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EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达研究(可编辑).doc

EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF…

王静美
2017-12-07 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIF-1α在人毛囊和毛乳头细胞中的表达研究(可编辑)doc》,可适用于初中教育领域

EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIFα在人毛囊和毛乳头细胞中的表达研究(可编辑)EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIFα在人毛囊和毛乳头细胞中的表达研究南京医科大学硕士学位论文EGCG对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及HIFα在人毛囊和毛乳头细胞中的表达的研究姓名:李梅云申请学位级别:硕士专业:皮肤病性病学指导教师:范卫新南京医科大学硕士学位论文缩略语毛乳头细胞一,一二甲基噻唑一一,一二苯基四氮唑溴盐二甲基亚砜’培养基’胎牛血清成纤维细胞生长因子血管内皮细胞生长因子磷酸甘油醛脱氢酶细胞增殖指数缺氧诱导因子千道尔顿焦碳酸二乙酯磷酸缓冲液溴化乙啶辣根过氧化物酶南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文垦堡鳗墅签丛生羞丝厶垂塞查垂塾羞鱼丝丝丝堂堑丝丝受煎盈旦堡垡蕉厶垂塞叠垂塾羞鱼丝主丝盔垄丝盈霾是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业:趣蝤滥堂作者签名:趁墨日期:趟:旦查:艺论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。期:皇夕孑扣作者签名:丕盛叁导师签名:南京医科大学硕士学位论文对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响及仅在人毛囊和毛乳头细胞中的表达的研究中文摘要毛囊是哺乳动物特有的一种结构复杂的皮肤附属器官,是一个富含干细胞,由神经外胚层和中胚层交互作用形成的系统。一生不断经历生长期、退行期和休止期的周期性循环毛乳头对诱导和维持毛囊的周期性循环必不可少,其大小决定了毛囊的大小和生长期的长短。毛乳头细胞具有确定和维持毛母质细胞增殖分化的作用,而毛球部毛母质细胞的增殖分化是毛囊周期性生长调控的关键。与其他组织器官的再生一样,上皮细胞与相应间质细胞间的相互作用在毛囊的周期性生长调控中具有重要意义。绿茶是一种全世界受到广泛欢迎的饮料,是绿茶茶多酚的主要活性成分之一,具有广泛的生物学活性,已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗肿瘤及对紫外线辐射的光保护等作用【但对毛发生长及毛乳头细胞增殖的影响国内还未见报道。低氧诱导因子一,是年由在细胞株中发现的一种结合蛋白,可调控多种基因的表达。其中是专一调节的亚单位,决定了的活性,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列低氧适应反应。现已证实有调节红细胞生成、铁代谢、血管形成和葡萄糖代谢等多种作用,同时随着对研究的进展,发现其与南京医科大学硕士学位论文细胞生长的各种应答机制有密切的关系【】。