【doc】猪细小病毒分子诊断技术与基因工程疫苗研究进展

【doc】猪细小病毒分子诊断技术与基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 疫苗研究进展 猪细小病毒分子诊断技术与基因工程疫苗 研究进展 ? 54?AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2007Vo1.39No.2 ;j良. 寥毒j5.. 猪细小病毒分子诊断技术与基因工程 疫苗研究进展 周斌,刘祥,陈溥言 (1.南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京210095; 2.中国动物疫病预防控制中心,北京1OO6O) 摘要:猪细小病毒(PPV)最早是从培养细胞中发现并分离得到的一种小DNA病毒.研究表明,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之 一 ,而且能够引起多种猪病.随着对猪细小病毒研究的不断深入,目前已经在病毒病原学,结构与非结构蛋白,感染机制,诊断与疫苗防制等方 面取得很大进展.本文主要针对分子诊断新技术与基因工程疫苗防制等方面进行了阐述. 关键词i猪细小病毒;分子诊断;基因工程疫苗;防制 中图分类号i$858.284.57文献标识码:A文章编号:0529.5130(2007)02-0054.04 猪细小病毒(PorcineParvovirus,PPV)是引起猪繁殖障 碍的重要病原之一…,主要引起初产母猪不孕,流产,木乃 伊胎,死产,新生胎儿死亡和病毒血症,此外还引起皮炎和肠 炎.在配种后的前64d的各个阶段经子宫感染胎儿,导致胎 儿死亡和木乃伊,而对照无此症状.除怀孕母猪外,其他类型 的猪感染后均无明显临床症状-5].1966年Mary和Mahnel首 次于猪瘟病毒组织中分离到该病毒并证实了其病原作用.此后 在欧,美,亚,非及大洋洲很多国家均有报道J.我国于 1982年由中国兽药监察所分离到该病毒,此后在上海,黑龙 江,吉林,四川,浙江等地均分离到该病毒,虽然各地分离的 PPV来源不同,名称各异,但均为同一型,血清学上无差别. 近年来,随着养猪业的发展,大型集约化猪场的相继出现,该 病的发生呈上升趋势. 1病毒的分子检测技术 自1967年,Cartwright等首次报道PPV病以来,有关该病 诊断 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的研究报告较多,从最初的病毒分离鉴定,到血凝及 血凝抑制试验,酶联免疫吸附试验等免疫学方法,直到核酸探 针,聚合酶链式反应等分子生物学技术. 1.1PCR检测技术 Moliter等根据PPV基因组序列设计了一对引物,扩增 VP2基因中158bp的片段,利用酶切和探针杂交证实了扩增 产物的特异性,同时对四株PPV及CPV,PRV的扩增结果进 一 步证实了PCR反应的特异性,该方法至少可以检出100fs 的PPVDNA,相当于1PFU的PPV量.Gradil等应用PCR 技术检测猪试管胎儿,将胎儿孵育在PPV病毒液中,4d时检 测不出有PPV感染,但将其移植到猪体内第15d和第32d都 可检测到病毒核酸.引物除选择在PPV的结构基因区域外, SoaresRM等在NS.1的保守区选择引物,用于检测感染细胞 收稿日期:2006.07-26 基金项目:国家863 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目资助(2001AA249012). 作者简介:周斌(1977-),男,讲师,在职博士研究生. 系和临床样品,其敏感性比HA高100倍.国内李文刚等 报道在VP1基因上选择引物,进行PCR检测,能检出10fg的 模板DNA.王汉中等应用套式PCR检测到1TCID50的病毒 量,比一般PCR敏感100倍.赵俊龙等等在PPV基因组的 上游设计了1个引物,从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增 出445bp片段,回收该片段用EcoRI酶切得到了125bp和320 bp2个片段,证实了该扩增片段的特异性,该方法可以检测出 10I4个TCID的病毒含量.