极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究 极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发 酵条件研究 2001年28(4)微生物学通报?5? 极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究 张锐曾润颖 国家梅洋局第三海洋研究所悔洋生钉工程重点宴验童厦门3451005) 摘要:从深海的38份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY—A,其最适生长温度为 1O?,能适应较大范围的pH值和盐度.此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶,不利用单 一 氯源,最适产酶条件为:pill0.0,10?,接种量0.5%.200r/rain摇床培养48一”/2h.粗 酶液的最适作用温度为40?+最适pH值为1O,在pH9—12内稳定,是一碱性蛋白酶. 关键词:极端微生物,嗜冷苗,碱性低温蛋白酶+发酵条件 中圈分类号:Q93文献标识码:A文章编号:0253—2654(2001)04-0005-05 ISOLATIONOFADEEP-SEASTRAINT姒TPR0DUCESALKALINE PROTEASEANDSTUDIESONITS ZHANGRuiZENGRun-3Cmg (KeylaboratoryMarineBioteclmologytTheTtdrdlnstituleOceonogzaphy, $OA.n3610U5) A血Bct:From38piecesofdeep-~.ea蚰?一髑,Itsb 血.DY-A,wlfich0dIlcesptotea~Wit8isolated.ntea growatItwiderangeofDHandsaltconcenlrallonandbestat10? Thestratain’oducedmaxummlproautseacti-,~ty af时growthatl0? tinitialpH100andinocudatio~VOhlffl~05%for48—72h0nItsha蛔 byof200t/rain. TheopllmtlmpHandtempermlrehtheptotea~acti-,~tylmxluctionpnio.0and 40?Theenzymeish ptotea~Some~0aerDpofthestta/nandptotea~werec~,o,ssedindetail Kwords:E功?ph,Psychrope,Alhproautse,Fennemafioa.oodi6? 蛋白酶是一种应用很广泛的工业用酶,它在制革,纺织,洗涤,医药和 食品等行 业中有重要的地位_l.有关蛋白酶的研究也已经有了很久的历史_2J, 但对擐海极端微 生物产蛋白酶的研究却鲜有报道.深海微生物处于极端的物理,化学 和生态环境中, 经过长期的自然选择,它们形成了极为特殊的生理结构和代谢机制, 同时还产生了许 多具有特殊性质的生物活性物质L].由于深海极端微生物采样,培养的困难等多种因 素的影响,国内外对极端微生物研究还处于起步阶段.所以,对擐海的”大洋一号”科学考察船采 集泥样及水样共38份. 1.2培养基 斜面培养基:蛋白胨1g,牛肉膏O.5g,NaC10.5g,琼脂1.5g,pla8.5,定容lL. 2216E培养基:蛋白胨0.5g,酵母膏0.1g,自然海水(经过滤后使用)1L,pH8.5. 平皿筛选培养基:酪蛋白lg,酵母膏0.2g,琼脂1.5g,自然海水(经过滤后使用) 1L,pill0. 摇瓶发酵培养基:酪蛋白lg,酵母膏02g,自然海水(经过滤后使用)1L,pill0. 1.3菌种分离 按常规菌种稀释分离方法进行分离J. 1.4蛋白酶活力测定 Folin试剂显色法【.以lmL酶液在40?,pill0,每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨 酸所需的酶量定义一个酶活力单位(u). 