由于毛囊生长的关键部位毛球部深埋于真皮深层,皮肤表面的局部用药很难渗透到毛球部,而成纤维细胞紧邻表皮下方,并包裹在毛囊周围。我们研究小组前面的研究中已经做到将目的基因通过脂质体直接导入成纤维细胞,导入后在毛囊周围的成纤维细胞表达弄口分泌某些关键因子,如等,从而发挥促毛发生长的作用,达到治疗毛发疾病的目的。作为该课题的一部分,本实验证明了在毛囊和培养的毛乳头细胞中的表达,进一步为研究促进毛发生长的机理提供了理论依据。本课题的研究主要包括以下两部分:一对体外培养的人毛囊和毛乳头细胞生物学活性的影响显微分离人毛囊,在加入不同质量浓度~的培养基中培养,观察毛囊生长情况利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,加入不同质量浓度的~,后,利用噻唑蓝法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果显示与空白对照组比较,,的对体外培养的毛囊生长有明显促进作用显,,的能够明显促进毛乳头细胞的增殖流式细胞仪检测,,扣。的作用骺,期和期细胞比率明显增加,期细胞比率明显减少,细胞增殖指数明显增加由增至,,,,细胞增殖指数与浓度呈显著正相关因此,我们得出结论一定浓南京医科大学硕士学位论文度的能够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖。二雄人毛囊和毛乳头细胞中的表达【分离完整的人生长期毛囊,提取总鼢治,法检测的表达。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,取第三代毛乳头细胞,分为正常培养组和州氯化钴处理组。提取总,法检测的表达提取细胞总蛋白,用法检测人毛乳头细胞中肼【蛋白的表达用免疫荧光法进一步检测人毛乳头细胞中肼【蛋白的表达并定位。湿示人毛囊及。分离培养人毛乳头细胞均表达唧显示州氯化钴处理的人毛乳头细胞表达蛋白,正常培养组未能检测到蛋白。免疫荧光显示州氯化钴处理的人毛乳头细胞胞浆、【蛋白。胞核中均有蛋白的表达,正常培养组未能检测到因此我们可以得出结论人毛囊和毛乳头细胞均可表达缺氧诱导因子,但常氧下蛋白迅速降解,故免疫荧光、佥测不到氯化钴可模拟缺氧环境,加氯化钴处理的人毛乳头细胞免疫荧光、均检测到。【的表达。南京医科大学硕士学位论文,,,,,,,,,,,一一,南京医科大学硕士学位论文,,一,,,,,,,,,,,南京医科大学硕士学位论文::肛,舭,,:南京医科大学硕士学位论文,“胎出:,一【,南京医科大学硕士学位论文前言毛囊是一种结构复杂的皮肤附属器官,由属于上皮成分的外毛根鞘、内毛根鞘、毛母质和属于真皮成分的真皮鞘、毛乳头组成,另外还包括皮脂腺和立毛肌。毛囊最为显著的生物学特征是周期性生长在哺乳动物的整个生命过程中,毛囊反复经历着生长期、退行期衣休止期的循环。在每一周期性循环中,间叶成分的毛乳头产生诱导信号,诱导上皮成分的增殖、分化和迁移,继而发育成为成熟的毛囊,开始周期性循环。因此,毛囊具有完全的自我再生鸯歹】。毛乳头不仅已经被证明在毛囊的正常生长发育、毛发生长及周期性调控中起着重要的作用,还有文献证明对一些病理情况,比如雄激素性脱发的发病也起着至关重要的作用。因此研究生物活性单体对雩头细胞生物学的影响一直是毛发研究领域的一个重要方向。是绿茶提取物,为荼多酚中的一种主要活性单体,具有清除氧自由基抗氧化、抗肿瘤和防止紫外线损伤等作用研究发现,对多种肿瘤细胞增殖表现不同程度的抑制作用,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡,诱导肿瘤细胞周期阻滞,对细胞信号传导通路的影响等有关。