另外,鉴于目前混合感染的出现, 国内外学者建立了能同时检测PPV与猪的其他重大疫病(猪 瘟,猪呼吸与繁殖综合征,猪伪狂犬病等)多重PCR方法. 1.2核酸探针检测技术 核酸探针技术是利用碱基互补原理来检测目的同源核苷酸 片段,具有敏感性高,特异性强的特点.随着分子生物学技术 的发展,核酸探针技术被广泛地应用于各领域,如疾病诊断, 特别是病毒病的诊断,基因杂交及文库筛选等. KreU等(1988)率先将核酸探针技术应用于PPV的诊 断,他们将以PPVRFDNA酶切得来的3.0kb的DNA片段用 放射性同位素标记后作为探针通过打点杂交检测培养细胞中的 PPV.结果发现最低可检测0.1PgDNA.与HA的比较结果表 明,该方法比HA敏感100倍以上.KoromyslovG等 (199o)报道DNA探针能检出实验感染大母猪的木乃伊胎儿 内脏悬液中的PPV.Oraveera—kul等报道利用非放射性标记 探针检测培养细胞和胎儿组织中PPVDNA,其敏感性比IFA 高10,100倍.Lin等(1993)以PPV的非结构蛋白NS1, VP,VP2和vP结构蛋白为基础构建了3组探针iP/P2, P3/P,和P,/P6;并用这3组探针检测3株PPV(NADL一2, NADL-8和9oILS),灵敏度最高的是针对NS1构建的探针. 吴保成等(1992)对PPVRFDNA的HindIII和PstI片 段,进行生物素标记后用作探针进行斑点杂交.结果发现,该 探针能检测到约100Pg的PPVDNA.侯喜林等(1997)同 样利用PPVDNA的HindIII和PstI片段进行地高辛标记后用作 探针检测PPVDNA,结果能与其自行分离的7株PPV毒株的 DNA杂交,最低检出限量为40PgDNA.之后,1998年用PUP 畜牧与兽医2007年第39卷第2期?55? 探针(即PPV-RF-DNA经PstI/HindlII双酶切后的C片段,克 隆到PUC19后的重组质粒PUP,经地高辛标记后制成的探针) 对PPV细胞素及其自然感染病料和对照材料检测.PUP探针 只与PPVDNA杂交显色,而与具有类症的其他病毒核酸不能 杂交显色,且与HA和生物素标记探针的检测结果一致.且对 猪瘟病毒,猪伪狂犬病毒和乙型脑炎病毒呈阴性,检出PPV DNA限量为40Pg.黄海波报道用于探针的DNA杂交以1 — 6kb最为适宜,过长的DNA易于断裂,缺失并有自我折叠 的可能,过小的DNA杂交时产生假阳性.KimJ等.加报道, 用不同的标记PCV-2和PPV探针,同时检测患多系统衰竭综 合征和实验接种猪的淋巴结及脾等组织,不仅可以同时诊断两 种病原体,而且可进一步了解多系统衰竭综合征的发病机理. 白红光等根据PPV基因组序列,设计引物克隆了PPVYK 株保守序列NS1基因,利用地高辛标记制备了NS1基因PCR 产物探针和克隆NS1探针,两种核酸探针的标记都达到了 0.1pg/IxL.特异性试验结果表明,这两种探针都能与PPV DNA发生特异的阳性杂交,而与对照的PRV,PCV,PRRSV 和HCV的核酸杂交呈阴性.敏感性试验结果表明,克隆NS1 探针敏感度为0.5pg/IxL,NS1基因PCR产物探针敏感度为 Ipg/'IxL.综上所述,这两种DIG标记探针特异性强,敏感性 高,可用于PPV的检测. 1.3基因工程重组亚单位诊断抗原技术 随着分子生物学的飞速发展,新型诊断技术不断涌现,与 之相配套的生物技术诊断制剂也应运而生,尤其是基于分子水 平的诊断制剂发展迅猛,而近年来以基因工程重组表达抗原作 为诊断制剂建立的诊断新技术已显示出独特的优越性.基因工 程重组表达产物是用DNA重组技术,将编码特定抗原的基因 插入原核或真核表达质粒,再转入宿主细胞中使其高效表达, 然后运用生物化学,纯化技术,提取表达产物等,最终制成诊 断用重组表达抗原或抗体. VP2蛋白是PPV的主要中和抗原,可诱导机体产生较高 水平和持续时间较长的抗体,因此具有较高的诊断意义.