1.5试剂与仪器 酵母膏(YeastExtract)为Oxoid公司产品,蛋白胨(Tryptone)为BBI进口分装,酪 蛋白(Casein)购自中国医药上海试剂站,低温摇床(4?,60?)是NewBmnswickSei. entitle公司制造.AICUV.9100型分光光度计购自北京瑞利 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪器公司. 2结果 2.1产蛋白酶菌株的分离 将采集到的水样稀释,泥样用无菌水浸泡取上清后,涂布在2216E培养基平板上, 4?冰箱培养,挑取单个菌落划线于筛选培养基平板.4~C冰箱培养3,4d,挑取透明圈 直径大于1cm的1l株菌株纯化,镜检,保种. 2.2复筛 将初步筛选获得的菌株接人摇瓶发酵培养基中,10?,200r/nfirt摇床培养48,72k, 测定酶活,经反复比较后,选用编号为DY.A的菌株为实验菌株. DY.A号菌株的采样数据为:站位:ES9803;地理位置:西径145.23.8,北纬8. 22.5;水深5225m;样品为无结核硅质黏土,颜色较黑,质地较硬;时间:1998年8 月22日9时l0分. 2.3DY.A号菌株的细菌学鉴定 2.3.1形态特征:油镜下细胞呈短杆状,圆端,单个排列.菌体太小为1.2,1.5.urn× 0.2,O.3p.Ilrl.平板划线培养3d后蔼落呈圆形,直径O.5em左右.表面光滑有光泽,边 缘整齐.稍有隆起,颜色为浅乳白色,半透明,在筛选培养基平板上可产生2cm左右 的透明圈.摇瓶中发酵培养,幼龄时呈乳白色.后逐渐变为土黄色,直至红褐色.有 较强烈臭昧. 2.3.2生化特性:革兰氏染色为阴性,可在培养平板盐度商达45%o时及pH值为l1时生 2001年28(4)微生物学通报 长.其生长随温度的变化见图1.. 由图1可以看出,DY.A号菌株在 37?完全不生长3O?及2O.C时其生长 曲线的稳定期比较短暂,lO?时其菌… 体浓度和稳定期维持时间都较为理想, 所以DY.A号菌株为一嗜冷菌_6J2o 2.4产酶条件试验 2.4.1碳源试验:在发酵培养基中加入 不同的碳源,浓度为1%,于1O?, 200r/rain培养72h+测酶活力,结果见 表l,菌株DY.A不利用半乳糖和木oo 糖,虽然对葡萄糖,淀粉蔗糖乳 糖,麦芽糖,果糖和甘露糖有不同程 度的利用,但均无酶活产生,只有利 用酵母膏才可产生较高酶活力. 襄1各种碳谭对产酶的影响 7 u1o203040506070go t/h 图1DY—A菌株在不同温度下的生长曲线 —一 10,—0—0,—一30.—37 2.4.2氯源试验:在发酵培养基中加入不 同的氮源,浓度为0.5%,碳源为淀粉, 1O?,200r/min培养72h,测酶活力+见表 2,菌株DY.A不利用除蛋白胨外的其他氮 源,同时表明,在投有酵母膏存在的情况 下,菌体利用蛋白胨但不产生蛋白酶. 裹2各种氯尊对产酶的影响 2.4.3起始pH值对产酶的影响:配制发酵培养基,用5%的NaOH调至 不同的pH值, 1O?,200r/rain培养48h,发现,DY.A号菌株的最适产酶起始DH为10.0,在pH9—11 的范围内均有较高酶活,当DH超过12时,菌体生长和产酶量明显降低. 2.4.4培养时间和温度对产酶的影响:发酵培养基pH值调至10.0,分别在1O?,20~C 和30?培养112h,测酶活,结果见图2.可见,30?时菌体虽然生长但是无酶活产生, 在1O?及20~C时,其酶活变化趋势和生长曲线的变化趋势基本吻台. 2.4.5接种量对产酶的影响:将培养36h的液体种子按不同接种量接人摇瓶发酵培养 基,1O?,200r/ndn培养48h,实验表明,接种量在0.2%一0.4%时菌株DY.A产酶量 最高,大于1%时产酶能力有明显降低. R 坦 畦 血 蛐 8 50 40 30 20 10 0 微生物学通报 z/h 圈2培养时问和温度对产酶的影响 — 口一10?,-<9--20?.一30? 衰3金?