高效液相色谱和原位荧光法比较研究威氏海链藻光合色素组成

高效液相色谱和原位荧光法比较研究威氏海链藻光合色素组成 高效液相色谱和原位荧光法比较研究威氏 海链藻光合色素组成 第23卷第2期 2005年6月 湖北民族学院(自然科学版) JournalofHubeiInstituteforNationalities(NaturalScienceEdition) Vol_23No.2 Jun.2005 高效液相色谱和原位荧光法比较研究 威氏海链藻光合色素组成 曹振锐,侯建军,黄邦钦 (1.厦门大学环境科学研究中心,福建厦门361005; 2.湖北民族学院医学院,湖北恩施445000) 摘要:采用高效液相色谱(HPLC)和活体荧光方法研究了威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)在不同营养状态 下其色素比值的变化.结果显示氮(N)限制相对磷(P)限制对威氏海链藻生长有更大的抑制作用.HPLC的结果显 示在氮限制条件下,细胞的墨角藻黄素(Fucoxanthin)/叶绿素a,叶绿素c/叶绿素a比值高于磷限制和未受营养盐 限制条件(对照组);活体荧光结果则显示氮限制条件下 550nm/440nnl,460nm/440nnl激发荧光比值低于磷限制和 对照组.这两种方法来指示浮游植物的生理状态以及研究其类群结构存在一定差异,综合比较和评价这两种方法 在指示浮游植物生理状态及类群结构中各自的优越性,结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明活体荧光能明显地指示威氏海链藻细胞生长状态 的变化,比较适宜用于指示不同生理状态下威氏海链藻的光合色素比值变化,而用HPLC来研究营养限制条件下 威氏海链藻细胞的生长变化以及计算其类群的组成较为合适. 关键词:高效液相色谱(HPLC);活体荧光;光合色素比值;叶绿素a;叶绿素c;墨角藻黄素;威氏海链藻 (Thalassiosiraweissflogii) 中图分类号:Q51;x132文献标识码:A文章编号:1008—8423(2005)02—0109—05 在海洋环境的监测和研究中,测定浮游植物色素最常用的方法是荧光法和分光法,荧光法操作简便,快 速,灵敏度较高,如在活体浮游植物的色素检测中非常有效,可以实现连续检测,从而广泛地应用于海洋和淡 水环境中浮游植物群落状态的特征研究.这些技术的共同特征是通过分离的光合色素值和原位荧光的相关 性来计算色素的浓度,试图用原位荧光的光谱特征去定量浮游植物的色素,从而去揭示活细胞中和蛋白结合 的色素变化情况.基于这种考虑,浮游植物的活体荧光应该与活细胞中特异的色素蛋白相关].细胞中不同 在光合作用中的功能也不同. 的色素蛋白单位具有不同的结构, 迄今为止,在用于辨别活体浮游植物细胞特征的生物光学技术中,原位荧光激发光谱方法对检测色素成 分的变化仍然是特异性最好的技术,并能用于在线监测.80年代中期以来,HPLC技术配合基于分光法的阵 列二极管检测器成为分离分析色素的首选方法,并已经为人们所认可.而近年来随着流式细胞(FCM)技术 与HPLC方法的结合,色素分析技术又上了一个新的高度.计算机技术的发展和应用也对HPLC技术起了巨 大的推动作用.CHEMTAX是目前比较合适的一款对HPLC数据进行处理的软件,能够较好地应用于对不 同纲的藻类色素分布的分析,甚至可以区分同一纲的不同类型的色素.许多学者还尝试用HPLC去研究色素 比值对环境条件变化的响应规律,以建立色素比值基于环境条件变化的换算模型; 而另一方面,一些学 者也在继续探讨将色素比值作为环境条件影响浮游植物生理状态特征指标的可靠性3,从而使其能广泛地 应用于指示浮游植物类群和生物量,指示浮游植物生长过程和生理状况.HPLC方法优点在于定量准确,受 采样水质的影响小,但是需要后续的样品处理,且样品数目也受到限制;而活体荧光则可以实现对研究水域 的现场连续监测,但对水质 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 比较严格.由于两种方法有着各自的限制因素,因此在不同的环境条件下,两 种方法得到的结果可能相差很大,而目前国内外的相关研究很少.本文拟通过对硅藻模式种威氏海链藻 收稿日期:2005—03—02. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(40076031;40376043). 作者简介:曹振锐(1979一),男,博士研究生,主要从事微型生物生态学研究 l10湖北民族学院(自然科学版)第23卷 磷营养调控下进行培养,以探讨用这两种方法来检(豫.zioimeissflogii)在不同的氮, 测该模式藻的光合 色素组成及变动的相关性. 