李斐 等克隆了VP2蛋白主要抗原表位基因VP2I基因,构建了 重组质粒PET2VP2I,转化宿主菌BL21,利用IPTG (1mmol/L)诱导实现了PET2VP2I蛋白主要抗原域VP2I融 合蛋白的高效表达.Westernblot检测证明表达的重组蛋白具有 良好的免疫学活性.表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊 断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法,并应用 于临床样品的检测.任雪枫等将VP2蛋白主要抗原表位基 因VP2I基因插入真核表达载体pIREShyg,转染CHO细胞经 潮霉素筛选,所有得到的阳性克隆经间接免疫荧光鉴定均表达 目的基因,建立了稳定表达VP2蛋白的细胞株,可在一定程 度上取代全病毒作为抗原的作用,给PPV的研究带来较多方 便,为探索新的血清学诊断方法打下基础. 2基因工程疫苗的研究 研究表明,尽管PPV的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒病 的预防控制中起到了十分重要的作用,但是各种疫苗均有不同 程度的缺陷和不足,如弱毒疫苗发生重组及毒力返强的潜在威 胁,以及灭活疫苗免疫效果不稳定等.因此,研究和开发更为 安全有效的基因工程疫苗将成为猪细小病毒病免疫预防研究的 主 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 与热点. 2.1基因工程亚单位疫苗 用基因工程的方法生产PPV亚单位疫苗是一条可解决上 述问题的较好途径.因为细小病毒的免疫主要是体液免疫,可 以采用颗粒性的亚单位疫苗来免疫.再者细小病毒的基因组较 小,也容易在载体上获得表达.加之细小病毒的衣壳蛋白在体 外表达时可自主装配,能自动形成完整的病毒样颗粒,并且具 有较好的免疫原性,如果用活病毒载体来表达,将有更广阔的 前景. 2.1.1PPVVP2基因作为亚单位蛋白 Casal等选取PPVVP2基因的纯编码部分1740bp,重组 了抗PPV的亚单位疫苗.但该类疫苗由于存在生产成本高, 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 复杂(蛋白质纯化困难),免疫剂量大,需要借助特殊的 佐剂或载体,不能有效防止PPV传播等缺陷使其发展较慢. 2.1.2PPVVP2基因表达形成的类病毒样颗粒作为抗原形成 新型亚单位蛋白 Martinez等将PPVVP2基因克隆到杆状病毒表达系统 中,并成功地在昆虫细胞中高效表达,表达的VP2多肽能自 我装配成类病毒粒子(Virus-LikeParticles,VLPs),其CsC1密 度梯度离心的密度(1.30g/L)均与病毒空壳粒子相似,纯化 的VLPs与病毒粒子具有相似的血凝特性,电镜下其形态与病 毒粒子相似,在环境中抵抗力强.仅1—3的量并且不用佐 剂就可产生抵御疾病的免疫力.并且,这些VLPs可大量产 生,易纯化(硫酸胺),4?保存稳定,保存期长.非复制型 细小病毒颗粒携带插入多肽结构稳定,免疫效果好.可将B 细胞和T细胞免疫因子同时重组于一个VLPs上,为发展同时 抗一个或多个病原的疫苗开辟了新的思路.国内吕建强等 将VP2基因重组到杆状病毒lac-To-Bac表达系统的pFastBacI 质粒中,构建了pFast—VP2质粒.转染Sf9细胞得到重组病毒 AcNPV-VP2.证实表达的VP2蛋白具有与全病毒相同的血凝 活性和相似的抗原性.电镜观察VP2蛋白的粗提物,发现VP2 蛋白可自行装配成许多病毒样粒子(VLPs). 2.1.3基因工程多价亚单位疫苗 Sedlik等将PPVVP2和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病 毒(LCMV)的118-32位氨基酸的抗原决定簇区相连,然后克 隆到杆状病毒表达载体PACYM,转染表达PPv:VP'.LCMV 蛋白,利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应,在 体内持续时间长达9个月,并可抵抗致死量的LCMV攻击.