鼻子对产酶的影响 2001年28(4) 2.4.6金属离子对产酶的影响:发酵培养基 中加人0.04%的各种金属离子,10?, 200r/min培养48h,浏酶活力.见表3, ca2,M可促进菌株DY.A的产酶, ? , Ba2,M,K’,?,?则对 蛋白酶的产生无太大影响;cJ,Cu2, 踟”则抑制DY.A菌体生长.这与普通碱 性蛋白酶产生苗的性质类似l7J. 2.5粗酶液的性质 2.5.1最适温度:分4在不同温度下进行酶 反应,觅图3.酶的最适温度为4o,在 35?,45?内酶活力较高. ? 卯 一 日40 0 R30 蝗 矗 血2o 阿 1O 0 01020304o5O6o f/? 匿3酶的最适韫度 2.5.2热稳定性:将粗酶液在不同温度的水浴中保温1.5h,然后进行酶反应,结果表 明,此酶在0,30?内保温1.5h后酶活力稳定,4o?下酶活剩余54.6%,50?剩余 162%,60?下则基本丧失全部活力. 2.5.3最适pH值:用不同pH的缓冲液配制底物溶液,进行酶反应.结果表明,此蛋白 酶的最适pH为10.0,在pH9,12的碱性范围内均有较高的酶活力. 3讨论 实验表明:DY.A号菌株是一株嗜玲,耐碱的探海极端细菌,它的一些生理生化特 性和产酶的性质与相关文献报道的普通蛋白酶产生菌有明显的不同[J,从碳源及氟源 试验可以推测在酵母膏中有DY.A号菌株产蛋白酶的必须因子,细菌不能利用多种碳源 及氟源与其所处的极端环境有关.菌株在10?时的产酶较高可能是此温度下苗体较多 或蛋白酶比较稳定的原因,但也有可能是温度对蛋白酶的产生有低温诱导或高温抑制 的结果.虽然DY.A所产生的蛋白酶的最适温度在4o?,但是此蛋白酶在低温下的相对 酶活却较高.参考国内外的有关蛋白酶的文献l8J,此菌株还可能适于 用做研究低温蛋 2001年28(4)傲生物学通报9 白酶的出发菌株,而且.DY.A菌株是一深海极端微生物.这在理论研究中有重要价 值.我们计划从DY.A菌株及其所产的碱性蛋白酶出发,利用分子生物学方法,研究极 端微生物在生理生化,活性物质产生机理等方面与普通微生物的差别.而且,通过生 物工程手段,有希望将其应用于常温洗涤等生产实践. 致谢国家海洋局第三海洋研究所陈兴群副斫究员,林荣澄副研究员.帮助采样,特此 致谢. 参考文献 [1]唐兵,周林峰.阵向东,等微生物.2000.帅(2):188,192 [2]邱秀宝,高东,王辅达般生物,1994.34(4):293—300 【3JBmwnJR,Dooli~leWFMic~io[MdBR,1997.61:456,502. [4]范秀窖,亭广武,沈萍微生物学实验北京:高等教育出版社会,1996 [5]阵曾燮,刘兢,罗丹生物化学宴验台肥中国科技大学出版社,1994 [6]李广武.郏从义,唐兵低温生物学长沙:朝南科学技术出版社.1998 [7]部椒敏.余茂教擞生物,198g,(3):249—256 【BJHoehinoT,kIliK,sah瑚t0T,alk船inA呷 IjMicrobiclsy,1997,25:70—72 f9]肆秀宝,程秀兰.童髟教生暂学蠢报.1蛆8,15(3)tl0l,IO4 [10】Fe]le~G,hO.Get’dayC.ApplEn-,~cnMicrc~o1.1995,64:l163—1165 纳豆激酶产生菌纳豆菌对木糖和葡萄糖的利用 谢秋玲郭勇林剑 (置南大学生物工程研究所广州510632)’(华南理工大学童品与生物工程学院广州51~1) 摘要:在纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)发酵条件研究中.我们发现丰糖是较葡萄糖更 佳的产酶碳源.进一步的试验证明,NK的发酵菌种——csubff//svar.natto在混合碳 源中没有二欢生长现象,对丰糖和葡萄糖的吸收是同时的.且互不干扰.葡萄糖对术糖的 吸收利用没有分解代谢阻通. 关t词:蚋豆苗.纳豆激酶,术糖,葡萄糖.分解代谢阻遏 中瞳分类号:Q939.9文献标识码:A文罩簟号:0253.2654(2001)04-0009.04 T唧UTILIZAT10NOFGLUCOSEANDXYLOSEBY丑AC?工,SE田T卫瞄 VA[标签:快照]