山芦桑颗粒剂的制备工艺及质量控制研究（可编辑）

山芦桑颗粒剂的制备工艺及质量控制研究（可编辑） 山芦桑颗粒剂的制备工艺及质量控制研究 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成 果, 也不包含为获得 暨南大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 暨南大学 有关保留、 使用学位论文的规定, 有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。 本人授权 暨南大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印 、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编:暨 南大 学硕 士学 位论 文 摘 要 山芦桑颗粒剂是一种由山药等六味药材组成的复方制剂,有效部位为多糖, 具有调节 免疫之功效 。由于该复方日服用量较大,不便于携带和服用。 本课题运用现代方法对复方 中的有效部位进行提取 , 筛选其最佳提取工艺; 并对其进行制剂工艺研究及质量控制研究。 在提取工艺研究中 , 本论文分别通过单因素试验及正交试验比较了热水浸提方法和超 声波辅助提取方法 。通过比较两种提取方法可知, 按热水浸提方法最佳 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 提取得到的多 糖含量远远高于超声 波辅助 提取方法,因此,最终选用热水浸提方法提取多糖。 在制剂成型工艺研究中 , 本论文以成型性、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性为考察 指标,采用综合评分法筛选出合适的辅料及其用量、润湿剂等。最终选用的辅料为乳糖, 多 糖与辅 料的比 例为 1: 0. 75, 润湿剂 为 90% 乙 醇,制 粒方法 为湿 法 制粒。 按上述 条件制 备颗粒剂,制粒效果较好。一日可分三次服用,每次 8g。 在质量控制方面,本论文建立了山药的薄层鉴别方法及有效部位的含量测定 方法, 检 查了颗粒剂的粒度、水分、溶化性、装量差异等,结果显示均符合要求。 以上实验结果表明,所制备的山芦桑颗粒剂制备工艺可行、质量稳定可控。 关键词: 山芦桑颗粒剂;制备工艺;质量控制 I暨 南大 学硕 士学 位论 文 A A b b s s t t r r ac ac t t A A b b s s t t r r ac ac t t S h a nl u s a ng G r a n ul e s i s a c o m po un d pr e pa r a t i o n t h a t c o n t a i ns 6 C h i ne s e m e di c i na l h e r b s , s uc h a s D i os c or e ae r hi z om a. I t s e f f e c t i ve f r a c t i o n a r e pol y s a c c ha r i d e s , w i t h t h e e f f i c a c y of r e gul a t i ng i m m u neH o w e v e r , t h e c o m po un d pr e pa r a t i o n i s i n l a r ge da r i l y dos e a nd n o t e a s y t o c a r r y a n d t a keS o t h e e f f e c t i ve f r a c t i o n w e r e e xt r a c t e d b y m o de r n m e t h o ds a n d t h e e xt r a c t i ng t e c hno l o gy w e r e opt i m i z e d. M o r e ov e r , t h i s r e s e a r c h s t udi e d on t h e pr e pa r i ng t e c hno l o gy of S h a nl u s a ng G r a n ul e s a nd qua l i t y c o n t r olI n e x t r a c t i ng t e c hno l o gy s t udi e s , s i ng l e f a c t or e xpe r i m e nt a n d or t h o gon a l e x pe r i m e nt w e r e a ppl i e d t o c o m pa r i ng h o t w a t e r e xt r a c t i ng m e t h o d a nd ul t r a s o n i c e xt r a c t i ng m e t h o d. B y c o m pa r i ng t h e t w o m e t h o ds , t h e c on c e nt r a t i o n of pol y s a c c ha r i de s t h a t e xt r a c t