1材料与方法 1.1培养及采样方法 实验采用批量培养,试验分四组:氮限制组(简称NL组,下同),磷限制组(PL),氮磷限制组(NPL组), 以及对照组(未受营养盐限制)(C组),容器采用玻璃培养缸,培养体积为8L.培养用海水用前先用0.45tzrn 的滤膜过滤后,高温灭菌两次,海水营养盐本底值为硝酸盐:11.9~mol/L,磷酸盐0.59wnol/L,培养各组营 养盐添加组按f/4培养基添加,各限制组则不添加响应限制因子,硅酸盐,痕量金属和维生素按f/2培养基添 加.接种母液处于稳定期,接种浓度约为10%.培养温度稳定在21?,光周期为D:L=12h:12h,光照强度保 持在7000b【左右.每日定时搅动数次以保持水体均匀.每日中午12时定时取样,取样量各组均为250m1. 1.2细胞计数. 取1ml充分混匀的藻液水样,加入10l鲁格氏固定液,混匀后取100Ixl于浮游植物计数板上,用倒置显 微镜计数全片.细胞浓度较高时,则以一定比例稀释,使得计数的细胞数目保持在300,800cell/ml左右,每 个样品计数3次,取平均值作为最后结果. 1.3光合色素分析 样品过滤:取采得的水样100ml(后期为50ha)滤过47mmGWF(Millipore)滤膜,滤膜于一20~C保存,样 品在过滤后24h内测定. 样品处理:在低光下进行,将滤膜用滤纸吸干水分后,剪成细条盛于5Illl离心管中,加入2mL4~C预冷的 DMF(N,N二甲基甲酰胺),于振荡器上充分振荡混匀后放于一20~C冰箱内萃取30min,然后将离心管于 6000r/min下离心5min,吸取1ml左右清液滤过13InlTlGF/F滤膜,取0.8Illl滤液加入0.2ml1mol/L乙酸胺 置于棕色色谱瓶中,待测. 样品测定:分析系统采用Agilent1100Series液相色谱工作站,色谱柱为EclipseXDBC8柱(Agilent,Ger— many),采用梯度洗脱技术,流动相A为80/20(v/v)甲醇:乙酸胺,流动相B为100%甲醇.流速1ml/min.梯 度洗脱程序为22min内流动相B由初始5%上升至100%,保持100%B相7min,2min内返回初始条件.分 析系统为二极管阵列检测器(DAD). 色素定性和定量:色素定性根据色素保留时间(tR)以及洗出峰的扫描图谱(350, 700rim),参照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 色 素及文献所提供的色素扫描图谱来进行.色素定量采用外标法,色素标准样品叶绿素a(CHLA)购自Sigma — Aldrich公司.其他色素标准样品则由本实验室从纯培养藻种提取液经HPLC分离制备得到,标准色素使 用前先用分光光度法定量. 1.4原位荧光分析 取100ml水样滤过2m核孔聚碳酸酯核孔滤膜,将滤膜置人5ml离心管中,加入4Illl过滤海水,充分 振荡使细胞全部脱离滤膜.将得到的混合液直接倒人1cm石英比色池中,于岛津RF5301(PC)S荧光分光光 度计下扫描,激发光扫描波长为350,700nm,扫描间隔0.5nm,发射光固定为680nm.激发光狭缝1.5nm, 发射光狭缝为10nm.以过滤海水作为空白,每个样品扫描两次,取平均值减去空白值后作为最终结果. 2结果与讨论 2.1培养过程中威氏海链藻细胞密度的变化 培养开始时细胞处于稳定期,在培养开始后各组细 胞则迅速增殖(图1).到第3,4d,细胞基本上处于平稳 期.各培养组问,未受营养盐限制的C组细胞数目密度 最大,其次为PL组,而NL组和NPL组细胞浓度则较 低,且N组的细胞密度略高于NPL组.以上结果说明 威氏海链藻对磷限制有较好的耐受性,相对而言对氮限 制比较敏感. E 8 餐兰 赣 萤 l U23456789 培养天数,/d C~hurtDays 图1培养过程中各组细胞数目的变化 Fig.1Thevariationofcellamountsduringculture 第2期曹振锐等:高效液相色谱和原位荧光法比较研壁壁夔全鱼耋望堕 2.2威氏海链藻墨角藻黄素(Fucoxanthin)/叶绿素a(F/A)比值变化与活体550nm/440nm激发光下激发 荧光比值的结果比较 墨角藻黄素是硅藻的主要特征色素之一,也是最重要的光吸收色素J,负责吸收光能传递给叶绿素a. 图2A显示在培养过程中各组墨角藻黄素与叶绿素a比值(F/A)的变化曲线.在培养开始时除NL组外,其 余三组F/A比值降低;至稳定期,NL和NPL组的F/A比值逐渐增加,而PL和c组的F/A比值继续小辐降 低.