深圳大学生物光子学讲义

深圳大学生物光子学讲义 屈军乐、林丹樱、许改霞、 于斌、邵永红等 编著 深圳大学光电工程学院 2010年7月 目 录 第1章 绪论 ........................................................................................................... 1 1.1 生物光子学的形成与发展 ....................................................................... 1 1.2 本书的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 及结构安排 ........................................................................... 1 第2章 光子学与光谱学基础 ................................................................................ 3 2.1 光在界面上的反射和折射 ....................................................................... 3 2.2 光的本质—波粒二象性 ........................................................................... 3 2.3 光子的吸收、发射和散射 ....................................................................... 4 2.3.1 吸收与发射 .................................................................................... 4 2.3.2 散射 ............................................................................................... 4 2.4 光波的干涉和衍射 ................................................................................... 4 2.5 分子能级结构与光谱 ............................................................................... 5 2.5.1 分子能级结构 ................................................................................ 5 2.5.2 光谱学基础 .................................................................................... 5 2.6 激光与非线性光学 ................................................................................... 6 2.6.1 激光原理 ....................................................................................... 6 2.6.2 非线性光学 .................................................................................... 6 第3章 生物学基础 ............................................................................................... 8 3.1 生命体的构成 .......................................................................................... 8 3.1.1 细胞 ............................................................................................... 8 3.1.2 组织 ............................................................................................... 8 3.1.3 器官与系统 .................................................................................... 8 3.2 生物大分子 .............................................................................................. 9 3.2.1 蛋白质 ........................................................................................... 9 3.2.2 核酸 ............................................................................................... 9 3.3 细胞的结构与功能 ..................................................................................10 3.4 生物组织及动物模型 ..............................................................................10 3.4.1 生物组织 ......................................................................................10 3.4.2 动物模型 ......................................................................................10 第4章 光与生物体的相互作用 ...........................................................................12 4.1 光与生物体相互作用的形式 ..................................................................12 