也有报道显示对正常的表皮角质形成细胞有促进生长的作用,并且通过两重机制抑制紫外线诱导的凋亡,分别是通过和通路磷酸化蛋白,通过上调争的比率目前有报道显示通过选择性的抑制还原酶,可能对治疗雄激素性脱发有作用【】,最近又有文献显示对毛发生长有促进作用。本实验通过建立体外的人毛囊培养模型,观察不同浓度南京医科大学硕士学位论文对毛囊生长的影响,并检测了不同浓度对培养的人毛乳头细胞增殖及细胞周期的影响。低氧诱导因子是年由在细胞株中发现的一种结合蛋白,可调控多种基因的表达。其中是专一调节的亚单位,决定了的活性,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列低氧适应反应。现已证实有调节红细胞生成、铁代谢、血管形成和葡萄糖代谢等多种作用,同时随着对研究的进展,发现其与细胞生长的各种应答机制有密切的关系。毛囊生长的关键部位毛球部深埋于真皮深层,皮肤表面的局部用药很难渗透到毛球部,而成纤维细胞紧邻表皮下方,并包裹在毛囊周围。我们课题组前面的研究中已经做到将目的基因通过脂质体直接导入成纤维细胞,导入后在毛囊周围的成纤维细胞表达和分泌某些关键因子,如和等,从而发挥促毛发生长的作用,达到治疗毛发疾病的目的。作为该课题的一部分,本实验证明了在毛囊和培养的毛乳头细胞中的表达,进一步为研究促进毛发生长的机理提供了理论依据。南京医科大学硕士学位论文第一篇弗一桶对体外培养的人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的影响摘要目的研究表没食予儿茶耔殳食孑落西缸,对体外培养的囊生长和毛乳头细胞增殖的影响。方法显微分离人毛囊,加入不同浓的,观察毛囊生长情况利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,加入不同浓度的“,惦,利用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果浓度为、的对体外培养的毛囊生长有明显促进作用显示、、舭的能够明显促进毛乳头细胞的增殖流式细胞仪检测、、和舭的作用诟,期和期细胞比率明显增加,期细胞比率明显减少,细胞增殖指数明显增加由增至,,,,细胞增殖指数与浓度呈显著相关结论一定浓度一匕够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖。关键词人毛囊人毛乳头细胞细胞增殖细胞周期南京医科大学硕士学位论文:一一:,,,,,,,,,,,:,,,,,,南京医科大学硕士学位论文,,,:南京医科大学硕士学位论文是绿茶提取物茶多酚中的一种主要活性单体,具有广泛的生物学活性,已有大量研究表明其具有抗肿瘤及对紫外线辐射的光保护等作用。但对毛发生长及毛乳头细胞增殖的影响国内还未见报道。本实验主要研究对体外培养的人毛乳头细胞生长的影响,并初步探讨其可能机制。端精标本整形外科手术中获得的枕部头皮,年龄一岁,离体小时以内。主要试剂和材料培养基,,货号,美国,美国,谷氨酰胺、分离酶、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑兰、二甲基亚砜均购自,胶原酶,美国,,美国,胎牛血清杭州四季青生物材料有限公司,碘化丙嚏,公司,美国,一次性细胞培养瓶、孔培养板、孔培养板及孔培养板公司。主要仪器解剖显微镜南京江南光电集团股份有限公司,细胞培养箱美国公司,酶标仪,美国,流式细胞仪,美国,倒置相差显微镜,日本方法主要试剂的配制:称取、、和肿‘南京医科大学硕士学位论文,加三蒸水使之完全溶解,定容至,调整值至左右,分装后高压灭菌。