至培养结束PL组的F/A比值也逐渐升高.与培养开始时相比,NL组的F/A比值增加97.6%,NPL组和 PL组也分别增加45.1%和15.3%,而c组则降低了23.3%.可见在不同的营养盐条件下,威氏海链藻的色 素比值会发生较大的变动,特别是在氦限制的条件下,叶绿素a相对墨角藻黄素有明显降低.同时F/A偏离 最大的是NL和非NPL组,说明营养盐比例的不均衡比N,P共同限制更容易引起F/A的波动. 培养天数t/d Cu1tureDay 一 -- 一 - A---'q 二p兰I.illi~ed': I二:二::二 图2培养过程中Fucoxanthin/Chla与活体550nm/440am激发荧光比值的变化 Fig.2VariationofratiosofFucoxanthin/Chlaandfluorescenceintensityunder550nm/440a mexcitationlightduringculture 图2B表示在培养过程中,威氏海链藻在550nm和440nm激发光下的荧光强度之比.由于墨角藻黄素 是细胞主要的光吸收色素,Soohoo等人研究发现其在活体细胞中主要吸收峰位于480,560nm之间,选择 550nm的峰值作为其特征吸收波长;而440nm则主要是针对叶绿素a的吸收峰,因此这两个峰值激发的荧 光强度比值变化可以看作两种色素浓度及光吸收转化效率的相对变动J.从增长曲线来看,活体同样反映 出氮限制对威氏海链藻的生长限制作用,PL和C组变化规律非常相似,而NL则和NPL组的变化曲线相对 吻合.在培养初期,各组的550nm/440nm比值都有所增加,进入平稳期这一比值又逐渐降低.PL组和c组的 550nm/440nm比值明显高于NPL组和NL组,指数生长期时最高值分别比培养开始时增加52.8%和 72.3%,在培养结束时比值仍分别高于起始值12.6%和29.1%;而NPL和NL组在指数生长末期只分别比 初始值增加15.4%和20.4%,至培养结束则分别比初始值降低13.3%,14.5%. 对比图2A和2B的结果,用HPLC和原位荧光的方法都反映出N限制对威氏海链藻生长的影响更为严 重,而PL组则与C组有相似的变化曲线.但两种方法的结果也出现了较大的差异,PL组和C组F/A(Fucox. anthin/叶绿素a)比值在培养过程中没有明显变化,其550nm/440nm激发荧光比值却大幅增加,显示墨角藻 黄素在细胞迅速生长时会发挥更大的效率.相对而言,NL组和NPL组在培养稳定期F/A比值有所增加,而 这时墨角藻黄素的荧光效率却逐渐降低,即此时大量的墨角藻黄素没能够参与光合作用,无法将其吸收的光 能传递给叶绿素a.对两种方法的结果进行相关性分析发现没有明显的相关关系,也暗示了在用这两种方法 用来指示海区浮游植物类群的群落结构时,其结果可能会存在较大的差异. 2.3威氏海链藻叶绿素c/叶绿素a(C/A)比值与活体460nm/440nm激发光下激发荧光比值结果比较 在光合作用中叶绿素c同常被认为是光能传递的中间色素,能够接受光吸收色素(如墨角藻黄素)吸收 的光能传递给叶绿素a.HPLC结果显示(图3A),C/A比值除NL和NPL组的第5d外,在培养开始后逐渐降 低,与F/A比值的变化规律相似,PL组和c组下降趋势相对更加明显,至培养结束c组C/A比值下降了 28.3%,而NL组只下降了2.3%.与F/A比值的变化相比,C/A比值的变动是相对较小的. 活体荧光的结果于图3B所示,我们采用Poryvkina等人的研究结果,采用460nm作为叶绿素c的特 征吸收峰.在培养开始时指数生长期,各组460nm/440nm比值都有所增加,进入平稳期后,这一比值又开始 下降.此时活体荧光结果又表现出与HPLC分析相反的规律,PL组和c组的比值下降规律非常相似,均明显 低于NL组和NPL组,至培养结束时C组仍比起始值高出2.4%,而NP组则降低了9.8%. ll2湖北民族学院(自然科学版)第23卷 0.16'''.?-—一,LI-id l一-?一-PLi-jted 0.14..??...NPLi_1ted 一 *一Con:roI 0.I2 ?o., 舌.... 0.06 AB 06——一,一一—一一——一一 9I23456789 培养天数f/d CuitureDays 图3培养过程中Chlc/Chla与活体460nm/440nm激发荧光比值的变化 Fig.3VariationofratiosofChlc/Chlaandfluorescenceintensityunder460nm/440nmexcitat iontightduringculture 3结论 (1)从HPLC和活体荧光的结果来看,叶绿素C与叶绿素a之间的比例相对稳定,而墨角藻黄素与叶绿 素a的比例则变化较大.