4.2 光与细胞的相互作用 ..............................................................................12 4.2.1 细胞中的光吸收 ...........................................................................12 4.2.2 光致细胞过程 ...............................................................................12 4.3 光与生物组织的相互作用 ......................................................................13 4.3.1 组织对光的吸收 ...........................................................................13 4.3.2 组织对光的散射 ...........................................................................13 4.3.3 生物组织与荧光 ...........................................................................14 4.3.4 光热效应和光声效应 ...................................................................14 4.3.5 光化学效应 ...................................................................................15 第5章 生物光子学成像技术 ...............................................................................16 5.1 光学成像 .................................................................................................16 5.2 光学显微技术 .........................................................................................16 5.3 荧光显微技术 .........................................................................................17 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 ......................................................................17 5.5 多光子激发荧光显微技术 ......................................................................17 5.6 全内反射荧光显微技术 ..........................................................................18 5.7 荧光共振能量转移成像技术 ..................................................................19 5.8 荧光寿命成像显微技术 ..........................................................................19 5.9 光学相干层析成像技术 ..........................................................................20 5.10 非线性光学成像技术 ............................................................................20 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势 .........................................................21 第6章 超分辨成像技术 ......................................................................................23 6.1 光学显微镜的空间分辨率 ......................................................................23 6.2 非远场超分辨荧光显微技术 ..................................................................23 6.3 远场超分辨荧光显微技术 ......................................................................23 6.3.1 结构光照明超分辨显微技术 ........................................................24 6.3.1.1 线性结构光照明超分辨显微技术 ....................................24 6.3.1.2 饱和结构光照明超分辨显微技术 ....................................24 6.3.2 干涉在光学超分辨显微技术中的应用 ........................................24 6.3.2.1 驻波荧光显微技术............................................................25 6.3.2.2 非相干光干涉照明干涉成像显微技术 .............................25 6.3.2.3 4Pi显微技术 ....................................................................25 6.3.3 利用非线性效应突破衍射极限 ....................................................26 6.3.3.1 受激发射损耗(STED)显微技术 ....................................26 6.3.3.2 