e d b y h o t w a t e r e xt r a c t i ng m e t h o d w a s h i g he rS o h o t w a t e r e xt r a c t i ng m e t h o d w a s s e l e c e t e d t o e xr a c t pol y s a c c ha r i de sI n t h e pr e pa r a t i ng s t udi e s , f o r m a bi l i t y , b ul k de ns i t y , a n gl e of r e pos e , s o l ubi l i t y , h y g r o s c o pi c i t y w e r e t a ke n a s i nve s t i ga t i o n i nde xe s , t h e ki nd a n d a m o unt of e xc i p i e nt a n d w e t t i ng a ge nt w e r e s c r e e ne d. T h e s ui t a bl e e xc i p i e nt w a s l a c t os e , a n d t h e r a t i o b e t w e e n pol y s a c c ha r i de a nd e x c i pi e nt w a s 1: 0. 75. T h e s ui t a bl e w e t t i ng a ge nt w a s 90% e t h a no lT he gr a n ul a t i ng e f f i c i e nc y i n a bo v e c o n di t i o n s w a s good. T h e dos e w a s 8g e a c h t i m e , a nd t h r e e t i m e s da i l yI n t h e qua l i t y c o n t r ol s t udi e s , T L C i de nt i f i c a t i o n of D i os c or e ae r hi z om a w a s e s t a b l i s he d a nd c o n t e n t de t e r m i na t i o n of pol y s a c c ha r i de s w a s e s t a b l i s he d, a n d pa r t i c l e s i z e of gr a n ul e s , w a t e r c o n t e n t , s o l ubi l i t y , t h e di f f e r e nc e of de a l m e t t h e r e gui r e m e nt sA l l t h e r e s ul t s s h o w e d t h a t t h e pr e pa r i ng t e c hno l o gy of S h a nl u s a ng G r a n ul e s w a s f e a s i bl e a nd s t a b l eK K K K e e e e y y y y w w w w or or or or d d d d s s s s : : : : S h a nl u s a ng G r a n ul e s ; pr e pa r i ng t e c h no l o gy ; qua l i t y c o n t r ol I I暨 南大 学硕 士学 位论 文 目 录 摘要 I A bs t r a c t. I I 第一章 前言1 一 免疫调节剂 2 1 概述. 2 2 免疫调节剂的应用2 二 多糖的研究进展3 1 多糖来源3 2 多糖的生物活性. 4 3 多糖的提取方法. 9 三 处方中的药材研究进展 1 1 1 山药1 1 2 芦根 13 3 桑葚 13 4 大枣 14 5 淡竹叶 14 6 青果 15 第二章 实验部分. 16. 17 第一节 多糖的提取工艺研究 1 材料 17 2 多糖的含量测定方法18 3 多糖的提取工艺研究21 4 小结 29 第二节 制剂成型工艺研究. 32 1 仪器与试剂32 2 剂型及制粒方法的选择32 3 辅料的筛选33 4 润湿剂的选择 36 5 辅料用量的选择 36 I I I暨 南大 学硕 士学 位论 文 6 38 颗粒剂的临界相对湿度的测定 7 小结 39 第三节 质量控制研究 41 1 仪器与试剂41 2 方法与结果42 3 小结 47 参考文献. 48 致 谢. 54 I V暨 南大 学硕 士学 位论 文 第 一 章 前 言 机体免疫系统具有识别和排斥清除异物或抗原性物质的功能, 这种生理学功能就是免 疫。机体依靠其识别 “ 自己 ” 和“ 非己” 成分,排除异物或机体本身产生的损伤细胞、肿瘤细 胞等, 以维持机体生理平衡和健康 。 免疫系统包括免疫器官、 免疫细胞以及免疫活性物质。 免疫器官主要有骨髓 、脾、 胸腺、淋巴结等,是免疫细胞生成、 成熟的场所;免疫细胞主 要有 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞、 吞噬细胞等; 免疫活性物质是由免疫细胞或其他细胞产生 的具有免疫作用的物质 ,包括细胞因子、溶菌酶等。