谷酰胺:称取谷酰胺溶解于三蒸水中,滤器滤过灭菌,分装后置。保存备用。条件培养基:每培养基中加谷酰胺、青霉素,和链霉素,肛,使其中舍谷酰胺、青霉素和“链霉素。条件培养基:每培养基中加胎牛血清、青霉素,和链霉素,,使其中含胎牛血清、青霉素和链霉素。条件培养基:每培养基中加胎牛血清、青霉素,和链霉素,,使其中合胎牛血清、青霉素和肛链霉素。使之完全溶解,分离酶:称取分离酶,加调整值至,定容至,滤器滤过灭菌,分装后置保存备用。胶原酶:称取胶原酶,加条件培养基,完全溶解后,调整值至,定容至,滤器滤过灭菌,分装后置一。保存备用溶液储备液:称取和培养基,避光,~加。撞差叁参快速振荡溶解后,过滤除菌,分装后置保存备用。南京医科大学硕士学位论文人毛囊的分离人毛囊的分离方法参见文献【】,将标本反复用自来水冲洗干净后,用碘伏浸泡分钟、酒精分钟、无菌,值,含青霉素、链霉素清洗遍后,立即置于培养基中。用手术刀将上述头皮按毛囊生长方向切成约宽的皮条,周眼科剪刀从真表皮处剪开,在光学显微镜下用无齿镊夹住毛囊远端沿其生长方向小心从皮下组织中拔出,注意不要伤及毛乳头和真皮鞘等组织,并小心去净毛囊周围脂肪组织,在毛囊上三分之一处切开,将上段弃去,下段毛囊置于培养基。毛囊的体外培科显微镜下选择完整的生长期毛囊,通过目镜测微器测量长度后,移入孔板中,每孔根,分别加入浓度为、、、、、、、、和培养基舍的一谷胺酰氨,青霉素、链霉素,每个浓度个孔,置于。孵箱中培养每三天换液一次,培养第天再次测量毛囊长度,并记录。毛乳头细胞的培养人毛乳头细胞采用两步酶消化分离法,具体参见文献【标本处理:将标本反复用自来水冲洗,用手动剃须刀剃净毛发,碘伏浸泡、酒精浸泡后用无菌,值,含青霉素、链霉素清洗遍。将皮下组织面向上,去除皮下筋膜。随后将头皮剪成长~、宽~南京医科大学硕士学位论文的皮块,从真皮和皮下组织交界处分离,获得皮下组织部分。分离酶消化:上步获得的皮下组织用液冲洗后,分离酶消化。胶原酶消化:消化后的皮下组织用液冲洗,用眼科弯头镊从真皮面轻轻挤出毛干,再次用液冲洗遍后剪成泥糊状,加胶原争消化。在镜下观察到脂肪呈液态、大量的毛乳头游离出来,即可终止消化。混合转移塑料离心管,加纯化毛乳头:终入等量液,充分混匀,离,弃上清沉淀物加入适量夜,充分混匀,离心,如此重复约遍。最后沉淀物转移至平皿中,加入适量液,用眼科镊反复牵拉沉淀成分,并转移至另外的平皿中,如此反复~遍,最终弃去纤维成分和毛干,收集平皿中的液体,用目滤网过滤去除液体中单个细胞成分,保留毛乳头。毛乳头接种:分离得到纯化的人毛乳头细胞加培养基值,含,青霉素、链霉素,胎牛血清,混匀,以每培养瓶一个毛乳头的密度接种。待毛乳头贴壁后换液,去除未贴壁的单个细胞及杂质。分离出的毛乳头,天后贴壁,贴壁天后可观察到细胞迁出呈放射状生长,周后细胞大部分生长融合。可见到典型的毛乳头细胞凝集性生长的特性,传代后其凝集性生长的特性渐不典型,细胞呈多极性排列图。南京医科大学硕:学位论文图毛乳头细胞×为毛乳头刚贴壁为毛乳头贴壁后天细胞开始迁出呈放射状生长为贴壁周后毛乳头细胞绝大部分融合,呈现凝集性生长,边缘呈放射状为传代后细胞绝大部分融合时凝集性生长不明显,细胞呈多极性排列。法检测细胞增殖原理:实验是一种检测细胞存活和增殖生长的方法。实验所用的显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的染料,化学名一,一二甲基噻唑一一,一二苯基四氮唑溴盐,商品名噻唑蓝,简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性还原为难溶性蓝紫色结晶物,并沉积在细胞内和细胞周围,而死亡细胞无此功能。