基态损耗显(GSD)微技术 ..............................................26 6.3.3.3 可逆饱和荧光跃迁(RESOLFT)显微技术 .......................26 6.3.4 单分子显微技术 ...........................................................................27 6.4 超分辨显微技术的发展展望 ..................................................................27 第7章 生物光子学中的光谱分析技术 ...............................................................29 7.1 吸收光谱技术 .........................................................................................29 7.2 荧光光谱技术 .........................................................................................29 7.3 拉曼光谱 .................................................................................................30 7.4 荧光相关光谱技术 ..................................................................................31 7.5 生物大分子检测 .....................................................................................31 第8章 其它常见的生物光子学技术 ...................................................................32 8.1 流式细胞分析技术 ..................................................................................32 8.2 生物芯片 .................................................................................................32 8.3 激光光镊技术 .........................................................................................33 8.4 光动力学疗法 .........................................................................................33 8.5 生物光子学中的纳米技术 ......................................................................33 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第1章 绪论 1.1 生物光子学的形成与发展 生物光子学是一门新兴的交叉学科，它将可能给医学和光子应用等学科带来革命性的变化，尤其是在医学诊断和疾病预防等方面。本节针对生物光子学进行初步的探讨，简述了该学科的发展背景及形成过程，并简单列举了生物光子学的部分研究内容及主要应用等，最后对生物光子学的发展做了展望。 重点内容包括: , 生物光子学(Biophotonics)，是由生命科学和物理科学这两者交叉融合 所形成的一门新兴的交叉学科。融合了光子学和生物学，是光子学的延 伸。利用光子代替传统的电子进行信息的传输，处理，进而对生物机体 进行探测，诊断和治疗等; , 生物光子学的发展和成长融合了20世纪的三大科技革命，包括量子理论 的革命(1900-1950s)、技术革命(1940s-1950s)和基因组学革命 (1950s-2000)。量子理论革命奠定了光子学发展的基础，技术革命为 生物学的研究提供了重要的工具，而基因组学革命则将生物光子学的研 究推向一个新的高度; , 生物光子学的研究内容非常广泛，大的分类包括:光子学和组织光学、 生物光子学中的光子器件、探测及成像、生物医学诊断、介入和治疗以 及用于蛋白质组学、基因组学中的各种先进的技术; , 近年来，生物光子学的发展非常迅速，出现了许多前沿学科，比如单分 子检测和追踪、超衍射极限成像、多模式复合功能成像、纳米光子学、 光动力疗法、小型化的检测与成像等。 1.2 本书的内容及结构安排 生物光子学的本质，是利用光子技术获取生物体的信息，或者利用光子技术作用于生物组织，达到控制或治疗的目的。生物光子学科涉及光与生物体在不同层次，如器官和组织层次以及细胞和分子层次等的相互作用。本书内容分为上、下两篇，上篇介绍生物光子学的原理与基础，下篇介绍生物光子学的常用技术及应用，重点在于原理和方法的介绍，同时兼顾各种技术的应用，并简要介绍相关 1 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 领域的最新进展。本书各章内容包括: 上篇:生物光子学的原理与基础 1. 绪论 2. 光子学与光谱学基础 3. 生物学基础 4. 光与生物体的相互作用 下篇:生物光子学技术及应用 5. 生物光子学成像技术 6. 超分辨成像技术 7. 生物光子学的光谱分析技术 8. 其它常见的生物光子学技术 2 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第2章 光子学与光谱学基础 2.1 光在界面上的反射和折射 光在界面上的反射和折射是最常见的现象，在生物光子学中有普遍应用，尤其是全内反射现象，本节简单回顾光在界面上的反射和折射的基本知识。重点内容包括: , 光在介质中的速率比在真空中的速率小，后者与前者的比值即为介质的 折射率，一般当波长增大时介质的折射率将减小; , 光入射到折射率不同的两种介质的界面时将发生反射和折射，分别遵守 反射定律和斯涅耳定律; , 光从光密介质向光疏介质传播，入射角大于临界角将发生全内反射，此 时仅有一小部分能量进入光疏介质表面，称为隐失波或衰逝波。 2.2 光的本质—波粒二象性 本节简单回顾光的波粒二象性本质，复习作为波的光的传播性质以及作为粒子的光子的基本性质。重点内容包括: , 光具有粒子性，光是由具有分立能量的光子组成的，作为光子的光可以 与物质交换能量和动量，能量的交换形成光谱学的基础，而动量的交换 产生物理效应，如可用于捕捉物质的光力; , 光同时具有波动性，光是一种电磁波，其电场、磁场与光的传播方向两 两垂直，作为光波的光表现出电磁波之间的干涉现象和通过小孔或狭缝 的衍射现象等性质; , 相速度描述单个波的波前即等相面的移动，也就是光作为电磁波穿过介 质的的速度，而群速度描述一个由许多一起传播的波组成的波包的传播; , 光的偏振指的是光的电场的振动方向有一定的偏向性，旋光性介质会旋 转光的偏振平面，双折射介质对不同偏振的入射光其折射率不同。 