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基因组DNA抽提操作流程.doc

基因组DNA抽提操作流程

冷残影凌紫瑶
2017-09-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基因组DNA抽提操作流程doc》,可适用于综合领域

基因组DNA抽提操作流程一、原理与意义先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解然后用蛋白酶去除其中的蛋白再用氯仿一次抽提(无需用酚抽提)、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、GG-细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、SouthernBlot分析等。二、试剂及其配制抽提试剂盒购于上海生工公司内含以下试剂:TE缓冲液:PH由mMTrisHCl和mMEDTA配成。RNaseA(mg):使用前加入µl无菌双蒸水煮沸min后使其自然冷却后使用℃冻存。ProteinaseK(mg):使用前加入µl无菌水分装成小份℃冻存。CellLysisSolution与PrecipitationSolution:溶液出现絮状沉淀℃加热溶解后使用。molLNaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。三、实验器材水浴锅、普通冰箱、ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。四、操作步骤组织匀浆制备:取mg左右新鲜组织加lTE缓冲液手工匀浆数次。细胞裂解:吸取µl匀浆加µlCellLysisSolution混匀。消化蛋白:再加入µlProteinaseK(可适当增加)混匀置于℃水浴min以上(可达h)其间上下混匀几次。氯仿抽提:加入µl氯仿(用户自备)轻柔上下混匀不能太剧烈以保证DNA的完整性。沉淀:在台式离心机上转分室温离心min。此时应分成三层基因组DNA在上层中如未能分层表明样品与氯仿未混匀(可通过延长离心时间或增加离心速度获得上清)。取µl上清液置于无菌ml离心管中加入µlPrecipitationSolution混匀多次至出现絮状物室温静置min。转分离心min。去除RNA:弃除上清注意不要倒掉沉淀立即加入µlmolLNaCl轻轻振荡直至DNA样品完全溶解加入µlRNaseA置于℃min以去除RNA。沉淀DNA:加入µl冰冷乙醇(终浓度为%沉淀效果最佳)-℃放置min。,转分离心min。倒掉乙醇倒置室温干燥~min。若DNA量多可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或µl三蒸水溶解。五、注意事项应避免多次冻融样品因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。加氯仿充分混匀若离心后上清不到l可适当延长离心时间或增加离心速度。吸取DNA上清时可用剪刀稍剪枪头尖部以防止虹吸现象。操作步骤中许多数值可进行成比例改变如上清与预备液按:氯化钠与无水乙醇按:等。转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNAfree的基因组DNA。可在第步加入µl的RNaseA℃保温min即可。用分光光度计测量DNA含量按OD=g基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达kb以上的DNA。一般在DNA样品中ODOD比值大于可能存在RNAODOD比值小于可能存在蛋白质或酚。但RNA样品中ODOD比值小于可能存在蛋白质或酚均需要进一步纯化。通常µl体系PCR反应中用~µlDNA。

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