在一定细胞数范围内,形成的结晶与增殖的细胞数成正比,可简便快速地反映活细胞数。能溶解细胞中蓝紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在波长处测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。南京医科大学硕士学位论文操作方法:取对数生长期的第代人毛乳头细胞,胰蛋白酶消化后,以的密度接种于孔板中,每孔,待细胞、贴壁后吸去培养基,加入浓度为、、、、、、、和,含胎牛血清的培养基,每个浓度个复孔,每孔,空白对照只加胎牛血清的培养基。继续培养小时后,每孔加入的止,置于孵箱中,培养小时,然后吸去培养基,每孔加入“,充分振荡培养板,酶标仪于波长处测定每孔的吸光度值~。实验重复次流式细胞仪检测细胞周期取第代的毛乳头细胞,以的密度接种于培养瓶中,待细胞长至一融合时,加浓度分别为、、、:和,舍胎牛血清的培养基,每个浓度瓶细胞,继续培养小时。采用胰蛋白酶消化各组细胞,洗涤次,离心收集细胞,以的冷乙醇固定过夜。洗涤细胞次,各管中分别加入“含舭的碘化丙啶,振荡成单细胞悬液,避光室温静置,目滤网过滤,流式细胞仪检测细胞周期。计算细胞增殖指数,,。吣】×统计学方法实验数据以统计软件进行统计学处理,采用单因素方差分析,当时认为差异有统计学意义。南京医科大学硕士学位论文结果对人毛囊生长的影响与对照组相比,和吲浓度的对毛囊生长有明显的促进作用,但当其浓度大于一时对毛囊生长表现为抑制作用,其余浓度组与对照组相比无统计学差异。表:对体外培养的人毛囊生长的影响注:与未加组相比,’《对人毛乳头细胞增殖的影响处于对数生长期的第代毛乳头细胞加入不同浓度的培养后,普通光学显微镜下观察细胞形态,浓度大于“的实验组细胞数量较少,部分漂浮,形态欠佳。余加药组细胞形态未见明显差异。结果显示培养浓度为,,‖的三组有明显促进毛乳头细胞增殖的作用南京医科大学硕二学位论文浓度为,对毛乳头细胞有毒性作用图。壬壬壬壬士士壬壬童壬×一壬疑颦型《玑玑玑】玑巾如扣曲与对照组相比木图:不同浓度对人毛乳头细胞增殖的影响对人毛乳头细胞细胞周期的影响对人毛乳头细胞细胞周期影响的流式细胞仪结果如图所示。处理组与正常对照组相比细胞周期有明显差异,且呈剂量相关性。随着浓度的增大,期细胞比率逐渐增高期细胞比率先是增高,但是当浓度达到‖时,期细胞比率较前一浓度又有下降期细胞比率逐渐降低。细胞增殖指数随着浓度的加大逐渐增高,经相关分析,两者呈正相关,。对毛乳头细胞的凋亡率没有明显的影响。见表南京医科人学硕学位论文名嚣一弋《》。浓度::::::图不同浓度处理后毛乳头细胞的流式细胞图表:不同浓度处理毛乳头细胞后对细胞周期的影响讨论是茶多酚的主要活性成分之一,具有清除氧自由基抗氧化、抗肿瘤和防止紫外线损伤等作用。研究发现,对多种肿瘤细胞增殖表现不同程度的抑制作用,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡,诱导肿瘤细胞周期阻滞,对细胞信号传导通路的影响等有关【。也有报道显示对正常的表皮角质形成细胞有促增殖作用【】。但对毛发生长及毛乳头细胞增殖的研究国内未见报道。南京医科大学硕士学位论文毛乳头是毛囊的主要间充质成分,位于毛囊基底部,被毛母质细胞包绕,其显著的生物学特性为体内外表现为凝集性的生长方式及体内外具有诱导毛囊形成的能力。毛乳头细胞能够产生和分泌多种生长因子和细胞外基质成分,这些生长因子和信号分子作用于毛母质细胞,诱导增殖和分化。