3 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 2.3 光子的吸收、发射和散射 2.3.1 吸收与发射 光与粒子相互作用时应用光的粒子性来加以描述，即光子说，本小节介绍光作为光子被物质吸收和发射的爱因斯坦(Einstein)模型，重点内容包括: , 光子的吸收会导致一个分子从低能态向高能态跃迁，前者称为基态，后 者称为激发态; , 自发辐射在产生光子的同时，使分子从其激发态跃迁到其低能态; , 较多的分子处于激发态而非基态时称为粒子数反转，达到粒子数反转条 件时由另一个与辐射光有相同频率的光子触发可发生受激辐射; , 光子吸收、自发辐射和受激辐射之间的联系由爱因斯坦模型描述; , 在量子力学中，两个能态之间的跃迁强度由跃迁偶极矩描述，跃迁偶极 矩通过电荷的重新分布将两个能态联系起来。 2.3.2 散射 在光与分子的偶极相互作用模型中，除了表示吸收或发射的一项，还有另一项表示非弹性散射，即拉曼(Raman)散射，本小节介绍拉曼散射过程。重点内容包括: , 拉曼散射描述一个单步散射过程，即一个能量为hv的光子被散射为另一 个能量为hv,的光子，两者能量之差h(v-v,)对应于激发态与低能态之间的 能级间隔; , 通常散射光子的能量hv,比入射光子的能量hv低，其能量差被存入分子 从而产生一个激发态，该过程成为斯托克斯(Stokes)拉曼散射; , 散射光子能量hv,高于入射光子的能量hv时称为反斯托克斯(anti-Stokes) 拉曼散射，光子的能量差等于光子从激发态的分子中带走的能量。 2.4 光波的干涉和衍射 与光的传播有关的现象应用光的波动性加以描述，即波动说，本节简单回顾光作为电磁波的干涉和衍射现象。重点内容包括: , 光源的相干性是对光源发出的多个光波的整体属性的度量，若相位关系 4 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 固定为常数则为相干光，反之为非相干光，激光是较好的相干光源; , 发生干涉的两个光波，相位相同时将形成相长干涉，相位相反时将形成 相消干涉; , 衍射是光波的普遍现象，但只有当物体的空间尺寸与光波的波长相当时 衍射才比较明显，例如当光遇到尖锐的障碍物、通过小孔和狭缝，或聚 焦于尺寸与光波长相近的斑点时，光弯折和扩散等衍射现象就会发生; , 将狭缝或开口的每一点当做一个球面波的波源，可以很好地解释衍射现 象;所有子波源发出的球面波相互干涉，在某些角度上发生相长干涉得 到亮斑，在另一些角度上发射相消干涉得到暗斑，构成衍射图样。 2.5 分子能级结构与光谱 2.5.1 分子能级结构 物质也具有波粒二象性，其能态也是量子化的，本小节介绍与生物光子学密切相关的分子能级结构基础知识。重点内容包括: , 物质是由分子和原子构成的，原子和分子中电子的能量只能取一些被允 许的离散值，即能量量子化条件，此特性源于物质的似波特性; , 分子的能量分为四部分，即电子、振动、转动和平动，其中电子、振动 和转动的能量是量子化的，即具有离散值; , 电子能级和振动能级在生物光子学中有重要的作用，它们是光谱学、生 物医学成像、生物传感及流式细胞仪的重要组成部分。 2.5.2 光谱学基础 光谱学研究不同波长下物质对光的吸收和辐射，跃迁强度和波长的关系曲线称为光谱，本小节介绍生物光子学中常用的光谱学基础知识。重点内容包括: , 对于吸收，通常使用宽带光源，测量其透射(以及衰减或吸收)相对于 频率或波长的函数关系; , 发射或拉曼过程，使用一个特定的波长(激发波长)照射介质，从而得 到发射或散射光强与波长的函数关系; , 电子能级吸收用于对样品的定量分析，如紫外-可见光谱仪，测量电子能 级的线性吸收; 5 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 电子能级发射光谱研究从一个受激电子能态向一个较低电子能态(一般 是基态)跃迁而产生的光发射，最常用的是荧光光谱技术; , 振动能级光谱给出振动频率信息;振动频率可提供有关化学键、键角、 化学集团的详细特征描述，可以用来识别分子，IR光谱比拉曼光谱的灵 敏度高，但在生物样品的检测中拉曼光谱具有更多的优势; , 荧光相关光谱测量由一个只含少量分子的微体积在两个不同时刻发出的 荧光强度的相关函数，可提供由分子扩散和蛋白质-配位基结合等动态过 程造成的荧光强度变化信息。 2.6 激光与非线性光学 2.6.1 激光原理 激光是生物光子学领域最常用的光源，本小节介绍激光的特点、基本原理和分类，以及生物光子学中一些重要的激光器。重点内容包括: , 激光(Laser)是“受激辐射光放大”(light amplification by stimulated emission of radiation)的缩写，它是一种具有高方向性、高相干性、高单 色性、低发散性的光源，它能够被聚焦形成非常小的光斑; , 激光产生的两个重要步骤是:1)通过激发，在增益介质的两个分子能级 间形成布居数反转;2)在由两个反射镜组成的光学谐振腔内形成光学正 反馈，产生受激辐射光放大; , 若增益介质为三能级结构，则只能产生脉冲激光;若为四能级结构，则 既能产生脉冲激光，也能产生连续激光; , 采用各种光栅或光开关技术，可以实现不同的激光脉冲宽度和重复频率， 如利用调Q技术产生纳秒级脉冲，用锁模技术产生皮秒级和飞秒级脉冲; , 根据泵浦过程、增益介质和时间特征的不同，可对激光器进行各种分类; , 采用具有时间分辨能力的脉冲激光，可对生物过程的中间物和最终产物 进行实时监测，研究生物物理和生物化学过程。 2.6.2 非线性光学 强激光束在生物光子学中的应用，使光与物质之间的非线性相互作用不容忽视，本小节介绍非线性光学的基本概念，以及生物光子学中一些重要的非线性光 6 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 学效应。重点内容包括: , 非线性光学效应是在光强很强时显现出来的现象，其程度取决于光波的 电场高阶项的大小; , 高次谐波产生和多光子吸收是生物光子学应用中最主要的两种非线性光 学效应; , 二阶非线性效应与光强的平方成正比，三阶非线性效应与光强的立方成 正比，前者以二次谐波产生为例，后者以三次谐波产生为例，在这两种 过程中介质既不吸收能量，也不发射能量，即为非共振效应; , 具有二阶非线性效应的介质一定具有非中心对称性质，而三阶效应对介 质没有对称性要求的限制; , 双光子吸收和三光子吸收是多光子吸收的两个具体例子，在这两种过程 中，两个或三个光子被同时吸收，使分子到达激发态; , 分子对低能量/长波长的光子进行多光子吸收，会发生上转换辐射，产生 高能量/短波长的光发射; , 相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)是另一种光学非线性频率转换过程， 当两束输入光的差频和分子的拉曼振动频率一致时，频率分别为,和,12 的输入光可产生频率为2,-,的输出光。