其原因一方面可能是叶绿素c和叶绿素a具有相似的分子结构,使得二者有相似的 合成和降解途径,由于叶绿素类分子中含有4个氮原子,在氮限制下可能优先被降解,当然是否如此还需要 进一步的实验验证.而另一方面是由于叶绿素C在细胞中的浓度远低于叶绿素a,460nm的活体荧光吸收峰 很大部分是叶绿素a的贡献. (2)HPLC和原位荧光的研究结果均表明,NL组的变化规律与NPL非常相似;PL组的色素比值变化更 接近C(对照)组.因此,就海链藻而言,对氮限制有更显着的响应,而对磷限制敏感度不高. (3)HPLC和原位荧光的结果也表现出较大的差异,如HPLC的结果显示C组的墨角藻黄素与叶绿素a 的比值逐渐降低,而墨角藻黄素所激发的活体荧光却明显增加;在氮限制条件下,虽然墨角藻黄素的相对比 例增加,但墨角藻黄素所激发的活体荧光效率却逐渐降低. (4)HPLC方法目前已经广泛地用于调查各海区的浮游植物类群组成,采用活体荧光测定类群组成的水 下探头目前也已经商品化J.而本实验结果显示,在不同生理状态下,这两种方法所得的结果却可能出现较 大差异.活体荧光能明显地指示威氏海链藻细胞生长状态的变化,从指数生长期到稳定期,其活体荧光比值 表现出规律性的变化,色素比值却很难体现出某种变化规律.用这两种方法来指示浮游植物的生理状态以及 研究其类群结构存在一定差异,提示用HPLC来研究营养限制条件下威氏海链藻细胞的生长变化以及采用 HPLC计算其类群组成较为合适,而采用活体荧光指示不同生理状态下威氏海链藻的光合色素比值变化则 较为适宜,综合研究的结果表明需要根据实际情况来选择合适的指标用于指示浮游植物生理状态的变化或 用来测定浮游植物的类群组成. 参考文献: [1]韩博平,韩志国,付翔.藻类光合作用机理与模型[M].北京:科学出版社,2003.17,34. [2]MackeyMD,MackeyDJ.CHEMTAX—aprogramforestimationclassabundancesfromchemicalmarkers:applicationtoHPLCmea surementsof phytoplankton[J].MarEcolProgSer,1996.244:265,283. [3]KenFuruya,MasatoHayashi,YasushiYabushita.eta1.PhytoplanktondynamicsintheEa stChinaSeainspringandsummerasrevealedbyHPLC — derivedpigmentsignatures[J].Deep—SeaRos.II,2003,5O:367,387. [4]MackeyDJ,HigginsHW,MackeyMD,eta1.AlgalclassabundancesinthewesternequatorialPacific:EstimationfromHPLCmeasurementsof chloroplastpigmentsusingCHEMTAX【J].Deep—SeaRes.I,1998,45:1441,1468. [5]StoheW,KraayGW,AnnaAM,eta1.GeneticandphysiologicalvariationinpigmentcompositionofEmilianiaHuxleyi(Pnosiophyceae)and thepotentialuseofitspigmentratiosasaquantitativephysiologicalmarker【j].jPhycol,2000,36:529—539. [6]HeukelemLV,ThomasVS.Compute—assistedhigh— performanceliquidchromato~;raphymethoddevelopmentwithapplicationstotheisolation andanalysisofphyloplanktonpigments【j].jChromatographyA,2001.910:31,49. [7]SooHooJB,KieferDA,eta1.Invivofluorescenceexcitationandabsorptionspectraofmarinephyloplankton:I.Taxonomiccharacteristicsand sponscstophotoadaptation【J].JPlanktonRes.,1986,8(1):197—214. 