免疫系统的功能有免疫防御、 免疫自 稳、免疫监视 ,这些功能一旦出现失调或紊乱状况,即会引发相关疾病。 当免疫防御功能 过于亢进时 , 会发生超敏反应; 过于低下时, 会发生免疫缺陷病。 当免疫自稳功能异常时 , 会引发自身免疫病。免疫监视功能过于低下可能会形成肿瘤。 中医药关于免疫调节理论与现代免疫学理论是相辅相成的。它以整体观、 平衡观及辩 证论为思想依据 ,充分发挥中医药在宏观辩证与微观调节相结合的优势, 达到驱邪外出的 目的,从而针对机体进行相应的免疫调节。 中医学将机体抵御各种有害因素的作用归因于 “ 正气” ,而破坏机体内外平衡状态的各种有害因素归因于 “ 邪” 。正气主要是指机体抵御外 界环境侵扰的能力 , 与现代免疫学理论中的免疫力相似 。 “ 正气存内 、 邪不可干” 即指“ 正气 ” 能够驱除邪气 ,抵抗疾病, 从而维持机体的健康。 这一中医学理论与现代免疫学理论中的 三大免疫功能相似 。另外, 现代免疫学理论认为,通过调节机体的免疫功能, 维持机体内 外的生理平衡状态 , 而这种平衡状态是机体抵御、 防治疾病的基础。 这 与中医学中的“ 阴阳 平衡” 学说相符合。 许多单味中药或中药复方具有免疫调节功能 ,如黄芪、 山药、大枣、枸杞、六味地黄 丸等。中药的免疫调节功能主要体现了其 “ 扶正祛邪” 的原则,而正是这种原则使其在免疫 调节方面具有独特的优势 。 因此,从中药中寻找安全有效的免疫调节剂, 用于与免疫相关 疾病的防治 ,具有广阔的研究开发前景。其中,中药多糖具有多种生物活性, 近年来倍受 广大学者的关注 。中药多糖具有良好的免疫调节功能,而且我国中草药资源丰富、 价格低 廉、易于获取,安全性较高,易于实现大生产,是一种很好的免疫调节剂。 山芦桑颗粒剂由山药等六味药食两用药材组成,有效部位为多糖,功效为增强免疫。 该复方中多糖含量高 , 毒副作用小 ,但日服量大,并且服用不方便。 本课题旨在运用现代 1暨 南大 学硕 士学 位论 文 方法对复方中的有效部位进行提取,并对其进行制剂工艺研究及质量控制研究, 大大减少 了服用量,充分发挥其药效,同时便于携带和服用。 一 免 疫调 节剂 1 1 1 1 概述 免疫调节剂具有调节、增强或恢复机体免疫功能,临床上主要用于某些自身免疫病、 感染性疾病及肿瘤的辅助治疗。按其效应可大致分为两类: (1)免疫促进剂, 具有提高免 疫细胞的活性作用 ,主要有干扰素 、胸腺素、免疫核糖核酸等; (2) 免疫抑制剂,能够抑 [ 1] 制 有 害 于 机 体 的 异 常 免 疫 反 应 , 如 硫 唑 嘌 呤 、 肾 上 腺 皮 质 激 素 等 。 按 其 来 源 , 可 分 为: ( 1) 微生物 来源, 如云芝 多糖, 菌苗类 ; ( 2) 免疫系 统产物 ,如胸 腺类激 素、白 细胞介 素- 2、干扰素等 ; ( 3)化学合成药物如左旋咪唑 ; (4)中草药的有效成分,如人参皂苷、 黄芪多糖、枸杞多糖等 ; ( 5)其他,如蛋白类、维生素等。 2 2 2 2 免疫调节剂的应用 2. 1 调节机体免疫力,用于防治与免疫功能相关的疾病 当机体免疫功能紊乱 、 免疫力低下时,免疫系统不能发挥正常的保护作用, 使机体极 易被细菌、 病毒等感染,最直接的表现就是容易生病,严重影响到人们的工作、 学习及生 活。乙型肝炎的发病率较高,传染性较强,其发病机制与机体的免疫功能紊乱密切相关。 而中药免疫调节剂具有双向调节作用,既能清除病毒的激活效应, 又具有抑制自身免疫的 作用, 可以避免单独使用免疫促进剂或免疫抑制剂带来的不良反应。 因此, 在临床治疗中, 可以配合使用中药免疫调节剂,充分发挥其双向免疫调节功能, 从而达到有效治疗乙肝的 [ 1] 目的 。多发性硬化症是一种神经性疾病,复发率较高,并会引发其他轻微或重大疾病。 而将免疫调节剂用于多发性硬化症的早期治疗中,可以有效改善其发病历程, 降低其复发 [ 2] 率及引发其他疾病的机率 。此外,免疫调节剂还可用于白癜风的治疗、肿瘤的辅助治疗 等。 2. 2 在养殖业领域的应用 2暨 南大 学硕 士学 位论 文 [ 3] 免疫调节剂在养殖业中的应用起步较晚,但种类较多,发展迅速。王晶 通过采用四 种免疫促进剂对菲律宾蛤仔进行免疫刺激,探讨了刺激前后其体内酚氧化酶活性及含量、 血细胞数量 、以及对超微机构的作用。研究结果表明, 四种免疫促进剂均能不同程度地提 高菲律宾蛤仔的酚氧化酶活性及含量,增加血细胞数量, 揭示四种免疫促进剂均具有提高 其免疫力作用 。 这一研究结果为将免疫促进剂应用于养殖业提供了一定的科学基础和理论 依据,对降低传染病感染率、降低死亡率、提高养殖业的经济效益具有一定的指导意义。 综上所述 ,免疫调节剂能够提高机体免疫功能,可用于某些疾病的防治; 同时还可用 于养殖业领域 ,提高经济收益 。免疫调节剂发展迅速,种类繁多。其中,中药多糖具有良 好的免疫调节功能 ,而且我国中草药资源丰富、价格低廉、易于获取,安全性较高,易于 实现大生产,是一种很好的免疫调节剂,具有较为广阔的发展空间和开发前景。 二 多 糖的 研究 进展 1 1 1 1 多糖来源 多糖来源广泛 ,主要存在于动物、植物、微生物中,是一类天然大分子化合物,是构 成生命的基本物质之一。 1. 