因此,毛乳头细胞具有决定和维持毛母质细胞增殖分化的作用,而毛球部的毛母质细胞增殖分化是毛囊周期性生长调控的关键【】我们用作用于体外培养的人毛囊,观察到浓度为时,对毛囊生长有明显的促进作用当浓度大于时,对毛囊生长表现为抑制作用。本实验还发现浓度为的对体外培养的人毛乳头细胞有明显的促增殖作用当浓度大于时,对细胞具有毒性作用实验中观察到,体外培养的毛囊当浓度:舭时,毛囊表面会覆盖一层棕色的不透明物质,浓度越高颜色越深,可能是氧化的产物。而在培养的细胞中没有见到类似物质,只表现为高浓度的溶液颜色变深。我们推测本实验中毛囊与毛乳头细胞的最佳生长浓度不一样与此有关。为了探讨促细胞增殖的可能作用机制,本实验应用流式细胞仪检测了其对细胞口成和细胞周期的影响。从细胞周期的代谢过程看,细胞周期包括期眦成前期、期口成期、期成后期和期有丝分裂期为增殖指数,反映了该细胞群体中增殖期细胞的数量,在一定程南京医科大学硕士学位论文度上可反映细胞的增殖状态本实验结果显示浓度为、、和毗的各实验组细胞增殖指数均较空白对照组高,期比率均较空白对照组低,且呈剂量依赖性。其可能作用机制是促使静止态的期细胞活跃而向期转变,使合成量增加,从而促进细胞的增殖。各组的凋亡率未见明显差异,表明其促增殖作用与抑制细胞凋亡无关。因此,我们的研究发现能够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖,其机制仍有待进一步的研究。南京医科大学硕士学位论文,,一蟹’弟一扁在人毛囊及体外培养的人毛乳头细胞中的表达摘要目的:探讨在人毛囊及体外培养的人毛乳头细胞中的表达。方法:分离完整的人生长期毛囊,提取总,法检测的表达。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,取生长融合至的第三代毛乳头细胞,分为正常无血清培养组和氯化钴处理组,继续培养。提取总,法检测法检测人毛的表达提取细胞总蛋白,用乳头细胞中蛋白的表达用免疫荧光法进一步检测人毛乳头细胞中蛋白的表达并定位。结果:显示人毛囊及分离。培养人毛乳头细胞均表达显示氯化钴处理的人毛乳头细胞表达蛋白,正常无血清培养组未能检测到蛋白。免疫荧光显示氯化钴处理的人毛乳头细胞胞浆、胞核中均有蛋白的表达,正常无血清培养组未能检测到。【蛋白。结论:人毛裘和毛乳头细胞均可表达缺氧诱导因检测子,但常氧下蛋白迅速降解,故免疫荧光、不到。氯化钴可模拟缺氧环境,加氯化钴处理的人毛乳头细胞免疫荧光、均检测到的表达。关键词。【毛囊毛乳头细胞南京医科大学硕士学位论文:::、析:山,,南京医科大学硕士学位论文是年由【至细胞株中发现的一种乡合蛋白,可调控多种基因的表达。其中肼【是专一调节的一亚单位,决定了的活性,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列低氧适应反应。现已证实肼有调节红细胞生成、铁代谢、血管形成和葡萄糖代谢等多种作用,同时随着对石:究的进展,发现其与细胞生长的各种应答机制有密切的关。本课题组在前面的研究中已经成功地将外源性的真核表达载体。穗定转染成纤维细胞。并通的方法证实、在转染的表达,检测证实细胞上清液的表达,且显示转染上清可增强成纤维细胞及毛囊真皮鞘细胞的活性。作为该课题的一部分,本实验进一步探讨在人毛囊及体外培养的人毛乳头细胞中的表达。材料标本整形外科手术中获得的枕部头皮,年龄一岁,离体小时以内。主要试剂,美国,,大连,琼脂糖公司,公司,蛋白提取试剂盒公司,蛋白浓度测定试剂盒碧云天公司,蛋白上样缓冲液碧云天公司,预染蛋白北京纽英伦公司,发光蛋白公司,羊血清封闭液博士德,武汉,鼠抗人单南京医科大学硕士学位论文克隆抗体公司,美国,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗公司,丹麦,标记的抗生物素,,,标记的抗小鼠,,发光试剂盒公司。