第2期曹振锐等:高效液相色谱和原位荧光法比较研究威氏海链藻光合色素组成 EsJPoryvkinaL.Babichenkos.cta1.Spectralfluorescencesignaturesinthecharacterizationofphytoplanktoncommunitycomposition[J].JPlankton Res.1994,16(10):1315—1327. LeboulangerC,DorigoU,JacquetS,cta1.Applicationofasubmersiblespectro— fluoremeterforrapidmonitoringoffreshwatercyanobacterial blooms:acasestudy[J].AquatMicrebEcol,2002,30(1):83—91. ComparativeStudyonPigmentCompositionof UsingHPLCandIn.—vivoFluorescence CAOZhen—rui,HOUJian—jun一,HUANGBang—qin (1.EnvironmentalScienceResearchCenter,XiamenUniversity,Xiamen361005,China; 2.MedicalSchool,HubeiInstituteforNationalities,Enshi445000,China) Abstract:ThevariationofpigmentratiosofThalassiosiraWeissflogiiunderdifferentnutrient sconditionswasdeter— minedbybothHPLCandin— vivoFluorescencemethods.TheresultsshowedthatNlimitationwascomparatively moreimportantforthegrowthofThalassiosiraWeissflogii.TheHPLCresultsshowedthatunderNlimitedcondition, theFucoxanthon/ChlorophyllaandChlorophyllc/ChlorophyllaratioswerehigherthanthoseunderP——limitedand unlimitedconditions;onthecontraryin— vivoFluorescenceresultsshowedthattheFluorescenceintensityratiosun- der550nm/440nm,460nm/440nmexcitationlightswerelowerthanthoseofP— limitedandunlimitedgroups.The evaluationofphytoplanktoncommunitystructureusingthesetwomethodsmightraisegreatdifference.Acomprehen— sivecomparisonabouttheadvantagesofthesetwomethodsinindicatingphytoplanktonandcommunitystructure showedthatin—— vivoFluorescencecouldclearlyindicatethevariationofgrowthphaseofThalassiosiraWeissflogii andwasmoresuitabletoindicatethevariationofpigmentratiosofThalassiosira讹 ogiiamongdifferentphysio— logicalstatus.Onthecontrary,thecomparisonresultshowedthatHPLCwasmoreappropriatetostudythegrowth changingofThalassiosiraWeissflogiiundernutrientslimitedconditionsandtocalculatethephytoplanktoncomlTluni- tystructure. Keywords:highperformanceliquidchromatography( a;ChlorophyllC;Fucoxanthin;ThalassiosiraWeissflogii HPLC);in—vivoFluorescence;pigmentratios;Chlorophyll