1 动物多糖 近年来,许多研究表明,动物体内的某些多糖具有多种生物活性。如鲍鱼脏器多糖、 [ 4- 7] 扇贝多糖 、 蚕蛹多糖、 泥鳅多糖等 。 动物多糖主要有糖原 (gl y c o ge n ) 、 肝素 (h e pa r i n ) 、 甲壳素 (c hi t i n ) 、 硫酸软骨素 ( c h o n dr o i t i n s ul f a t e ) 、 酸性粘多糖 ( a c i d m uc o pol y s a c c ha r i de ) 等。糖原是一种无定型无色粉末,易溶于热水,主要贮存于肝细胞及肌细胞中, 肌糖原分 解为肌肉自身收缩提供能量,肝糖原分解用于维持血糖浓度。 肝素因首先从肝脏发现而得 名,主要由肥大细胞嗜碱性粒细胞产生,具有较强的抗凝血作用。甲壳素又名甲壳质、 几 丁质、 壳多糖等 , 其来源丰富, 分布广泛 , 具有良好的生物相容性。 国内外许多研究表明, [ 8] [ 9] 甲 壳素 及 其衍 生 物具 有 多种 药 理活 性 ,如 抗 肿瘤 活 性 、 抗菌 作 用 等 。硫 酸 软骨 素 广泛 存在于人和动物软骨组织中,具有降血脂、抗炎、抗凝血活性等, 临床主要用于治疗心血 管疾病和关节炎 。动物多糖与人体细胞具有良好的生物相容性,毒副作用小, 具有多种生 物活性,因此广泛应用于医药、食品、化妆品等领域, 为人类进行多糖研究提供了丰富的 资源,具有巨大的开发潜力。 3暨 南大 学硕 士学 位论 文 1. 2 植物多糖 目前, 从植物中提取得到的多糖类化合物已达 300 多种, 主要来源于中草药和海洋藻 [ 10] 类植物。 我国中草药资源丰富, 从中提取得到生物活性较高的多糖有枸杞多糖 、 黄芪多 [ 1 1] [ 12] 糖 、 山药多糖 等。 另外, 海洋藻类植物中含有优质蛋白 、 氨基酸、 矿物质等人体必需 元素,也含有大量的多糖类物质。近年来, 人们从藻类植物中提取得到一些多糖具有较高 [ 13- 15] 生物活性,如抗肿瘤、抗凝血、抗氧化活性等 。随着多糖生物活性研究的不断深入, 从植物中提取活性多糖具有巨大的开发潜力以及广泛的应用前景。 1. 3 微生物多糖 微生物多糖主要来源于细菌和真菌,一般由淀粉水解发酵生产, 也可以通过微生物的 酶作用制备而成 。 微生物多糖在细胞内的主要存在形式有胞壁多糖、 胞外多糖及胞内多糖, 其中胞外多糖产量较大 、易于与菌体分离及实现工业化大生产。 与动物多糖和植物多糖相 比,微生物多糖具有生产周期短、不受自然条件的限制的优点, 因而具有较强的市场竞争 [ 16] 力、 广泛的应用领域及广阔的发展前景 。 目前 , 具有较高生物活性的微生物多糖有香菇 [ 17- 19 ] 多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等 。 2 2 2 2 多糖的生物活性 2. 1 免疫调节作用 机体本身在免疫应答过程中会作出相应的生理性反馈,以保持机体内环境的稳定, 这 就是免疫调节。多糖主要是从整体水平、细胞水平、免疫器官等方面发挥免疫调节作用, 还能促进细胞因子的生成,活化补体,从而有效提高机体免疫力。 2. 1. 1 整体水平的免疫调节 神经 递质、 内分泌 激素、 受体以 及各种 免疫细 胞和免 疫分子 之间可 构成神 经 - 内分 泌 - 免 疫网 络 ( N E I ) 。 神经 - 内 分泌 系 统主 要 通过 神 经纤 维 、神 经 递质 和 激素 调 节免 疫 系统 功 能; 免疫系统则通过分泌多种细胞因子, 反馈信息, 调节神经- 内分泌系统, 形成免疫系统 与神经内分泌系统的双重调节作用。因此,有些活性多糖可以直接作用于免疫系统, 同时 还能通过调节 N E I 发挥免疫调节作用。 如枸杞多糖可以通过调节下丘脑内的去甲肾上腺素 4暨 南大 学硕 士学 位论 文 和外周免疫器官神经递质的水平,使脾脏去甲肾上腺素含量下降, 同时还可影响血浆中皮 [ 20] 质酮水平发挥免疫调节作用 。 2. 1. 2 对免疫器官的调节 免疫器官是免疫细胞发育、成熟及产生免疫应答,实现免疫功能的器官, 是免疫系统 的重要组成部分 ,主要分为外周免疫器官和中枢免疫器官。其中, 中枢免疫器官主要包括 胸腺和骨髓 ,外周免疫器官主要包括脾脏、淋巴结、扁桃体、阑尾等。近年 来许多研究表 [ 21] 明, 多糖可以通过影响免疫器官的组织形态发挥免疫调节作用 。 苗明三 等探讨了大枣多 糖对气血双虚模型的大鼠的胸腺、脾脏及淋巴细胞组织形态的影响。研究结果表明, 造模 后的大鼠胸腺 、脾脏及淋巴细胞的超微结构发生了明显变化。 大枣多糖能够改善造模后大 鼠免疫器官的结构损伤及萎缩情况,使各项超微结构指标恢复至正常的水平, 因而具有调 [ 22] 节免疫的作用。陈韩英 等采用环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型,对免疫器官的重量 、 血清溶血素的含量、腹腔内的巨噬细胞功能等各项指标进行了检测,观察了沙枣多糖、 黄 芪多糖和甘草多糖对小鼠免疫功能的影响。结果表明, 三种多糖均显著提高了小鼠的胸腺 和脾脏指数,进而提高了小鼠的免疫功能。 2. 1. 3 细胞水平的免疫调节 1 对 T 淋巴细胞的影响 T 淋巴细胞简称 T 细胞,来源于骨髓造血干细胞,是淋巴细胞中数量最多、生物学功 能 最 复 杂 的 一 种 细 胞 , 发 挥 细 胞 免 疫 的 功 能 。 按 其 功 能 可 分 为 若 干 亚 群 : 辅 助 性 T 细 胞 + (H e l p e r T c e l l s ,T h) ,又被称为 C D 4 细胞,包括 T h 1 和 T h 2 两个亚群,能够与主要组织 相容性复合体 ? (M H C ?) 递呈的多肽抗原反应, 从而被激活, 具有辅助细胞免疫和体液 免疫的作用 ; 抑制性 T 细胞 ( S uppr e s s o r T c e l l s , T s ) , 具有抑制细胞免疫和体液免疫的作用 ; 效应 T 细胞 (E f f e c t or T c e l l s , T e ) , 具有释放淋巴因子的功能 ; 细胞毒 T 细胞 (c y t ot ox i c T + c e l l s , T c ) , 又被称为 C D 8 细胞, 通过 M H C ?与抗原结合, 具有杀伤靶细胞的作用。 T 细 胞的表面有多种膜表面分子, 是其识别抗原、 与其他免疫细胞相互作用、 接受信号的基础, 主 要 包括 白 细胞 分 化抗 原 ( C D 3 、 C D 4 、 C D 8 ) 、 M H C 、 膜 表面 受 体( T 细 胞 受体 T C R 、 补体受体、病毒受体、致有丝分裂原受体等) 。 [ 23] + + 刘琛等 通过研究发现,梗阻性黄疸大鼠胆总管结扎后体内 C D 4 值下降,C D 8 值升 + + + 高, C D 4 / C D 8 下降, 其细胞免疫功能严重受损 ; 而巴戟天多糖+ 胆总管结扎组体内的 C D 4 5暨 南大 学硕 士学 位论 文 + + C D 4 / C D 8 值和 值下降不明显,与胆总管结扎组相比具有显著性差异。研究结果表明 , 将 巴 戟 天 多 糖 用 于 梗 阻 性 黄 疸 大 鼠 后 , 对 其 细 胞 免 疫 功 能 具 有 明 显 的 改 善 作 用 。 Z hi s o n g [ 24] C he n 等研究发现枸杞多糖能够激活 T 细胞, 使其具有分泌细胞因子、 细胞增殖、 细胞分 [ 25] 化等功能, 并推测这种激活作用可能是枸杞多糖提高免疫的作用机制之一 。 张晨晓 通过 研究发现, 泥鳅多糖可以促进有丝分裂和细胞因子 I L - 2、 I L - 4 的分泌, 因而能够促进 T 淋 巴细胞的增殖 , 激活 T 细胞的活性。 研究结果表明, 泥鳅多糖能够与 T 细胞表面的某种膜 表面受体结合 ,激活淋巴细胞 ,进而发挥其免疫调节功能。 从而在细胞水平解释了其免疫 调节功能的作用机制。 2 对 B 淋巴细胞的影响 B 淋巴细胞简称 B 细胞, 来源于骨髓造血干细胞, 比 T 细胞体积略大。 B 细胞受抗原 刺激后会增殖分化出浆细胞,合成、分泌免疫球蛋白,发挥体液免疫的功能。 B 细胞的细 胞膜上有多种不同的标志,主要有 C D 、M H C (包括 M H C ?和 M H C ?类抗原)以及膜表 面受 体(包 括膜表 面免疫 球蛋白 m I G 、补 体受体 C R 、致 有丝分 裂原受 体、细 胞因子 受体 [ 26] 等 ) ,是其识别抗原、发挥免疫功能的基础。陈露 研究发现,虫草多糖具有刺激 B 细胞 [ 27] 的增殖,促进抗体生成的作用。王剑 等对川牛膝多糖( C P )进行了免疫活性的研究, 结 果 发现, C P 能 够显著 促进 B 淋 巴细胞 的增殖 ,增强 巨噬细 胞的吞 噬功能 和 N K 细 胞的活 性,且随着浓度的增高而增强。因此,川牛膝多糖具有促进体液免疫的作用。 3 对单核/ 巨噬细胞的影响 单核细胞是体内体积最大的白细胞,来源于骨髓造血干细胞,通过吞噬、 产生抗体等 方式抵御、 清除入侵的病原微生物 ,是机体防御系统的重要组成部分。 单核细胞渗出血管 进入组织器官后 ,可进一步分化成为巨噬细胞。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞, 能够提 高抗原的免疫原性 、 主动吞噬外源性异物, 同时还能够分泌多种细胞因子, 激活 T 细胞等 免疫细胞, 以及释放多种高活性细胞毒介质,从而发挥其免疫调节作用。 灵芝多糖能够激 [ 28] 活脾单核细胞 , 促进其细胞增殖以及细胞因子的分泌 。 海藻多糖能够促进小鼠的巨噬细 [ 29] 胞 的 吞噬 功 能以 及 分泌 细 胞因 子 I L - 1 、 I F N - γ 等 , 增强 巨 噬细 胞 的免 疫 功能 。 猪 苓多 糖 能够 激活巨 噬细胞 ,增加 其吞噬 功能及 分泌 N O 和细 胞因子 I L - 6 、T N F - α ,从 而增加 其免 [ 30] 疫调节功能 。 4 对自然杀伤细胞(N K 细胞)的影响 N K 细胞是一类重要的非特异免疫细胞,具有自然杀伤活性和分泌细胞因子的功能, 可通过多种途径被活化 , 包括膜表面的 C D 2 、 C D 3 分子和多种细胞 因子 。 竹节参多糖能够 6暨 南大 学硕 士学 位论 文 N K I gM 提高外周血 细胞的比例, 促进脾细胞增殖能力及 抗体的分泌, 从而对免疫力低下 [ 31] 都较好的恢复作用 。枸杞多糖能够增加白细胞的数量 , 增强 N K 细胞的杀伤活性 , 对环 [ 32] 磷酰胺所致的 N K 细胞杀伤活性降低具有恢复作用 。 2. 1. 4 对细胞因子的影响 细胞因子是由免疫细胞产生的一类蛋白质或小分子多肽,具有在细胞间传递信息、 调 节免疫等功能。