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首页 【doc】表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用

【doc】表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用.doc

【doc】表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞D…

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2018-02-03 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《【doc】表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用doc》,可适用于社会民生领域

【doc】表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用茶叶科学,():,JournalofTeaScience表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理后张氏肝细胞DNA损伤的保护作用黄秀华,张丹,邓国兵,杨足君,任正隆(电子科技大学生命科学与技术学院分子生物学实验室,四川成都成都恩威集团四川恩威中医药研究开发有限公司药理室,四川成都)摘要:采用MTT法,Cometassay(彗星实验)和流式细胞分析法研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对卡莫司汀引起的张氏肝细胞DNA损伤的保护作用及其机制结果表明:EGCG能阻止卡莫司汀所致张氏肝细胞的生长抑制,卡莫司汀单用对张氏肝细胞的Ico为lagml,当用无毒浓度ggml和~gml的EGCG与卡莫司汀联用时,对张氏肝细胞的ICo分别提高至~glml和agml彗星分析结果表明EGCG还能减小卡莫司汀引起的张氏肝细胞DNA损伤,彗星Olive尾矩值由单用时的降为联用时的士EGCG还能减小卡莫司汀所致张氏肝细胞的早期凋亡率,ml的EGCG和Oml的卡莫司汀联合,早期凋亡率分别从(),O(),()处理,h和h时降至(),(),()说明EGCG能保护卡莫司汀对正常肝细胞的杀伤,其机理是它能减少这类药物引起的细胞DNA损伤,降低卡莫司汀所致细胞早期凋亡关键词:EGCG卡莫司汀DNA损伤彗星实验流式细胞分析法凋亡IC中图分类号:$Q文献标识码:A文章编号:x()()EpigallcatechinGallate(EGCG)ProtectsChangLiverCellfromCarmustineinducedDNADamageHUANGXiuhua,ZHANGDan,DENGGuobing,YANGZujun,RENZhengong(TheLabofMolecularBiology,CollegeofLifeSicenceandTechnology,UniversityofElectronicScienceandTechnology,Chengdu,ChinaTheLaboratoryofpharmacology,sichuanenweiinstituteoftradidonalChinesemedicme,EnweiGroup,Chengdu,China)Abstract:Theprotectiveeffectandmechanismof()一epiga】locatechingallate(EGCG)combinedwithcarmustineontheDNAdamageofChanglivercellswereevaluatedbyMTTassay,flowcytometricassayandCometassayrespectivelyTheresultsshowedthatEGCGcanpreventthegrowthinhibitioncausedbycarmustine,theinhibitoryconcentration(IC)ofcarmustinetoChanglivercellswaspgml,whileitiscombinedwithEGCG(pgmland~tgml,theconcentrationunderwhichEGCGhasnogrowthinhibitiontoChanglivercells),theICotoChanglivercellsincreasedtotagmlandggmlrespectivelyEGCGalsodecreasedcarmustineinducedDNAdamageinChanglivercellsaccordingtoCometassayresultsTheOlivetailmomentdecreasedfrom士toEGCGalsodecreasedtheapoptosispercentagesofChanglivercellscausedbycarmustineAfterChanglivercellstreatedwithEGCG(~tgm)andcarmustine(pgm)forh,handh,theapoptosispercentagedecreasefrom(),(),O()to(),(),()respectivelyTheseresultssuggestthatEGCGcanprotectthehumannormalliverceilsfromtheethalactionbycarmustineThemechanismistheEGCGpossesstheactivityofdecreasingtheDNAdamagecausedbytheseagentsandtheapoptosis收稿日期:修订日期:作者简介:黄秀华(o),女,重庆粱平人,博士生,助理研究员,主要从事抗菌抗肿瘤和基因毒性方面的研究十通讯作者:renzluestceduca期黄秀华,等:表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理percentagecausedbycarmustineKeywords:EGCG,carmustine,DNAdamage,cometassay,flowcytometricassay,apoptosis,ICo烷化剂已被广泛用于抗肿瘤治疗,卡莫司汀就是其中一种然而这些抗肿瘤药物都有很大的副作用,其中就有致突变性,因为烷化剂能对细胞的DNA直接产生损伤…很多研究表明茶叶提取物能改善细胞所受的DNA损伤,减少致癌物的致突变性【】有研究表明饮料中含的绿茶可保护硝基丙烷引起的大鼠肝细胞DNA的氧化性损伤及其它肝毒性】目前国内外茶叶及提取物对DNA损伤修复的影响研究主要集中在其抗氧化作用上,包括抑制氧化产物的产生,诱导II相解毒酶的产生,对氧化剂或硝化剂引起的细胞周期和凋亡的影响及相关蛋白表达的影响】,对茶叶提取物减少烷化剂所致基因毒性及其机制的研究较少表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为绿茶主要活性成分,具有抗突变,抗氧化,抗病毒,调节机体免疫功能,诱导肿瘤细胞凋亡及光保护等作用【】本实验旨在研究EGCG对卡莫司汀处理后人正常肝细胞DNA损伤的保护作用材料和方法药品与材料表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自Sigma公司,MEM和小牛血清购自Hyclone(UT,USA),卡莫司汀为天津金耀氨基酸有限公司产品,低熔点琼脂糖购自Promega公司,正常熔点琼脂糖购自英国Oxoid公司,溴化乙锭购自Sigma公司PIAnnexinv凋亡双染试剂盒购自Sigma公司张氏肝细胞,为人正常肝细胞,购自中国科学院上海生命科学院细胞库流式细胞仪,BD公司产品细胞培养人正常肝细胞张氏肝细胞培养于含体积分数Jx牛血清,Lglutamine,×UL青霉素和mgL链霉素的MEM培养液,在,CO培养箱培养体外药物敏感试验取处于对数生长期的张氏肝细胞,用胰酶消化,制成X个ml的单细胞悬液,接种于孔培养板(X个孔,l孔),培养h后,弃去原培养液,分别加入系列对倍稀释的EGCG,卡莫司汀及二者混合液,使单用及联用时卡莫司汀终浓度分别为,,,,,pgml和~tgml:单用时EGCG终浓度分别为,,,,pgml和lagml混合液中EGCG终浓度分别为pgml和lagml每个浓度设个复孑L,同时设个细胞对照孔和个空白对照孔将孔板置于,CO培养箱中培养h后,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗次,然后每孔加入lal新鲜培养液和OlalMTT溶液(mgm),继续培养h后,弃去上清液,每孑L加入lalDMSO溶解,充分振荡混匀后,用酶标仪于nm波长处检测,去空白OD值,由OD值计算抑制率,公式为:细胞生长抑制率IR=(对照组OD值实验组OD值)对照组ODX半数抑制系数IC=细胞生长抑制率为的药物浓度,并Ico软件求得Ico值彗星实验(cometassay)检测DNA损伤将处于对数生长期的张氏肝细胞用胰酶消化,制成X个ml的单细胞悬液,试验设对照组,单用EGCG组,单用卡莫司汀组和EGCG与卡莫司汀联用组单用EGCG组和EGCG与卡莫司汀联用组分别,一茶叶科学卷加入终浓度为~gml的EGCG预先与细胞处理min,再向单用卡莫司汀组和EGCG与卡