核黄素 等，某些金属离子如Ca2+、Mg2+也具有激发子的 功能。植物病原菌的激发子按其化学性质分类 主要有寡糖、糖蛋白和蛋白质等。 寡糖是最早发现且研究得最深入的能诱导 植物合成植保素的激发子,曾被认为是植物有 别于动物的特有的信号分子，包括几丁质及其 衍生物、葡聚糖、脂多糖等。从植物病原微生 物中已发现许多糖蛋白具有激发子活性,主要 包括疫霉糖蛋白、酵母糖肽、禾谷锈菌糖蛋白 等。多肽和蛋白质是动物体内重要的一类信号 分子,而在植物细胞信号系统中发现蛋白类信 号 分 子 则 是 近 几 年 的 事 情 。 1968 年 ,Cruickshank 和 Perrin 从 丛 梗 孢 菌 (Monilinia fructicolla)菌丝体中分离到一 种多肽(Mr约为8×103),能诱导菜豆内果皮形成 和积累菜豆素(phaseollin),这是第一个已报 道的真菌多肽类激发子。迄今为止,在植物病 原菌互作系统中已发现了许多蛋白和多肽类激 发子,其中包括疫霉属(Phytophthora)和腐霉 属(Pythium)真菌产生的激发素(elicicitins)、 细菌的harpins和鞭毛蛋白(flagellin)、植物 病毒的蛋白类激发子以及无毒基因产物无毒蛋 白等。 2(病菌激发子-受体识别机制 (1) 激发子受体 病菌激发子与植物细胞质膜上的受体结合 被认为是激活防卫信号传导的最初步骤，因此 受体基因的克隆倍受关注。已有一些不同类型 激发子的受体基因被克隆，并发现在许多植物 细胞膜上都存在有激发子特异性高亲和结合位 点，目前已分离了一些激发子特异性的结合蛋 白。大量的试验已表明激发子的受体大多位于 细胞表面的原生质膜上。Yoshikawa等(1993) 首先证明了大豆原生质膜上有激发子的受体。 他们用3,真菌昆布多糖(mycolaminarin，一种 β -1,3-葡聚糖激发子)来确定受体在大豆中的 位置，发现结合位点位于膜部分，特别是原生 质膜上更加丰富，这种结合可以被链蛋白酶预 处理所阻止。Cosio等(1996)用 125 ，标记来自 大雄疫霉大豆专化型的葡聚糖激发子也证实结合 位点位于原生质膜上，而且这种结合是可逆的、 可饱和的，结合能力与诱导大豆素(glyceolin) 积累能力呈正相关。随后所报道的激发子特异性 结合位点都被定位在原生质膜上,因此,迄今为止, 人们认为β -葡聚糖、几丁质寡糖、糖蛋白、蛋 白质和多肽等激发子均结合在植物细胞膜上。 (2)病原激发子-受体识别 激发子与受体识别是植物抗病防卫反应产 生的第一步。植物对病菌侵染的识别一般可用激 发子-受体模型(elicitor receptor model)来解释。 即植物病原菌产生的激发子作为配体(ligand)与 植物细胞表面的受体相互识别或通过第3种因子识 别配体，形成抗病信号，活化信号传导链，激活 各种防卫相关基因的表达，最终导致各种防卫反 应的活化和抗病性的表现。 Yamaguchi等(2000)认为单子叶和双子叶植 物对激发子的识别可能采用不同的机制。因为来 自稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)细胞壁的β -葡 聚糖能诱导水稻产生植保素，但不能激发菜豆产 生防卫反应。反之，来自疫霉(,.sojae)的β -葡 聚糖可诱导菜豆产生植保素，而对水稻则无激发 活性。表明不同植物种识别病原激发子的抗原决 定簇不同，这与人和动物识别病原菌一样，可能 由激发子(抗原)的结构和组成所决定。 研究表明植物病原激发子-受体识别可能 还需有其他因子的参与。Mithofer等(2000) 通过结合重组等方法发现在豆科植物细胞膜中 广泛存在的β -葡聚糖受体蛋白(Mr为7.5×104) 很可能不是生理受体，而仅仅是受体复合物中 的一个组成部分。