12 7 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第3章 生物学基础 3.1 生命体的构成 几乎所有的生命体都由细胞组成。有些生物(如细菌)，可以单细胞生物的形式而存在。而有些生物(包括人类)，则由无数个协同工作的细胞构成。人体就是由亿万个细胞构成。由这些细胞构成组织(如肌肉组织和皮肤组织)或构成器官(如肝脏和肺)。尽管各种生物系统呈现出显著差异，但令人惊奇的是，它们都由几种相同类型的化学物质构成，在遗传物质的复制、新陈代谢及高等生物细胞的组织方式上，都遵循着相似的规律。 3.1.1 细胞 , 细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位:由膜包围的原生质团，通 过质膜与周围环境进行物质和信息交流;是构成有机体的基本单位，具 有自我复制的能力，是有机体生长发育的基础;是代谢与功能的基本单 位，具有完整的代谢和调节体系，不同的细胞执行不同的功能;是遗传 的基本单位，具有发育的全能性。 , 细胞膜的功能:为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;选择性的物 质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排出;提供细胞识别位点， 并完成细胞内外信息的跨膜传递;为多种酶提供结合位点，使酶促反应 高效而有序地进行;介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;参与形 成具有不同功能的细胞表面特化结构。 3.1.2 组织 , 组织是多个细胞的集合。组织中的细胞彼此协作，共同使有机体执行某 种生物功能，如移动、新陈代谢、繁殖以及进行其它重要的活动。 , 四大组织:上皮组织:肌肉组织:骨骼肌，平滑肌，心肌;结缔组织: 用于支持的软骨和骨骼、用于连接的肌腱和韧带、以及纤维结缔组织; 神经组织:由神经细胞构成，用于传输神经脉冲信号。 3.1.3 器官与系统 , 人的体内有各种各样的器官，器官是具有一定形状、能行使一定功能的 8 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 结构单位，如耳、眼、鼻、心、肝、胃、肠、脑和骨髓等。它们都是由 四种基本的组织构成的。器官的结构组成特点和它的功能是相适应的。 , 我们可以把人体的各种器官归属为八大系统，这就是运动系统、血液循 环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、内分泌系统和神 经系统。人体各系统的活动都是在神经系统的调节与控制下进行的，从 而使人体成为统一的整体。 3.2 生物大分子 细胞中有机物达几千种之多，它们主要由碳、氢、氧、氮等元素组成。有机物中主要由四大类分子所组成，即蛋白质、核酸、脂类和糖，这些分子约占细胞干重的90%以上。 3.2.1 蛋白质 , 在生命活动中，蛋白质是一类极为重要的大分子，几乎各种生命活动无 不与蛋白质的存在有关。蛋白质不仅是细胞的主要结构成分，而且更重 要的是，生物专有的催化剂——酶是蛋白质，因此细胞的代谢活动离不 411开蛋白质。一个细胞中约含有10种蛋白质，分子的数量达10个。 , 组织、细胞中主要蛋白质的功能:1(催化和调控作用;2(在协调运动 中的作用;3(在运输及储存中的作用;4(在识别、防御和神经传导中 的作用此外，皮肤及骨骼等组织中含量较大的胶原蛋白，主要起机械支 持作用。 , 血浆蛋白质的主要功能:1(对pH的缓冲和胶渗压的维持;2(对多种 物质的运输作用;3(血浆中存在着多种酶，由组织细胞合成后分泌或逸 入血浆;4(免疫、防护等功能;5(营养功能。 3.2.2 核酸 , 核酸是生物遗传信息的载体分子，所有生物均含有核酸。 , 核酸是由核苷酸单体聚合而成的大分子。核酸可分为核糖核酸RNA和脱 氧核糖核酸两大类DNA。 , 当温度上升到一定高度时，DNA双链即解离为单链，称为变性 (denaturation)或熔解(melting)，这一温度称为熔解温度(melting temperature，Tm)。 9 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 碱基组成不同的DNA，熔解温度不一样，含G-C对(3条氢键)多的 DNA，T高;含A-T对(2条氢键)多的，T低。当温度下降到一定温mm 度以下，变性DNA的互补单链又可通过在配对碱基间形成氢键，恢复 DNA的双螺旋结构，这一过程称为复性(renaturation)或退火(annealing)。 3.3 细胞的结构与功能 , 细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。 , 细胞分裂(cell division)是活细胞繁殖其种类的过程，是一个细胞分裂 为两个细胞的过程。 , 细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细 胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程。 , 细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制 自动结束生命的过程。 3.4 生物组织及动物模型 3.4.1 生物组织 , 组织是多个细胞的集合。人体内有超过200种可区别的已分化的细胞， 只能执行特定的功能，它们紧密联系在一起，形成了各种各样的组织。 , 组织中的细胞彼此协作，共同使有机体执行某种生物功能，如移动、新 陈代谢、繁殖以及进行其它重要的活动。 , 组织发挥作用是组成细胞协同工作的结果，但又不仅仅只是组成细胞的 作用，还需细胞间通讯机制及细胞外基质的协助。 , 对于不同的观察仪器，有不同的生物组织样品制备方法。 3.4.2 动物模型 按产生原因分类: , 自发性动物模型(spontaneous animal models); , 诱发性或实验性动物模型(experimental animal models); 按系统范围分类: 10 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 疾病的基本病理过程动物模型; , 各系统疾病动物模型; , 按模型种类分类 11 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第4章 光与生物体的相互作用 4.1 光与生物体相互作用的形式 光与生物体的相互作用包括吸收、反射、折射、散射、发光、光化学、光声等多种表现形式或现象，如下图所示。本小节简要介绍各种相互作用形式。 4.2 光与细胞的相互作用 4.2.1 细胞中的光吸收 相比单分子层次，光与细胞的相互作用是个非常复杂的过程，往往会引发一系列连锁反应，并产生物理、热力学、机械或化学上的各种变化，但这些大部分是由光的线性吸收引发的，本小节介绍细胞中的光吸收过程。