莫司汀联用组加入终浓度为~gml的卡莫司汀处理h,rmin离心min收集细胞,PBS洗次,悬于PBS中,水浴备用用正常融点的琼脂糖在载玻片上铺胶,待胶凝固后,再用含有×细胞的l的低融点的琼脂糖铺胶cC放置min,将载玻片置于新鲜配制的细胞裂解应用液中~C避光裂解h,取出玻片,用PBS充分清洗后置于含新鲜配制碱性电泳缓冲液的电泳槽中,液面高于玻片cm以上,避光解旋min,然后用V,mA的电流电泳min,取出载玻片,用PBS浸泡洗涤次,每次min,滴加l浓度为~gml的溴化乙啶染色rain,用细流水冲片后,于Olympus荧光显微镜下观察,计数个细胞中拖尾细胞数,并用DPcontroller成像系统照相,最后用CASP分析软件分析个拖尾细胞彗星尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)的变化流式细胞法检测细胞凋亡将处于对数生长期的张氏肝细胞用胰酶消化,制成×个ml的单细胞悬液,试验设对照组,单用EGCG组,单用卡莫司汀组和EGCG与卡莫司汀联用组,加人终浓度分别为~gml的EGCG和~gml的卡莫司汀进行单独或联合处理,作用时间有,,,h和h,然后rmin离心min收集细胞,PBS洗次,细胞悬于PIAnnexinv凋亡双染试剂盒中的缓冲液中,浓度为×个ml,目筛网过滤,准确吸取Oml细胞悬液于上样管中,再加入lAnnexinvFTC和PI染液,室温避光染色min,流式细胞仪上检测,用CellQuest软件获取个细胞,然后用该软件分析AnnexinvFITC和PI均低染,AnnexinvFITC高染和AnnexinvFITC和PI均高染的细胞百分率,分别代表了活细胞,早期凋亡细胞及死亡细胞的百分率结果EGCG对张氏肝细胞的细胞毒作用系列浓度EGCG对张氏肝细胞处理h后,经MTT检测结果表明EGCG在o~gml以下对张氏肝细胞的生长抑制率小于,故本试验选择agml和lagml进行以下试验EGCG与卡莫司汀联用对张氏肝细胞生长抑制作用的影响卡莫司汀单用及~gml和~gmlEGCG与卡莫司汀联用对张氏肝细胞处理h后,经MTT检测结果表明~gml和~gmlEGCG均能显着降低卡莫司汀对张氏肝细胞的生长抑制作用,分别使卡莫司汀对张氏肝细胞的IC从~gml升至~tgml(P)和~gml(见表)EGCG与卡莫司汀联用对张氏肝细胞DNA损伤的影响卡莫司汀,EGCG单用及二者联用对×O个rnl的张氏肝细胞悬液处理后,经彗星实验检测表明,gtgml的EGCG单独处理张氏肝细胞后,细胞出现拖尾,尾矩和Olive尾矩值分别为t和(与对照组比,P)pgml的卡莫司汀单独处理张氏肝细胞后,细胞出现拖尾,尾矩和Olive尾矩值分别为和(与对照组比,P与EGCG组比较,P)二者联用处理张氏肝细胞后,细胞出现拖尾,尾矩和Olive尾矩值分别为和(与对照组比,POO与EGCG,卡莫司汀组比较,P)表明EGCG能减小卡莫司汀对人正常肝细胞造成的DNA损伤EGCG与卡莫司汀联用对张氏肝细胞早期凋亡率的影响×卡莫司汀,EGCG单用及二者联用对ml的张氏肝细胞处理,,,h和h,用PIAnnexinv凋亡双染试剂盒染色,经期黄秀华,等:表没食子儿茶素没食子酸酯对卡莫司汀处理……,一流式细胞仪检测得其早期凋亡率,结果见表~gml的卡莫司汀组早期凋亡率均明显大于对照组(P或POO),~gml的EGCG和pgml的卡莫司汀联合处理组的早期凋亡率与卡莫司汀组比较均有降低趋势,其中,h和h时,早期凋亡率分别从O(),(),O()降至(),(),(),均有显着性差异(P或P),而h时的早期凋亡率与对照组比,已无明显差异(P),表明EGCG能降低卡莫司汀所致张氏肝细胞的早期凋亡率讨论卡莫司汀作为烷化剂能与细胞DNA直接发生作用,在DNA分子上形成加合物,并可能导致基因突变,具有潜在的基因毒性,而EGCG具有多羟基结构,能有效清除自由基,表EGCG与卡莫司汀联用对张氏肝细胞的生长抑制作用影响TableTheeffectof()一epigallocatechingallate(EGCG)combinedwithcarmustineonthegrowthinhibitionofChanglivercells注:与卡莫司汀组比较,':PNote:Comparedwiththecarmustinegroup:P表张氏肝细胞经EGCG与卡莫司汀处理后彗星尾矩值的变化TableTheChangeofComettailmomentonChanglivercellsaftertreatingwithcarmustinecombinedwithEGCG组别omu一三live砌~M…R纽胞ate注:与对照组比较,:P,十:P与EGCG组比较,黼:PO与卡莫司汀组比较,':PNote:ComparedwithCK,:P:PComparedwiththeBGoGgroup襻挣:PComparedwiththecarmustinegroup,':P,一茶叶科学卷表张氏肝细胞经EGCG与卡莫司汀处理后早期凋亡率的变化(n=)TableThechangeoftheapoptosispercentagesofChanglivercellscausedbyEGCGandcarmustine(n=)组别up浓度(pg,)早期凋亡率()Thp叩iPrc"g()'Concentrationhhhhh注:与对照组比较,:P,}:P与EGCG组比较,槲:P与卡莫司汀组比较,:PNote:ComparedwithCK,:P,:POOComparedwiththeEGCGgroup,柑:POComparedwiththecarmustinegroup,:PO可以保护正常细胞DNA免受辐射和氧化损伤,预防其向肿瘤细胞转化,它也可以抑制烷化剂在DNA分子上形成加合物,从而抑制癌的形成同时,EGCG具有减少致癌物基因毒性的作用,茶叶提取物能减少顺铂的致突变作用,也能减少亚砷钠对V细胞的染色体畸变口J,EGCG持续存在可减少博来霉素对初级淋巴细胞造成的DNA损伤JEGCG可通过诱导IL而产生阻止UVB一诱导的免疫抑制作用,从而阻止小鼠体内的潜在致癌性】,EGCG能影响负责致癌过程中的许多蛋白质和基因,如NFKB和P,而PARP一与NFKB和P密切相关,PARPl又是DNA断裂条件下催化核蛋白多聚(ADP核糖基)化的主要酶,可协调细胞损伤修复与凋亡,避免修复损伤严重的细胞,防止诱发突变,所以EGCG可通过诱发细胞多聚(ADP核糖)化参与DNA损伤修复【l叭邱志群等【用绿茶浸出液与有机提取物以不同方式处理(同时处理,绿茶预处理,绿茶后处理)大鼠肝细胞发现绿茶浸出液对水中有机提取物致肝细胞DNA的损伤有保护作用本研究结果也表明EGCG能减少烷化剂卡莫司汀对正常细胞的早期凋亡率,彗星尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM),表明EGCG对卡莫司汀处理后人正常肝细胞的DNA损伤具有保护作用机体对已造成的DNA损伤有多种保护措施,DNA修复酶的参与就是其中一种,DNA损伤和修复涉及了大约种基因和多种酶的参与,比如o一甲基鸟嘌呤一DNA甲基转移酶(MGMT)就是机体修复烷化损伤的关键酶,所以EGCG与这些酶之间的关系还有待进一步研究参考文献:【】陆瑞芳茶提取物与抗癌的实验研究J】自然杂志,,l():【】邱志群,舒为群,田怀军,等绿茶浸出液对水中有机污染物致DNA损伤的抑制作用【J环境与健康杂志,,O():【】SinhaD,BhattacharyaRK,SiddiqiM,etaAmeliorationofsodiumarseniteinducedclastogenicitybyteaextractsinChinesehamstervcellsJJEnvironPatholToxicolOnco():f】DanielaErba,PauiziaRiso,AnnaColombo,etalSupplementationofJurkatTCellswithGreenTeaExtractDecreasesOxidativeDamageDuetoIronTreatment【JJNutr():】黄晴,吴立军,路平,等儿茶素对tBHP诱导N细胞DNA损伤的保护作用中国药理学通讯,,():l【】陈科EGCG的特性及抗肿瘤作用J美国中华临床医学杂志,,():~【】陈宗懋茶多酚类化合物抗癌的生物化学和分子生物学基础…茶叶科学,,():,】GleiM,PoolZobelBLThemaincatechinofgreentea,()一epigallocatechin一gallate(EGCG),reducesbleomycininducedDNAdamageinhumanleucocytesJToxicolInVitro,,():~【】MeeranSM,SudheerKMantena,CraigAElmets,eta()Epigallocatechingallatepreventsphotocarcinogenesisinmicethrougllinterleukin一dependentDNArepairJCancerRes,,():】BertramB,BollowU,RajeeBehbahaniN,etaInductionofpoly(ADPribosy)ationandDNAdamageinhumanperipherallymphocytesaftertreatmentwith(一)epigallocatechingallateJMutatRes,,():

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