根据功能的不同,细胞因子可分为以下几类 : (1)白细胞介素(I L ) ; (2) 集落刺激因子( C S F ) ; (3)干扰素( I F N ) ; (4 )肿瘤坏死因子( T N F ) ; (5 )转化生长因 子- β 家族( T G F - β ) ; ( 6) 趋化因子家族(包括 C - X - C / α 和 C - C / β 两个亚族 ) ; (7)生长因子 (G F ) 等。 细胞因子通过结合相应的受体而发挥生物学作用 , 参与免疫应答与免疫调节作 [ 33] 用, 刺激细胞活化、 增殖和分化。 陈文青 等研究发现 , 螺旋藻多糖能够促进淋巴细胞的 增 殖 和 细 胞 因 子 I F N - γ 的 分 泌 , 从 而 发 挥 免 疫 调 节 功 能 。 蕨 麻 多 糖 能 够 提 高 巨 噬 细 胞 N O 及中性粒细胞 R O S 、M P O 的产量,增强单核 / 巨噬细胞的吞噬功能,显著提高免疫低下的 [ 34] 小鼠血清中溶菌酶和细胞因子 I F N - γ 和 I L - 6 的水平,拮抗环磷酰胺所导致的免疫抑制 。 2. 2 抗肿瘤活性 肿瘤是机体在各种因素的影响下,局部组织的某个细胞失去对其生长的正常调控, 导 致克隆性的异常增殖形成的。一般肿瘤分为良性和恶性两类, 其中后者已经严重威胁到人 类生命和健康 。常用的抗肿瘤药物主要包括烷化剂 、 抗代谢药物、抗生素、激素等,在发 挥疗效的同时也带来了较大的毒副作用。 相比而言, 多糖基本上无毒副作用, 安全性较高。 多糖主要是通过以下两个途径发挥其抗肿瘤活性的。 2. 2. 1 免疫调节 T 多糖的抗肿瘤活性与其对机体的增强免疫功能密切相关 , 主要途径包括: 激活 细胞、 B 细胞、巨噬细胞, 促进细胞因子的分泌 ,抗氧化等。 如枸杞多糖能够促进效应 T 细胞的 [ 35- 36 ] 增殖、树突状细胞的成熟以及巨噬细胞的吞噬作用,发挥抗肿瘤活性 。海藻硫酸多糖 能 够显著 提高 N K 细 胞活性 ,促进 T 细 胞的增 殖功能 ,因而 对 S 180 荷 瘤小鼠 具有一 定的 [ 37] 免疫调节功能 , 同氟尿嘧啶相比具有毒性小、 效果较好的优点 。 黄芪多糖能够提高荷瘤 小鼠血清中 T N F - α 和 I L - 2 的水平, 提高机体免疫功能 , 发挥抗肿瘤作用, 与传统化疗药相 [ 38] 比,细胞毒活性不明显,具有独特的优势 。 7暨 南大 学硕 士学 位论 文 2. 2. 2 对肿瘤细胞的抑制作用 多糖对肿瘤细胞的抑制作用是多途径的,主要包括:改变肿瘤细胞的结构; 抑制肿瘤 细胞的增殖 ;阻断其细胞周期 ,诱导细胞凋亡;抑制肿瘤细胞核酸、蛋白质的合成;抑制 血管的生成等。如黑木耳多糖对人红白血病 K 562 细胞没有直接的细胞毒 作用,但能够显 [ 39] 著的抑制肿瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,并阻断其细胞周期,使细胞停滞于 G 0/ G 1 期 。 Z ha ng M 等研究表明,枸杞多糖对人肝癌 Q G Y 7703 细胞具有抑制作用,能够抑制其增殖 过程,将其阻滞于 S 期;同时还能够增加细胞内的 C a 2+ 浓度及影响 C a 2+ 的分布,进而诱 [ 40] 导其凋亡 。 有些海藻类多糖与 D N A 拓扑异构酶?/ ?具有高度亲和力, 通过对其抑制作 [ 41] 用发挥抗肿瘤活性 。 综上所述 ,多糖具有较好的抗肿瘤活性,毒副作用小,安全性高, 与其他抗肿瘤药物 [ 42] 联用具有协同作用 ,具有较大的开发潜力。 2. 3 抗氧化活性 自由基是机体发生氧化反应时产生的有害物质,具有强氧化性, 常见的自由基主要是 2- 氧 自由基 ,如羟 自由基 O H 、 超氧阴 离子自 由基( O) 、 脂氧自 由 基、 一氧化 氮自由 基 N O 、 N O , 加上 H O 、 臭氧 和 单线 态 氧, 通 称为 活 性氧 。 过多 的 活性 氧 自由 基 会对 人 2 2 2 体组织和细胞产生破坏作用, 进而引发多种疾病及衰老效应。 降低自由基的途径主要包括: (1) 利用机体内自由基清除系统的功能, 清除多余的自由基 , 包括超氧化物岐化酶 (S O D ) 、 过氧化氢酶 (C A T ) 、 谷胱甘肽过氧化酶 (G S H ) 等酶类 , 可以催化活性氧自由基 , 使其发 生化学反应,活性降低,进而达到清除的目的。此外,机体内还有一些维生素 C 、维生素 E 、还原性谷胱甘肽等抗氧化剂。 (2)外源性抗氧化剂,如酚类、多糖等物质。 多糖可以直接作用于自由基,主要包括:与其发生氧化反应; 同时也可以间接地与金 属离子 (如产生活性氧所必须的 F e 2+ 、 C u2+ ) 发生络合反应以及作用于酶类 (S O D 、 C A T 等 ) 。如猴头菇多糖可以显著提高 S O D 和 C A T 的含量,降低丙二醛( M D A )的含量,具 [ 43] 有较好的抗氧化能力 。芦根多糖对羟基自由基和 D P P H 自由基具有较好 的清除能力 , 能 [ 44] 够有效地阻断亚硝胺的合成, 同时对亚硝酸钠具有一定的清除作用 。 枸杞多糖能够降低 [ 45] 血清中 M D A 及 N O 的含量 , 提高 S O D 的含量 。 