重点内容包括: , 细胞中吸收光的成分物质可以是内源的，即细胞的组成成分，也可以是 外源的，如各种光敏感染料、着色成分等; , 生物样品中光的传输具有一个由散射和吸收损耗决定的波长上下限，大 多数细胞对于波长在800-1300纳米间的光有很好的通透性; , 蛋白质是细胞中含量最多的化学物质，它对光的吸收是由其组成部分氨 基酸、多肽键和二硫化物链接及其它可能存在的发色团的吸收特性共同 决定的。 4.2.2 光致细胞过程 细胞吸收光以后，会产生多种光物理和光化学过程，称为光致细胞过程，本 12 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 小节介绍几种常见的光致细胞过程。重点内容包括: , 内源分子对光的吸收可能导致光的辐射，也可能导致非辐射过程; , 自发荧光属于辐射过程，由内源荧光团的受激辐射引起，常见的内源荧 光团有NADH、黄素、酪氨酸、卟啉和脂色素等; , 细胞吸收光导致蛋白质变性和水的汽化等，可引起光致热力非辐射效应; , 激发态光化学非辐射过程包括光加成、光裂解、光氧化、光水合、光异 构化合光重排; , 外源光敏剂也能通过光加成和光氧化引起光敏效应。 4.3 光与生物组织的相互作用 4.3.1 组织对光的吸收 组织是一种自支撑体材料，它与光的相互作用如同其它任何体材料与光的相互作用一样，对光的传播产生吸收、散射、折射和反射，本小节介绍组织对光的吸收过程。重点内容包括: , 在弱光照明(如普通照明灯或连续激光光源)下组织的光吸收为线性吸 收，可由朗伯-比尔定律来描述，即薄层材料所吸收的辐射能与总辐射能 的比值，依赖于吸收物质的性质以及入射光波长和吸收层的厚度; , 组织对光的吸收是组织中细胞内外的各种组分对光的吸收的综合效应; , 描述组织对光的吸收程度随光波长变化的曲线即为吸收光谱，通常以吸 光度或吸收系数作为纵坐标，以波长或波数作为横坐标来表示。 4.3.2 组织对光的散射 光散射是组织中最显著的效应，本小节介绍组织对光的散射过程。重点内容包括: , 生物组织是高度散射的混沌介质，其不透光性是大量不同种类的大分子、 细胞器、小水滴等的多种散射过程的综合结果; , 组织对光的散射有多种不同的机理，包括瑞利散射和米散射以及布里渊 散射和拉曼散射，前两者属于弹性散射，后两者属于非弹性散射; , 光学穿透深度, 是度量组织的光穿透性的重要参数，其定义是光在组织 13 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 中传播时光强变为初始光强1/e时的深度; , 组织中的拉曼散射能提供化学及结构方面变化的有用信息，这种变化来 源于疾病的发生和由老化物质或辅助注入物质引起的机械形变; , 如果以超短激光脉冲入射组织，则出射的光按照其在组织中传播的时间 可分为弹道光、蛇形光和漫散射光三类，其中漫散射光占大多数。 4.3.3 生物组织与荧光 组织和光相互作用可产生多种不同的光致过程，这些过程有的来自细胞内组分，有的来自细胞外组分，还有一些来自大体积物质。本小节介绍组织中的荧光现象，即辐射性光致过程。重点内容包括: , 组织的辐射性光致过程主要表现为组织的自发荧光现象，这些荧光主要 来自于存在细胞内部组分以及细胞间基质中的内源荧光团; , 任一组织中一般都含有多种荧光物质，且呈非均匀分布，组织的自发荧 光光谱可作为检测癌症和新陈代谢变化等的一种光学方法。 4.3.4 光热效应和光声效应 作为非辐射性光致过程的一种重要形式，光热效应和光声效应往往在组织层次才表现出来，本小节介绍组织中的光热效应和光声效应。重点内容包括: , 生物组织吸收光辐射能后可以非辐射方式释放能量，引起热效应，从而 导致组织温度升高以致组织损伤; , 光热效应引起的组织损伤按照程度由轻到重分别为体温过高、凝结、汽 化、碳化和熔融，其中体温过高为可逆过程，其它几种均为不可逆过程; , 组织的光热损伤是曝光能量、曝光时间以及组织的特性的综合结果，只 要能提供足够的功率密度和曝光时间，任何类型的激光器都有可能使组 织碳化和熔融; , 当采用脉冲激光时，组织对光的散射和吸收可产生周期性的热流，使周 围的组织有规律地热胀冷缩，产生热弹效应，其激发的超声波反映了组 织中吸收体的分布情况; , 利用光声效应可实现无创的组织参数测量、光声诊断和光声成像，与X 射线成像技术相比对人体损伤小，而与超声检测相比则具有更高的图像 对比度。 14 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 4.3.5 光化学效应 在生物组织中，由光所引起的化学结构改变的所有过程称为光化学反应，如光合作用等，本小节介绍组织的光化学效应。重点内容包括: , 只有能被组织中的分子吸收的光子，才能在组织中导致化学反应，即光 化学反应具有波长选择性; , 在光化学效应中，采用非线性激发如双光子吸收，相比作用位置局限在 表面下几微米深的单光子吸收来说，它能影响组织内部更深的部位，有 利于光动力治疗。 15 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第5章 生物光子学成像技术 5.1 光学成像 常见的生物光子学成像技术: , 放射线照相技术 , X射线成像技术 , 计算机辅助成像(CAT)技术 , 超声成像技术 , 磁共振成像(MRI)技术 这些成像技术的发展，极大地促进了生物医学和人类生命健康的发展。但目前常见的成像技术存在着很大的缺点，比如，X射线成像和CAT扫描成像有离子辐射危害，其应用有局限性;放射性同位素成像有放射危害;MRI成像不能提供某些特殊化学信息，系统庞大昂贵;超声成像分辨率能力有限等。 比较而言，光学成像技术具有许多突出的优点，如无害、分辨率高、可提供多角度信息和频谱信息、适用离体和活体样品、可获得动态信息，并且可与其他成像技术结合使用等。 按照光与组织的相互作用方式的不同，光学成像的种类非常多。本章介绍各种生物光子学成像技术。 5.2 光学显微技术 显微镜的作用是将小的物体放大。光学显微镜是生物学研究和医学诊断的重要工具。本节介绍显微镜的光学原理、利用光学显微镜的照相技术以及光学显微镜的分类。 显微镜主要由目镜、物镜和聚光镜等组成，显微镜的空间分辨率，决定了我们所能观察到的细节，高的空间分辨率并不完全取决于物镜，还受其它许多因素的影响，比如，物镜和样品是否干净、盖玻片的厚度是否合适、以及是否使用正确的物镜油。此外，合理的物镜和目镜配合，也是提高显微镜使用效果的重要因素。 16 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 聚光镜对提高空间分辨，改善成像质量具有重要的作用。显微镜的照明方法有临界照明和科勒照明，后者是目前显微成像普遍采用的方法。 将显微镜和电子成像及显示设备如CCD相机和监视器等结合，可以进一步提高显微成像的放大倍率，也就是所说的电子放大。利用电子成像技术，可以方便地进行显微样品的定量测量。 显微镜从光路结构上分有两种,透射和反射;从对比机制上分有许多种，如暗场显微、相衬显微、偏光显微、微分干涉显微、荧光显微等。 