ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响 ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响-医学论文作用影响细胞表达蛋白ERCC1
【摘要】 目的 建立表达核苷酸切除修复交叉互补集团1蛋白细胞系，评价ERCC1表达对草酸铂细胞毒作用的影响。方法 由人肠癌肿瘤组织提取RNA,合成cDNA，扩增ERCC1基因片段，Gateway定向克隆技术转染UV20细胞后，细胞抑制率测定评价草酸铂的...
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响 ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响
ERCC1蛋白表达及对草酸铂细胞毒作用影响-医学论文作用影响细胞表达蛋白ERCC1
【摘要】 目的 建立表达核苷酸切除修复交叉互补集团1蛋白细胞系，评价ERCC1表达对草酸铂细胞毒作用的影响。方法 由人肠癌肿瘤组织提取RNA,合成cDNA，扩增ERCC1基因片段，Gateway定向克隆技术转染UV20细胞后，细胞抑制率测定评价草酸铂的细胞毒作用。结果 获得转染成功的UV20-ERCC1细胞，Western blot证实ERCC1的表达，细胞抑制率测定分析表明，ERCC1表达水平增加与草酸铂敏感性降低密切相关。结论 Gateway可成功构建包含ERCC1基因的表达载体，转染细胞后，提供体外研究ERCC1基因功能平台。草酸铂细胞毒作用与ERCC1基因表达水平具有一定关联。 【关键词】 肿瘤耐药性 近年来，新一代铂类抗肿瘤药物草酸铂已被有效地应用于进展期大肠癌、肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的辅助化疗中。然而肿瘤患者个体对草酸铂的敏感性却迥然不同，耐药者与敏感者相比，生存期减少几倍甚至十几倍以上〔1〕。核苷酸切除修复交叉互补集团1基因是DNA损伤修复途径中的重要基因。ERCC1在肿瘤组织的表达水平与草酸铂耐药性密切相关。近年来，随着药物遗传学的深入研究，评价ERCC1基因表达及其单核苷酸多态性与铂类抗肿瘤药物耐药的关联，己逐渐受到关注〔2〕。本研究通过Gateway定向克隆技术建立表达ERCC1蛋白的细胞系，提供体外研究ERCC1基因功能平台，通过细胞抑制率测定分析，从草酸铂对细胞克隆群体的抑制水平评价草酸铂的细胞毒作用。 1 材料与方法 1 1 细胞系 中国仓鼠卵巢细胞系:AA8;UV20。用含青霉素钾10万U/L，硫酸链霉素0 1g/L，5,胎牛血清培养基，在37?，5,CO2细胞培养箱中培养备用。 1 2 载体、试剂盒及主要试剂 pDONR201质粒:pIRES-GFP质粒。Gateway定向克隆试剂盒;Jet Pel Easy转染试剂盒;草酸铂;g418、Sulforhodamine B;山羊抗人ERCC1，辣根过氧化物酶标记驴抗山羊IgG。其他辅助试剂均为分析纯。 1 3 方法 1 3 1 大肠癌组
织总RNA提取及eDNA合成 用于总RNA提取的新鲜肠癌组织取自荷兰莱顿大学医学中心的临床肿瘤科，按TRIZOL试剂盒步骤提取总RNA，用Nanodrop核酸定量分析仪测定RNA的浓度及纯度。逆转录合成cDNA。 1 3 2 ERCC1基因扩增及目的片段的回收 PCR试剂盒扩增ERCC1基因蛋白编码区，引物为5′ TTCTCGAGCCTTGGCAGCTGGGGTC
3′、3′ TTGGTCCCGGACCACAGGCTCC 5′合并attB位点到上游和下游引物上，共同孵育扩增PCR产物。按凝胶回收DNA试剂盒操 创建Gateway入门克隆，ERCC1 PCR产物2μl、pDONR201载体22μg、Gateway BP ClonaseTM酶1tg混合物25?共同孵育60min。1/10反应液转化感受态大肠埃希菌E coli DH5α中，通过λ嗜菌体位点BP特异重组获得包含ERCC1目的基因的克隆，可在卡那霉素选择培养基上生长，同时产生attL重组位点。miniprep质粒纯化，Pst I酶切鉴定。混合含有attL位点及ERCC1目的基因的入门克隆pDONR201-ERCC1和含有attR位点的目的载体p?RES-GFP及Gateway LR ClonaseTM酶1μl混合物，25?共同孵育60min，通过LR反应产生表达克隆。同样转化大肠埃希菌，ccdB自杀基因选择p?RES-GFP
ERCC1在卡那霉素培养基生长的克隆，miniprep提取质粒，Hind?，BgIII酶切鉴定。Midipreo大量提取及进行质粒纯化。测序鉴定后进行细胞转染。
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