海带多糖、 石斛多糖、 姬松茸多糖能够 [ 46- 48 ] 有效地清除自由基,具备一定的螯合金属离子能力和对多糖的还原力 。 8暨 南大 学硕 士学 位论 文 2. 4 抗病毒、抑菌活性 [ 49] 刘 石 生 等 通 过 体 外 细 胞 培 养 方 法 检 测 到 紫 球 藻 胞 外 多 糖 及 其 分 级 分 离 产 物 具 有 较 强的抗呼吸道病毒活性 ,并对宿主细胞的抑制作用不显著。 香菇多糖具有良好的抗病毒活 [ 50] [ 51] 性,并对病毒感染的细胞具有较强的保护作用 。苏育才 从海金沙中提取得到多糖, 并 对其抑菌活性进行了研究 。 研究结果表明, 海金沙多糖对稻瘟病病原菌和普通的变形杆菌 均有较好的抑制作用 。金樱子多糖对金黄色葡萄球菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、 白葡萄球 [ 52] 菌等均有一定的抑制作用 , 表明其具有较好的抑菌活性 。 壳聚糖对大肠杆菌的抑制作用 [ 53] 与其分子量的大小和浓度有关,其作用机制为对大肠杆菌的絮凝作用 。 2. 5 降血脂活性 高血脂是由体内脂肪代谢 、 运转异常引起血液中高密度脂蛋白胆固醇( H D L - C ) 过低 或胆固醇 (T C ) 、 甘油三酯 (T G ) 过高一种全身性疾病。 高血脂的直接危害是导致动脉粥 样硬化,同时也是促进糖尿病、高血压等疾病的危险因素。近年来,许多研究表明,多糖 具有降血脂活性 。 海蒿子多糖能够显著降低高血脂小鼠血清中的 T C 、 T G 含量, 改善脂肪 [ 54] 代谢, 其作用机制为海蒿子多糖与肠道内胆固醇、 胆汁酸的螯合作用 。 海带多糖对高血 [ 55] 脂小鼠血清中的 T C 、 T G 水平均有不同程度的降低作用 , 表明其具有较好的降血脂活性 。 白首 乌多糖 、枸杞 多糖能 够降低 血清中 T C 、 T G 水平 ,提高 H D L - C 水平 ,因而 具有一 定 [ 56- 57 ] 的降血脂作用 。 2. 6 其他 多糖除了具有上述生物活性外,还有抗疲劳、保肝作用、抗凝血、抗疲劳等作用。 如 [ 58] 绞股蓝多糖能够减轻 C C l 对小鼠肝脏细胞的损伤 , 具有保肝作用 。 A t h uko r a l a Y 等研究 4 [ 59] 表明,某些海藻多糖具有抗凝血作用 。 3 3 3 3 多糖的提取方法 为了充分地提取多糖 , 要根据多糖来源和提取部位的不同, 在提取之前需要考虑是否 进行预处理 。如动物多糖、 植物种子中的多糖常被脂质包围, 因此提取前需要采用有机溶 剂进行脱脂处理 。目前,多糖的提取方法较多,常用的有热水浸提法、 超声波辅助提取方 法、微波辅助提取方法、酶提取方法、稀碱(酸)提取方法、超临界 C O 2 萃 取方法等。 9暨 南大 学硕 士学 位论 文 3. 1 热水浸提法 热水浸提法遵循相似相容的原理,多糖为极性大分子化合物,在水中溶解度较好, 提 高温度会加大水对植物组织细胞的穿透力。因此,采用热水浸提法有利于多糖的提取, 同 [ 60] 时, 该法具有不需要特殊设备, 易于实现大生产等优点 。 李志洲 采用热水浸提法从淡竹 叶中提取多糖 ,以提取得到的多糖含量为考察指标, 通过正交试验考察了料液比、 P H 值、 提取温度、 提取时间 4 个因素, 优选出淡竹叶多糖的最佳提取条件。 该法成本低、 易控制 、 提取条件温和,节约了有机溶剂,因而该方法可行性较强。 3. 2 超声波辅助提取方法 超声波辅助 提取方法是近年来常用于提取中草药有效成分的新方法, 具有省时、 节能、 操作简便、 避免高温对有效成分的破坏等优点,其原理是利用超声波的机械作用、 热学作 [ 61] 用、 空化作用等对植物细胞的破碎作用 , 加速植物有效成分的溶出 、 扩 散 。 叶余原采用 超 声 波 辅 助 提 取 方 法 提 取 铁 皮 石 斛 多 糖 , 并 通 过 单 因 素 试 验 及 正 交 试 验 优 化 了 其 提 取 工 [ 62] 艺。 与常规水提方法相比, 超声波辅助 提取方法提取得到的多糖含量更高 。 贲永光等采 用超声波辅助 提取方法提取螺旋藻多糖,探讨了超声功率、料液比、提取温度、 提取时间 对多糖含量的影响。通过正交试验优选出最佳工艺条件,与传统方法相比,具有省时、 操 [ 63] 作简便、提取率高等优点 。 3. 3 微波辅助提取方法 微 波辅 助 提取 方 法的 原 理是 微 波能 作 用于 溶 剂, 并 穿过 细 胞壁 进 入细 胞 内部 , 使细 胞 内部温度提高 ,压力变大, 当压力增加到一定限度,细胞壁破裂, 细胞内的有效成分被释 [ 64] 放出来。 覃逸明 采用微波辅助提取方法从真姬菇中提取得到多糖, 通过单因素试验考察 了不同的料液比 、微波功率 、提取时间及提取次数对多糖提取效果的影响, 根据单因素试 验结果,确定正交试验因素水平,进行正交试验,得到最佳提取工艺条件。 与热水浸提法 [ 65] 相比, 具有省时、 节约溶剂的优点。 赖红芳等 采用微波辅助提取方法从扶芳藤中提取多 糖,并对其提取条件进行优化,最终得到最佳提取工艺条件:微波功率为 30w ,料液比为 1:50,提取时间 14m i n ,提取 4 次。 3. 4 酶法 酶法提取常用的酶有 : 蛋白酶,如中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶,具有除蛋白 1 0暨 南大 学硕 士学 位论 文 的作用;纤维素酶,其原理是破坏阻碍多糖溶出的细胞壁;果胶酶,其原理是分解果胶、 粘液质等在热水中易发生胶溶的物质,降低粘度。 