5.3 荧光显微技术 ‾9‾7某些原子或分子吸收特定波长的光，并在短暂停留后(10-10 s)发射波长更长的光(发生了斯托克斯红移)，这种光的发射就叫荧光。荧光现象与光学显微技术结合，就是所谓的荧光显微技术。荧光显微技术是研究细胞和亚细胞结构、细胞动力学(比如扩散、酶动力反应速率)、细胞功能(比如细胞的外吐/内吞作用)、免疫化、监测pH值、离子浓度、单个靶分子等的重要工具。 荧光具有多参量特性，荧光的特征参量包括位置、强度、波长、寿命和偏振等。利用这些参量的测量，可以获取多方位的信息。 按照发射荧光的物质种类的不同，荧光可分为自体荧光和外源荧光。自体荧光是生物样品自身发射的荧光，外源荧光是利用能够发射荧光的化学试剂标记样品。常用的荧光探针包括:荧光染料、荧光蛋白、量子点等。 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 在常规的全场显微镜中，整个样品都被光(汞灯、氙灯等光源)照射，可以用眼睛直接观察图像，或将图像成像到图像探测器上。在激光扫描共焦显微镜中，用聚焦光(来自激光)沿着样品扫描进行照明，用计算机重构样品的图像。用光束扫描的方法得到的图像是样品的一个光学切片。 与全场显微技术相比，激光扫描共焦显微技术的优点包括:消除焦面外发出的光，从而改善分辨率;控制景深;通过对厚样品光学切片的序列采集，可以实现3D重建;活体样品成像;多色标记等。 5.5 多光子激发荧光显微技术 激光扫描共焦显微镜如果采用近红外飞秒激光器作为光源，就是一台多光子 17 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 激发荧光显微镜。单光子激发是指荧光团分子只吸收一个激发光光子，被激发到激发态而发射荧光。多光子激发是指波长合适的多个光子几乎同时到达荧光团分子而被吸收，从而发射荧光。单光子激发一般采用紫外光、蓝紫光或其它短波长的光，既可以是汞灯、氙灯，也可以是激光;而双光子激发一般采用发射近红外光的飞秒激光器。与普通的单光子激发荧光显微相比，多光子激发有以下突出的优点: , 激发光和发射光波长差别大，从而减小了光谱串扰; , 不用共焦针孔可以实现固有的三维分辨和三维成像; , 成像深度深; , 不采用紫外(UV)光学器件就可以对需要UV激发的染料成像; , 在焦点外区域的光漂泊和光损伤小。 正是由于多光子激发有这些优点，使得它成为近年来生物光子学成像中一个蓬勃发展的新领域。多光子激发荧光显微技术尤其适用于神经成像、内窥成像等。 多光子激发荧光显微的缺点是: , 和普通的单光子激发共焦显微镜相比，多光子激发荧光显微镜的操作复 杂; , 由于采用飞秒激光器，因此多光子激发荧光显微系统昂贵。 近年来随着系统集成度的提高，以及光纤激光器的发展，多光子激发荧光显微技术的应用日益普及，得到了更广泛的应用。 5.6 全内反射荧光显微技术 全内反射荧光显微技术(TIRFM)，是一种基于光学全内反射现象的荧光显微成像技术。TIRFM适用于探测固体基底上100 nm范围内的细胞环境，是细胞生物学研究的一种重要工具。TIRFM依靠在离固体基底100 nm这个小区域内的电磁波能量以倏逝波的形式激发荧光，这就要求固体基底的折射率高于细胞的折射率。 和普通的荧光显微镜相比，TIRFM的优点是:背景荧光非常低;没有离焦荧光;除了界面处外，对其它地方细胞的照射最小;和激光扫描共焦显微技术相比，能观察更薄的切片;限制了对细胞的危害;比激光扫描共焦显微镜便宜。 18 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 TIRFM的应用包括; , 表面单分子荧光的探测; , 把细胞内外的蛋白质固定在细胞表面受体和人工细胞壁上的研究; , 可以和其他成像技术结合使用。 5.7 荧光共振能量转移成像技术 荧光共振能量转移，即FRET，是通过偶极子-偶极子相互作用的方式实现的一种分子之间非辐射能量转移过程。如果在被激发的高能量分子(供体)附近1-10 nm范围内有另外一个分子(受体)，那么被激发的供体分子就会将能量转移给受体分子。FRET的效率和分子之间距离的六次方成反比。FRET技术是研究生物大分子，如蛋白质分子之间相互作用的重要工具。 目前FRET技术在生物学研究中的应用日益普及，并正在向亚细胞及单分子观测水平发展;另外，FRET还用于信号转导通道(网络)的亚细胞水平定位，生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程的时空关系，利用FRET技术追踪在体水平生命过程。 5.8 荧光寿命成像显微技术 荧光寿命是荧光分子被激发后，在激发态平均停留的时间，一般在ns量级。荧光寿命是荧光的重要特征参量之一，荧光寿命成像显微技术通过对样品中各点的荧光寿命进行测量和成像。 荧光寿命成像技术的特点是: , 荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感; , 荧光寿命不受荧光强度和荧光团浓度的影响，并且最大程度上与荧光剂 的光致漂白无关; , 尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境下其寿命不同，因此寿 命是更加敏感的环境指示剂; , 由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体的荧光寿命，就可以 测量其能量转移。 利用荧光寿命成像，可以测量分子局部环境的折射率、分子之间的相互作用 19 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 以及分子的旋转快慢等。另外，荧光寿命成像还被用于皮肤中pH的测量、老年黄斑变性的诊断以及FRET研究等许多领域。 5.9 光学相干层析成像技术 光学相干层析成像(optical coherence tomography，OCT)是一种类似于超声成像的反射成像技术，它利用组织内部结构的散射光成像。OCT尤其适合于高散射组织，例如硬组织。 OCT的原理是基于迈克尔逊干涉仪。如果散射点的后向反射光和参考光出于同一光源，并且光程差在相干长度范围内，就会产生一个特定的相干图样。利用干涉条纹可以提取出样品的结构信息。 和其它生物医学成像技术相比，OCT技术的优点包括: , 分辨率高; , 可以实时成像; , 与导管和内窥兼容，基于光纤的设计可以使OCT系统直接和导管或者 内窥镜结合起来; , 对混浊介质(如生物组织)有更强的成像能力; OCT的缺点是其分辨力低于双光子荧光或共聚焦显微镜。 5.10 非线性光学成像技术 第5.5节所讲的多光子激发荧光显微技术就是一种非线性光学成像技术，与此相对应，前面所讲的(单光子激发)荧光显微和光学显微等，都是线性的光学显微技术，也就是说，信号光强是和入射光强成线性关系。而非线性光学成像技术，其信号光强和入射光强不成线性光学，比如，对于双光子激发荧光显微技术，荧光信号的强度和激发光强度的二次方成正比。除了前面介绍的多光子激发荧光显微技术外，其它常见的非线性光学成像技术还有:二次谐波成像(SHG)、三次谐波成像(THG)和相干反斯托克斯拉曼散射显微成像(CARS)等。 