Osman等研究也表明，激发 素隐地蛋白(Cryptogein)能与烟草细胞表面的 甾醇结合，并可诱导产生防卫反应，但若将隐 地蛋白中的一个关键氨基酸定点诱变使产生的 突变蛋白不能与甾醇结合，这种突变蛋白就不 能诱导烟草产生防卫反应，也不能与受体蛋白 结合，因此认为形成甾醇-激发素复合物 (sterol-elicitin complex) 是 激 发 素 与 受 体 蛋白结合和诱导产生防卫反应的前提条件。另 外，隐地蛋白的特异性结合位点在Acerpseudo platanus和拟南芥这两种植物中也存在，但却 不能被诱导产生抗病性，表明激活特异的抗病 性可能还需要有其他因子的参与。 (3)“保卫假说” 最近提出的“保卫假说”(guard hypothesis)可以较好地解释植物病原激发子受体互作产生防卫反应还需有其他因子的参与。 该假说认为，植物病原激发子通过与寄主植物 内的靶标――寄主蛋白的互作而发挥其功能， 从而获取营养或抑制寄主产生防卫反应。受体 可以识别和监控病原激发子及其在寄主植物体 内的致病性靶标，通过与后二者复合体相互作 用，“保卫”寄主蛋白，活化植物HR及其他 防卫反应， 从而“保卫”植物，使之免受病原微生物的侵 染。该假说强调植物受体蛋白并非直接与病原 激发子相结合，而是与激发子和寄主植物体内 靶标的复合体相互作用。据该假说，通常情况 下，激发子是作为毒性因子而起作用的。事实 上，这一点已经被证实，因为许多无毒因子 (激发子)在一些寄主植物中是致病或毒性因子。 综上所述，“保卫假说”可以认为是对20世纪 40年代提出的“基因对基因假说”在抗病性产 生机制方面的补充。 四、植物抗病反应的信号传导 植物中存在的抗病机制多种多样，如抗侵 染和抗扩展;预成抗性和诱导抗性;结构抗性 和生化抗性;过敏反应和系统获得抗性等等。 这些抗性机制从抗病相关物质的作用方式看不 外乎3种:形成障碍物以阻止病原菌的侵染和 扩展;形成具抑菌活性物质以杀死病原菌;形 成酶或化学物质解除病原的致病因子。现在的 问题是，这些物质是如何形成的,即形成这些 物质的基因是如何被触发启动的,生化反应过 程如何, 随着对植物抗病基因及抗病反应信号传导 链上其它组分的鉴定和分离，从抗病基因到防 卫反应基因的整个信号传导链的轮廓已逐渐清 晰明了。一般途径是:植物抗病基因编码的受 体接收来自病原菌的信号分子后，发生蛋白与 蛋白的相互作用，使一种激酶活化;通过调节 细胞内活性氧的浓度，使依赖于氧化还原反应 的转录因子激活;防卫反应基因表达，植物产 生抗病反应。抗病基因编码胞内和胞外两种类 型的受体蛋白，如N基因产物和Cf-9基因产物。 这些理论可以较好地解释过敏反应(HR)和系统 获得抗性(SAR)。过敏反应是病菌侵染点细胞 进入程序死亡 (programmed cell death)，它是 受植物中一类被称为Acd(acceleratedcelldeath)或Lsd(lesions stimulating disease resistance)基因调节的，是控制细 胞程序死亡的开关。在植物发生过敏反应以前， 有一短暂的氧化爆发(oxidative burst)，产 生活性氧中间产物H2O2、OH、O2-2，使细胞中活 性氧的浓度高出正常水平2,5倍。在过敏反应 的信号转导链上，活性氧和Acd或Lsd等负调控 蛋白共同介导了信号的传递。 在SAR的信号转导过程中，植物内源信号 分子水杨酸(SA)起了防卫信号传导的二级放大 作用，从而激活多种防卫基因。SA浓度在植株 体内呈梯度分布，它可沿韧皮部输导组织运输， 从而使整个植株SA含量达到足以诱导PR蛋白 基因表达的水平。对水杨酸如何诱导PR蛋白基 因表达的机制也有了一定的了解，其中烟草细 胞质中的可溶性蛋白—,水杨酸结合蛋白 (Sabp)可能起着重要作用。游离的Sabp具有过 氧化氢酶活性，当结合水杨酸后，其过氧化氢 酶活性受到抑制。正常情况下，由于过氧化氢 酶的作用，H2O2 在细胞中的浓度维持平衡。当 水杨酸浓度升高后，Sabp的过氧化氢酶活性受 到抑制，细胞中H2O2 浓度升高，激活依赖于氧 化还原的一类转录因子，如植物中类似于哺乳 动物NF-kB、AP-l的因子，以及植物防卫反应 基因的表达。