荧光光度法[新版]
荧光分析法测定维生素B药片含量2
一 实验目的
1. 掌握荧光分析法测定维生素B含量的原理及方法。 2
2. 熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。
二 基本原理
维生素B(即核黄素)的溶液在430~440nm蓝光照射下，会发黄绿色荧光，荧光峰值2
波长为535nm。在pH6~7的溶液中荧光最强，在pH>11时荧光消失。醋酸溶液中荧光强度将会增强。其它条件一定时，维生素B的稀溶液(0.5~5μg/ml)的荧光强度与荧光物质的2
浓度成正比。
本实验采用
标准
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曲线法。利用维生素B可被还原剂(连二亚硫酸钠)还原为非荧光性2
物质，通过测定加还原剂前后样品液的荧光强度，来消除可能的样品基体干扰，基于上述原理来测定药片的维生素B含量。 2
三 仪器与试剂
(一) 仪器
荧光分光光度计，样品池(石英)，10ml刻度吸管，10ml具塞比色管 (二) 试剂
维生素B贮备液(100μg/ml) 2
避光操作，精确称取100mg维生素B(生物试剂，避光干燥保存)置于250ml烧杯中加冰醋2
酸10ml及蒸馏水90ml在水浴上加热溶解后，放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中放暗处保存。
维生素B标准应用液(1.0μg/ml) 2
实验当天用移液管准确吸取标准贮备液5.0ml于500ml棕色容量瓶中，用1%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀。
1%醋酸溶液
取1ml冰醋酸用去离子水稀释至100ml。
连二亚硫酸钠(AR，保险粉)
四 操作步骤
1. 样品药液制备
1)取核黄素药片10片，研细，称出适量(约相当于维生素B10mg)置于250ml烧瓶中加2
冰醋酸10ml，加蒸馏水90ml，置水浴上加热约1小时，并时时振摇使其溶解澄清后放冷，转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中避光保存。该样品药液含维生素B10μg/ml。 2
2)用移液管准确吸取维生素B药液10ml于100ml容量瓶中，用1%醋酸液稀释至刻度，2
摇匀，取此溶液10ml于比色管中，按与标准系列同样步骤测定此溶液的荧光强度。
2. 标准系列的配制
取10ml比色管6支，按下表配制标准系列管:
管号 0 1 2 3 4 5
维生素B标准应 20.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 用液(1.0μg/ml)
1%醋酸溶液 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 3. 仪器调试
1) 接通仪器及电源开关，再打开电脑及工作站。 2) 取标准系列浓度最高管(5号管)，固定荧光波长535nm，在350~500nm的波长范围内，
扫描不同激发波长下的荧光强度，得到以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的激
发光谱，确定激发光波长λex。
3) 固定激发光波长λex，在450~600nm的波长范围内，扫描不同荧光波长下的荧光强度，
得到以荧光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标的荧光光谱，确定荧光波长λem。
4. 测定
1) 在λex和λem固定的条件下，将摇匀后的标准系列管，按浓度由低到高依次倒入样品池
中，分别测出荧光强度并
记录
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填入下表中。以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标
准曲线。
管号 0 1 2 3 4 5
维生素B浓度 20.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 (μg/ml)
F n
F-F n0
2) 相同条件下测定样品液荧光强度，记为F。再在测定过的样品液中加入保险粉约样
10~20mg，轻轻摇动后迅速倒入样品池中，测定荧光强度，记为F(30秒钟之内测完)。空白
以F-F值在标准曲线上查出相应的维生素B浓度。 样空白2
3) 测试完毕后，关闭电脑及工作站，再关闭仪器及电源开关。
五 注意事项
1. 连二亚硫酸钠能将荧光型维生素B还原为非荧光型维生素B，但不可多加，否则22
将其它还原性物质还原使测定结果偏高。同时，加入保险粉后应立即测定荧光强度，
否则维生素B2又被氧化为荧光性，且多加或长时间后溶液会出现沉淀。
2. 为防止维生素B2见光分解，实验应注意避光。
3. 荧光测定中的样品池为四面皆光面的方形石英玻璃池，为防止污染，应手持不在光
路的边棱。
六 思考题
1. 为什么要选用标准系列浓度最高管调试仪器,
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