谷氨酰胺、分离酶、胰蛋培白酶、均购自美国。胶原酶、胎牛血清和养基均购自美国。,美国。主要实验仪器:仪,装置,冰冻离心机日本,倒置相差显微镜,日本,荧光显微镜,日本方法主要试剂的配制水:取加去离子水,搅拌过夜,使之完全溶解,高压灭菌后即为去酶水。乙醇:取无水乙醇,加去酶水,充分混匀,保存备用。氯化钴溶液储备液:称取氯化钴,加入溶液,溶解后过滤除茵,分装。保存备用。培养基中,加入“氯化钴溶液:每皿氯化钴溶液储备液,则氯化钴终浓度为。人毛囊的分离人毛囊分离参见文献【】,具体步骤同第一篇,选择生长期的毛囊用于实验毛乳头细胞的分离、培养人毛乳头细胞采用两步酶消化分离法,南京医科大学硕士学位论文参见文献【】,具体步骤同第一篇。分离得到纯化的人毛乳头细胞加含胎牛血清的培养基混匀后,以每培养瓶~个毛乳头的密度接种。待毛乳头贴壁后换液,去除未贴壁的单个细胞及杂质。分离出的毛乳头,天后贴壁,贴壁天后可观察到细胞迁出呈放射状生长,周后细胞大部分生长融合。第代毛乳头细胞,胎牛血清的培养基培养至细胞生长融合至一。分为正常无血清培养组和出氯化钴处理组培养基中氯化钴浓度为,继续培养小时后分别用于实验。毛囊总提取以液:稀释搅拌过夜浸泡所需器械及耗材,高温消毒取根新鲜分离的毛囊,加入,匀浆器内反。静置分钟,使核复研磨约分钟,直至毛囊充分裂解,蛋白复合物完全分离提取物中加氯仿,封住样本,剧烈摇动每秒钟,。静置分钟,离心转分钟分钟,离心后,混合物分为红色、苯酚氯仿底层,中间层和无色水相层将离心后上清无色部分转移至新管中,约加入等量异丙醇,静置分钟。离心转分钟分钟弃去上清,用预冷乙醇用高温消毒水配制洗涤,混匀,离心转份钟分钟南京医科大学硕士学位论文弃去上清,室温下自然风干分钟内,加适当水溶解,一保存紫外分光光度计测吸光度毛乳头细胞总提取取对数生长期的第代人毛乳头细胞,冰冷的洗涤细胞次,每个平皿中加入,混匀,室温静置后反复吹打,使细胞完全裂解后收集液体至管内,余步骤同。采用两步法,参照按照试剂盒说明进行。反转录反应:将提取的逆转录成反转录体系:各此止“毛囊总此止反转录条件:,,,。合成的置备用。扩增:南京医科大学硕士学位论文引物:体系:此灭菌蒸馏水此此人【或上游和下游引物各条件:预变性如变性々退火铂臂环延伸“讲剐终末延伸电泳:取扩增产物,行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像扫描系统记录结果产物测序:【的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司取止一南京医科大学硕士学位论文进行产物测序。免疫荧光盖玻片和载玻片处理:取盖玻片和载玻片,加去污剂清洗、晾干后,依次泡酸过夜、流水冲洗、去离子水冲洗、晾干,最后浸泡于无水乙醇内备用。临用时,取出盖玻片和载玻片,去离子水清洗次,电吹风吹干,置于放有锡箔纸的平皿内,高压灭菌后放入。烤箱内去除多余的水分。细胞爬片:取对数生长期的第代人毛乳头细胞,用胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液,按×个的密度接种至预置盖玻片的孔培养板中每孔培养基,此培养基不合青霉素和链霉素,置、细胞培养箱培养。待细胞重新贴壁,生长融合达后,分为正常无血清培养组和氯化钴处理组,继续培养。取出孔培养板内的盖玻片,用于下述免疫荧光检测。细胞免疫荧光检测依次按如下步骤操作:用冲洗次、。丙酮室温固定洗次,每次分钟滴加羊血清封闭液封闭非特异性抗原,。分钟甩去多余液体,滤纸吸干,不洗。