之 后,又将LCMV的CD8T细胞抗原决定簇多肽共价结合于1 pm的脂质微球上,与上述表达的PPV-VP2一LCMV蛋白一起进 行了免疫小鼠的比较,结果发现二者都能诱导产生很强的 CD8T细胞反应.但PPV.VP2-LCMV携带的抗原量比脂质体 微球少100倍时,诱导的CTL活性仍比脂质体微球诱导的CTL 活性高6倍,并且只有PPV.VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死 量的LCMV的攻击.Richard等(1998)用PPVVP2共价结合 乙肝病毒HBsAg的抗原决定簇区多肽,免疫小鼠诱导产生了 很强的针对插入的HBSAg决定簇的T细胞反应,并能抵抗乙 ? 56?AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine2007Vo1.39No.2 肝病毒的致死性攻击.这些结果均说明PPVVP2类病毒粒子, 作为一种抗原的转运载体具有很大的潜在价值,并为进行多价 重组疫苗的研究创造了良好的条件. PRV和PPV在临床上经常混合感染的现象已有报导J, 因此研制出这二种病毒的重组疫苗对生产实践也具有重要意 义.鉴于PPVVP基因的良好免疫原性,将其插入到PRV载 体中,有望研制出理想的PPV.PRV二价重组基因工程疫苗. 吕建强等实现了表达了猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬 病毒的构建,并对其生物学特征进行了研究.试验发现VP2 基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相 当,不导致小鼠发病,适合疫苗生产的要求.该研究为猪细小 病毒和伪狂犬二价重组活疫苗的研制奠定了坚实的基础. 2.2基因疫苗 基因免疫又称核酸免疫,是由Wolff和Feigner于1990年 偶然发现的,这种能够在体内表达外源蛋白,刺激机体产生免 疫应答的核酸称为核酸疫苗,包括DNA和RNA疫苗.赵俊龙 等进行了有关PPV核酸疫苗的研究,动物试验初步表明, 以PPV结构基因VP1和VP2分别构建的核酸疫苗,均能诱导 产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,比常规灭活疫苗产生的 高.崔保安等将IL-2与猪细小病毒VP2基因同时克隆在真 核载体里,形成真核双表达载体来探讨核酸疫苗的免疫效果. 结果显示:不仅增强了猪抗体的产生,同时还能够增强淋巴细 胞的增殖能力,提高淋巴细胞抗毒性作用,特别能够显着提高 B淋巴细胞的增殖.核酸疫苗的生产简便,成本低廉,预示着 其具有理想的应用前景. 2.3转基因植物可饲疫苗 转基因植物可饲(食)疫苗是在20世纪80年代,利用植 物基因工程技术创造转基因植物的基础上发展起来的.首先进 行转基因植物可饲(食)疫苗研究的是Curtiss和Cardineau, 他们以专利的形式发表了他们的第一篇报道.正是基于这一 点,有望开发出PPV转基因植物可饲疫苗,因为PPV的VP2 基因表达后能自我形成类病毒粒子,这对保持其免疫原性是非 常重要的.另外,VP2基因表达的类病毒粒子可以作为其他抗 原的转运载体,这为开发多价的转基因植物疫苗提供了条件. 参考文献: [1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版 社,1997:1148?1150. [2]侯世宽.猪细小病毒Mu.1株的分离鉴定[J].中国人民解放 军兽医大学,1984,3(4):321-328. [3]潘雪珠.猪细小病毒S-1毒株的分离和鉴定(二)[J].上海 畜牧兽医通讯,1984,(1):5-8. 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(1.东北农业大学动物科技学院,黑龙江哈尔滨150030; 2.中国刑警学院警犬技术系,辽宁沈阳110034;3.