由于每种酶的作用机理和提取部位结构 [ 66] 的不同, 常用的酶提法有: 单酶法和复合酶法 。 许静 等通过木瓜蛋白酶酶解的方法提取 [ 67] 海参脏器多糖,并优化了最佳酶解条件。王岩岩等 将纤维素酶应用于枸杞多糖的提取, [ 68] 为酶法在中药材的提取中的应用提供了参考依据。石奇 采用复合酶法提取大枣多糖, 大 大提高了多糖的得率及纯度,缩短了提取工艺周期,降低了成本。酶法提取效率高, 作用 条件温和, 不需要高温、 高压、 强酸、 强碱等条件。 但也存在一些弊端, 如酶自身对温度、 2+ 3+ P H 有特殊要求, 轻微的改变或者溶剂中存在抑制剂 (如 C u 、 A l 等金属离子) 可能会改 变其活性。 3. 5 超临界 C O 萃取技术 2 当温度和压力高于临界点时, 此时的 C O 处于介于液体和气体之间的状态, 为超临界 2 C O 2 , 具有极强的溶解能力 。 在超临界状态下,超临界 C O 可以将不同极性、沸点、 分子 2 量的待分离物质依次萃取出来, 影响因素主要是温度和压力 。 超临界 C O 萃取技术是近年 2 来新兴的提取分离技术,具有以下优点 : (1)C O 无毒、化学性质稳定、临界温度和临届 2 压力均较低 ,因而安全性较高 ,提取条件比较温和, 在提取有效成分的同时能保证其不被 破 坏 ; ( 2) 通过调 节温度 和压力 可以提 高有效 成分的 提取率 ,因而 具有操 作简便 的优点 ; ( 3)节 约了有 机溶剂 ,无溶 剂残留 问题, 因而超 临界 C O 萃取 技术是 一种高 效、环 保的 2 [ 69] 技术。 盛桂华等 采用超临界 C O 萃取技术提取桔梗多糖, 并通过响应曲面法优化其最佳 2 [ 70] C O 提取工艺,该工艺合理可行。赵子剑等 将超临界 2 萃取技术应用于茯苓多糖的提取, 通过正交试验优化得到其最佳提取工艺,操作简便, 为该技术在多糖提取中的应用提供了 参考依据。 三 处 方中 的药 材研 究进 展 1 1 1 1 山药 D i os c or e ae r hi z om a D i os c or e a oppos i t a T h unb. 山药( )为薯蓣科植物薯蓣( ) 的干燥根 茎,味甘、 性平,入肺、脾 、肾经,具有健脾益肺、 益气养阴等功效 , 是一种很好的药食 两用植物。 在我国,山药主产于河南、河北、山东、山西及中南、 西南等地区,其中尤以 古怀庆府(今河南焦作境内)所产山药名贵,被称为“ 怀山药 ” ,亦有 “ 怀参” 之称。 1 1暨 南大 学硕 士学 位论 文 1. 1 山药的化学成分 山 药中 含 有淀 粉 、蛋 白 质、 氨 基酸 、 多糖 ( 包括 糖 蛋白 和 黏液 质 ) 、 皂苷 、 黄酮 、 尿 囊素、微量元素等多种化学成分,这些是发挥其营养价值和药理活性的物质基础。 1. 2 药理活性研究进展 1. 2. 1 抗氧化活性 [ 71] 周 晓 薇 等 从 铁 棍 山 药 中 分 离 纯 化 得 到 两 个 蛋 白 质 组 分 , 并 研 究 了 其 体 外 抗 氧 化 活 2+ 性。研究结果表明,山药蛋白质具有较好的自由基清除作用及于 F e 的螯合作用,因而具 [ 72] 有显著的抗氧化活性 , 是一种潜在的抗氧化剂。 曹亚军等 对山药薯蓣皂苷的抗氧化活性 进行了研究 ,结果表明,薯蓣皂苷能明显提高衰老小鼠肝脏、 脑及血清中的超氧化物歧化 酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低丙二醛的含量, 因而山药中的薯蓣皂苷具有一定的 抗氧化活性。 1. 2. 2 免疫调节功能 [ 73] 徐增莱等 研究发现,淮山药多糖能够增强淋巴细胞的增殖能力,促进抗体的生成 , [ 74] 具有一定的免疫增强功能。赵国华等 探讨了山药多糖某一水溶性组分的免疫调节作用 , 结果表明, 该组分能够提高 T 细胞和 N K 细胞增殖能力 、 血清 I gG 的含量、 血清溶血素的 [ 75] 活性以及巨噬细胞的吞噬能力 。 因而该组分能够全面改善机体免疫功能 。 李金忠 采用超 声辅助提取方法提取得到山药糖蛋白, 通过测定血清溶血素及碳廓清实验考察了其免疫调 节功能。结果表明 ,高、低剂量组和对照组相比, 小鼠吞噬指数和胸腺器官指数两项指标 检测均为阳性,说明山药糖蛋白具有免疫调节作用。 1. 2. 3 降血糖活性 山药多糖能够降低四氧嘧啶所致的糖尿病大鼠的血糖水平, 提高糖尿病大鼠的耐糖量 [ 76] 及 C 肽值。 这种降血糖活性可能与其促进胰岛素的分泌 、 改善受损胰岛 B 细胞作用有关 。 [ 77] 何凤玲 分别从山药中提取分离得到多糖 、 黄酮、 皂苷等活性部位, 并探讨了各部位的降 糖活性。选用了糖尿病小鼠作为研究模型,分别探讨了各活性部位对 α - 葡萄糖苷酶的抑制 活性、对 H e pG 2 细胞增殖及降糖消耗的影响以及对糖尿病 “ 三多一少” 现象的改善情况 。 结 果表明,山药多糖、黄酮及皂苷类对 α - 葡萄糖苷酶均有一定的抑制活性,在相同剂量下, 1 2暨 南大 学硕 士学 位论 文 H e pG 2 皂苷类的抑制活性最强 , 并与剂量有关; 与山药多糖和黄酮相比