实验组滴加适当稀释的一抗:稀释的【的小鼠单南京医科大学硕士学位论文克隆抗体,以代替一抗作为阴性对照。。,次。洗分钟滴加标记的抗小鼠二抗,:稀释,。分钟。洗分钟×次。荧光显微镜下观察,拍照胞浆、胞核均可见红色荧光,阴性对照仅见少量较暗的非特异性荧光。毛乳头细胞总蛋白的提取按试剂盒说明操作配制工作液:磷酸酶抑制剂:取、双蒸水和磷酸酶抑制剂,混匀完全裂解缓冲液:取止、裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂止,混匀。收集细胞吸弃培养基,冰冷的磷酸酶抑制剂洗涤,吸弃后重新加入麟酸酶抑制剂。细胞刮轻轻刮下细胞,移至预冷的离心管中离心×。丢弃上清,沉淀置于冰上细胞裂解沉淀中加入完全裂解缓冲液,反复吹打使沉淀再悬浮。高南京医科大学硕士学位论文速涡旋。置于的摇床上,冰上,。高速涡旋,离心×,。上清全细胞抽提物转移至预冷的管中。分装,冻于一冰箱,避免反复冻融。相关溶液的配制:称取嘶,加入去离子水中,搅拌,溶解后调值至用浓盐酸,定容至。,加入去离子嘶:称取水中,搅拌,溶解后调值至用浓盐酸,定容至。储备胶溶液:称取和,加入去离子水中,溶解过夜,普通滤纸过滤,避光。保存。,电泳缓冲液:称取,甘氨酸和加入去离子水中,搅拌均匀,调值至,加去离子水定容至。×电泳缓冲液:量取×电泳缓冲液,加入去离子水,搅拌均匀,分装保存。,加入转移缓冲液:称取,甘氨酸和去离子水中,搅拌均匀,加去离子水定容至×转移缓冲液:量取转移缓冲液和甲醇,加去离子水定容至,分装保存溶液:取一包粉北京中山公司南京医科大学硕士学位论文加入去离子水中,搅拌均匀,加入,定容至:称取过硫酸铵溶干蒸馏水中,避光保存,周内用完。封闭液:称取封闭牛血清白蛋白干粉,加入至,搅拌溶解,使之终浓度为,保存,周内用完抗体稀释液:同封闭液。蛋白浓度检测:按照试刹盒说明进行,方法如下:配制工作液试剂:试剂:标准品配制蛋白标准品工作液:以将:稀释在孔板内依次加入蛋白标准品、、、、、、、,以补足至提取的毛乳头细胞总蛋白止,以补足至各孔加工作液“,孵育测定值,根据标准曲线计算蛋白浓度。胶制备玻璃板的清洗:用无水酒精擦拭已用去污剂洗涤干净并且风干的玻璃板,然后风干分离胶制备南京医科大学硕士学位论文依次加入上述液体,尽量减少气泡的产生,轻轻混匀,向两个玻璃板之间加入约的分离胶再加入约去离子水至玻璃板之间,水封胶。再次出现分界线后约分钟,滤纸吸干去离子水浓缩胶的制备每块胶板各加入约浓缩胶,轻轻梳子约后,小心拔出梳子,注意垂直向上,用力均匀,以保证胶槽不至扭曲,将玻璃板放入电泳装置上,倒入×电泳缓冲液,以微量加样针轻轻冲洗胶槽南京医科大学硕士学位论文上样每胶槽加入“样本蛋白,根据蛋白浓度计算样本的体积。蛋白样本和样缓冲液按:混合均匀,煮沸分钟,离心。微量加样针进行加样,没有样本的加样槽加入上样缓冲液电泳将电泳装置电泳槽中,加入电泳液。。冷房,恒流块胶,电泳左右转膜凝胶和膜切角标记,一块是左上角切去少许,两块左上角和左下角切去少许,上大下小凝胶和膜缺角对缺角。膜大小和凝胶相符,甲醇中浸泡秒钟,去离子水中浸泡分钟。凝胶和膜转移液中浸泡大于分钟。层,转移液中浸泡分钟。滤纸大小和凝胶相符,夹心制备:打开夹板,黑色朝下,依次放上垫片,层滤纸、凝胶、膜、层滤纸、垫片,赶净气泡后,白色夹板压下,夹上开关。‘将夹心放入电泳槽中,黑色对黑色放置。转膜电泳:恒压,冰浴,冷房,时间左右。转膜后膜处理。封闭液浸没整张膜,一封闭一用次洗涤膜,分钟用抗体稀释液稀释相应一抗:稀释的【的小鼠单克隆抗体“,过夜

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