黑龙江省农科院,黑龙江哈尔滨 150086) 摘要:本文简述了毕赤氏酵母作为外源蛋白表达系统所具有的优越性,以及常规的 试验流程,论述了该系统在表达外源蛋白时存在的缺陷并针对 这些缺陷提出了相应的对策. 关键词:毕赤酵母;外源蛋白;表达 0057—03 中图分类号:Q949.326.1文献标识码:A文章编号:0529-5130(2007)02—随着分子生物学研究进入到后基因组时代,人们的注意力 越来越多地转移到蛋白质的结构和功能方面,通过基因工程技 术生产功能蛋白愈来愈受到重视.酵母工程菌以其其他表达系 统无法比拟的优越性得到了广泛的应用.许多研究者利用重组 DNA技术,克隆技术及酵母表达系统将外源基因在酵母中进 行了高效表达.毕赤酵母表达系统是在上世纪80年代末发展 起来的用以替代酿酒酵母表达系统的一种外源蛋白表达系统. 自它问世以来就得到了广泛的应用. 1宿主菌和表达载体 巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)属子囊菌类,为单倍体. 表达株均来源于NRRL(NorthernRe~onMResearchLaborato— ries).Y11430.多数具有一个或多个营养缺陷型突变,以利于 表达载体转化时筛选.用于转化适合酵母宿主细胞的表达载体 均为大肠杆菌和酵母菌的"穿梭"质粒,由来自酵母的部分 基因序列和细菌的部分基因序列所组成. 所有的表达载体均包含以下几个基本组件:5乙醇氧化酶 基因(AOX1)启动子片段,多克隆位点(MCS),转录终止 和polyA形成基因序列(TT),筛选标记(His4或Zeocin),3 .如果 AOX1基因片段,还有部分pBR322质粒或COLE1序列收稿日期:2005-12-15 基金项目:黑龙江省攻关资助项目(GBO1B04). 作者简介:丁镌(1979-),女,硕士研究生. 通讯作者. 是分泌型表达载体,在多克隆位点的前面,外源基因的5端和 启动子的3端之间插入了分泌作用的信号肽序列(Ot—mating factor,MF).可将外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和 加工后由胞内转移至胞外,将成熟的蛋白质分泌到细胞外. 酵母表达系统的载体主要分为附加型和整合型.附加型载 体能够独立于酵母染色体外自主复制,但是不稳定,在传代过 程中易丢失,影响重组菌的稳定性和表达量.所以,利用这种 质粒,必需筛选稳定的整合子.整合型载体,可以与酵母宿主 细胞的染色体基因组DNA发生同源重组,能够保证重组菌株 的稳定性,表达载体经过不同的酶切,线性化后,整合于酵母 基因组中的AOXl或HIS4基因的位置,能在酵母中稳定存在. 整合的方式可以是单交换(singlecwss—over)插入,亦可以是 双交换(doublecross—over)置换,一般来说前一种方式更容易 发生…. 2毕赤酵母表达载体的优越性 酵母作为一种最简单的单细胞真核生物,兼有原核生物和 真核生物的某些优点.毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似. 这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同,从而节省 了重新购置设备和进行新技术探索的巨额花费,这是用其他方 法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势.现将 毕赤酵母表达系统优点概括如下:?毕赤酵母更接近高等真核 细胞,不含内毒素和其他有害物质,使用安全;?同酿酒酵母 一 样,繁殖速度快,对培养条件要求低,培养基价廉,能进行 高密度培养,且能耐受较高的液体静压,便于工业化生产; [25]吕建强,陈焕春,赵俊龙,等.猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细 胞中的表达及其特性[J].微生物,2002,42(6): 675.679. 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