因此植物是通过水杨酸调节细胞 中活性氧的浓度来形成系统获得性抗性的。 诱导抗性的诱导因子是很多的，如生物因 子中的病原菌、弱毒菌株、生防细菌以及它们的 代谢物等，非生物因子中的毒素、乙烯、茉莉酸 (JA)、过氧化物、脂多糖、真菌细胞壁成分等。 抗性的产生可能不依赖于SA。如在侵染早期，腐 生型菌胡萝卜欧文氏菌(Erwinia carotovora)通 过不依赖SA途径甚至与SA相拮抗的途径诱导一些 PR基因的表达。一种新的防卫素系列小肽PDF1.2，由JA、乙烯和过氧化物诱导产生，在用芸 苔链格孢菌(Alternaria brassicicola)接种后 也 系 统 性 积 累 ， 而 且 在 类 枯 斑 acd2 和 cpr5(constitutive expressor of PR gene ， cpr)中PDF-1.2的mRNA水平提高。 研究表明，依赖于SA和不依赖于SA的诱导抗性 信号传导途径不同，但可能存在交叉，比如JA 诱导苯丙氨酸解氨酶和苯基苯乙烯酮合成酶基 因表达，芸苔链格孢菌同时诱导依赖于SA和JA 的抗病反应。另外也发现甲基JA和SA以气体信 号的形式诱导植物的抗病信号传导。 五、 抗毒素基因工程 利用病原菌毒素降解酶基因可能是 一条抗病性改良的有效途经，尤其是 “缺乏抗病基因”的非专化性抗性改良。 第一个例子是玉米抗HC-毒素基因Hm1(见 上文)。这个基因的克隆不仅对玉米圆斑 病的防治具有重大意义，而且对植物抗 病基因研究，尤其抗毒素研究具有重大 意义。如研究发现，在小麦、大麦、燕 麦等单子叶植物中也有HCTR活性，这表 明该酶可能在种的专化性上起作用。 第二个例子是烟毒素脱毒基因的克隆与转 化。烟草野火病菌丁香假单胞菌产生一种致病 毒素烟毒素(tabtoxin)，属非专化性，在植物 体内该毒素将被转换成β -烟毒素内酰胺 (tabtoxinineβ -lactam)，它抑制了谷氨酰胺 的合成。从丁香假单胞菌中克隆了烟毒素脱毒 基因，这个基因编码乙酰转移酶，命名为 ttr ， 全长700 bp。转基因烟草不仅完全抗毒素，而 且高抗野火病。 第三个例子是毒素镰刀菌酸降解酶基因。 镰刀菌产生的毒素-镰刀菌酸也是一种非寄主 专化性毒素。它能引起棉花等作物系统萎蔫， 抗该毒素的马铃薯细胞成长的植株对镰刀菌也 有很高的抗性。利用分解镰刀菌酸细菌能有效 地阻止病菌侵染或扩展。所以该毒素是一个关键 的致病因子。目前，降解镰刀菌酸的细菌酶基因 已经通过基因组DNA的方法而得到克隆并获得了 转基因植株。这个基因是一个多顺反子，由一个 操纵子控制，需要改造才能在植物中正确表达。 第四个例子是毒素草酸降解酶基因。很多真 菌，包括核盘菌，产生毒素草酸，它是病菌致病 的重要因子。大麦和小麦的萌发素蛋白具有草酸 氧化酶活性，因而从大麦和小麦根cDNA文库中分 离出该酶的基因，该基因约700 bp，已被转入油 菜、大豆等作物中。但未见抗性有显著提高的报 道。原因可能主要是其草酸分解活性不高。 另一个例子是决定寄主范围的毒素基因。 除 Avena lobgiglumis 外，燕麦在根上皮细胞 中产生糖基化的三类萜皂角苷(glycosylated triterpenoid saponin)，命名为avenacinA-1。 因为有该物质，燕麦对禾谷类全蚀病的小麦和 燕麦分离物都表现抗性。但有一个燕麦分离物 产生一种酶avenacinase，能降解这个皂角苷 (脱糖基)而能侵染燕麦。可是，当该酶基因被 打破时，病菌即失去侵染能力。这是在种水平 上的毒性基因，且为毒素合成基因。毒性基因 的破坏即改变了其寄主范围。同样的情况在马 铃薯中也存在。这是基因工程的一个新策略。 第四章 植物与病原 菌之间的 生理生态关系 第一节 致病毒素和植物抗毒素 第二节 病原菌侵染植物的过程及对寄主植物 的影响 第三节 植物与病原菌互作和抗病性的分子机 制 ?思考题: ? 1、植物与病原菌互作和抗 病性的分子机制及研究展望, ? 2、植物抗病反应的信号传 导与生产中应用,