SHG和双光子激发荧光(TPF)成像采用的都是近红外飞秒激光器作为光源，SHG信号的波长是激光波长的一半，而TPF信号的波长和单光子激发的荧光发射波长相同。产生SHG信号的是样品中的非对称性结构，而TPF则来自样品的荧光团分子。和TPF相比，SHG的优点包括:样品没有吸收激发光，因此没有 20 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 热损失或光致漂白发生;SHG只发生在非对称介质中;SHG信号波长是激发光波长的一半，很容易地从泵浦光和荧光中区分开来;SHG可用在非荧光的样品和组织。 三次谐波成像THG技术的优点包括: , THG是物质固有的物理效应，是一种光和物质相互作用的多光子过程， 可以在表面及大块组织内内产生THG; , THG的空间分辨率高，无需标记、没有光漂白，不会导致细胞的生理变 化及细胞死亡，THG显微是一种重要的生物医学成像工具; , 信号蓝移，容易与激发光分离，信噪比高，容易与自体荧光分离; , 具有单层敏感性。 THG的缺点是:需要高峰功率，有损伤样品的风险。 另外，CARS也是一种近年来发展起来，并获得重要应用的非线性光学成像技术。与荧光显微相比，CARS的优点是: , 无需标记; , 波长蓝移; , 信号强度大; , 方向性好。 利用CARS，可以对细胞和组织中的脂质进行成像，目前获得了非常重要的应用。 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势 随着生物学发展到单个细胞，细胞中的细胞器，乃至构成物质的分子层次，生物学研究对光子学成像技术也提出了越来越高的要求，因而，生物光子学成像技术也获得了很大的发展。生物光子学的发展趋势大致有以下几个方面: , 多功能成像，即把各种生物成像方法组合使用，进行多模式、多参量成 像; , 超分辨成像; 1)结构光照明显微成像 21 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 2)STED 3)PALM 4)STORM等 , 小型显微镜和内窥成像:当前生物成像研究正利用MEMS技术来发展 小型成像设备，另一目标是开发基于导管的人体内组织成像; , 生物光子学成像的应用。 22 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第6章 超分辨成像技术 6.1 光学显微镜的空间分辨率 光学成像系统的分辨率指的是它能分辨开两个靠近的点物或物体细节的能力。远场光学的分辨率受到衍射效应的限制。1873年，德国科学家阿贝(Abbe)根据衍射理论首次推导出衍射分辨极限，即能够被光学分辨的两点间的距离为: ,, d,, 2NA2n,sin, 这个量与入射光在真空中的波长、物方折射率n以及显微物镜在物方的半孔径角,有关。nsin(, )通常也被称作数值孔径(Numerical Aperture，N.A.)，在空气中，数值孔径的最大值不超过1，因此远场光学的分辨极限最高只能达到,/2。 6.2 非远场超分辨荧光显微技术 由量子力学中的测不准原理可知:位置和动量不可能同时精确测定，即,x,k,1;另一方面，从测不准原理也可获得突破分辨率衍射极限的启示:如果我们对,k的测量精度不作要求，就可使,x的测量精度不受限制，这就是突破分辨率衍射极限的途径。理论表明，突破分辨率衍射极限的超分辨的成像和探测信息，只能从近场区的倏逝场中获取，即分辨率突破衍射极限只能在倏逝场中实现。目前主要有近场光学扫描显微镜(NSOM)和全内反射荧光显微镜(TIRF)。 6.3 远场超分辨荧光显微技术 在近场超分辨荧光显微技术中，主要利用倏逝场来获取超分辨信息，然而倏逝场只存在于尺寸小于波长的区域，而且是一个空间急剧衰减的场，这说明要利用倏逝场，只能在小于波长的极小的空间范围内进行，具有一定的限制。因此，必须发展远场超分辨荧光显微技术，目前主要有以下几种途径:结构光照明超分辨显微技术，4Pi显微技术，利用非线性效应突破衍射极限、单分子显微技术等。 23 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 6.3.1 结构光照明超分辨显微技术 结构光照明超分辨显微技术利用调制光场照明样品，将原本不可分辨的高分辨率信息编码入荧光图像中，结合计算解码获取高分辨率信息，可将横向分辨率提高至约100纳米。主要包括线性结构光照明和饱和结构光照明。 6.3.1.1 线性结构光照明超分辨显微技术 线性结构光照明超分辨显微技术采用宽场照明和成像，不同之处在于采用横向调制光照明样品，它并非直接提高系统的分辨本领，而是利用调制照明光将高空间频率信号编码入低频图像中，再通过计算分离获得高频信息，可将分辨率提高1倍。其编码过程可以直观地通过云纹图像来理解。 6.3.1.2 饱和结构光照明超分辨显微技术 非线性结构光照明是线性结构光照明的非线性扩展。在荧光分子激发过程中，激发光强较低时，荧光发射强度正比于激发光光强，当激发光强度分布为正弦函数时荧光强度也成正弦函数分布。随着激发光强的的增大，荧光分子第一激发态饱和，荧光强度分布函数不再是正弦函数。饱和的荧光强度分布函数在频域中展开产生一系列非线性项。这些非线性项对应的空间频率是线性结构光空间频率的2倍频，3倍频甚至更高阶的谐频，取决于激发光的强度(荧光分子第一激发态饱和程度)，并且这种拓展是连续的。这些高阶的非线性空间频率项的出现相对于线性结构光照明进一步拓宽了OTF的尺度，将更高空间频率的信息移入可分辨的区域。只要允许一直增大激发光光强，就可以无限扩展OTF尺度，因此理论上饱和结构光照明显微不存在分辨率极限，突破了Abbe分辨率极限的限制。 6.3.2 干涉在光学超分辨显微技术中的应用 纵向分辨率劣于横向分辨率一直是困扰远场光学显微镜的问题。本节将针对这一问题着重讨论驻波荧光显微镜、非相干光干涉照明干涉成像显微镜和4Pi共焦扫描显微镜,它们的核心思想都是在样品的背面增加另一个物镜通过照明光干涉和(或)信号光干涉成像获取物场纵向高空间频率信息,在计算和实验中已经证实可将纵向分辨率提高5-10倍。值得注意的是利用干涉在提高了纵向分辨率的同时也不同程度地引入了纵向旁瓣,纵向旁瓣的大小直接关系到去卷积、非线性图像处理方法的效果，也决定了它们的实用价值，一般以主瓣光强的50%作为一个衡量的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 24 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 6.3.2.1 驻波荧光显微技术 驻波荧光显微镜(standing wave fluorescence microscopy，SWFM)利用纵向相对传播的两束光产生光强快速变化的驻波场,加速了光强在纵向的衰减，从而提高纵向分辨率。SWFM可在普通宽场显微镜的平台上实现,在样品背面放置反射镜，或者由两个相对的物镜产生激光驻波场(周期为λ/2)，光场分布为正弦周期分布。由此可见驻波场照明是选择性激发,纵向PSF尺度(分辨率)不直接受到远场衍射的限制，而是由驻波场的光场分布特性决定。驻波场周期为λ/2n，λ和n 分别是照明光波长和样品的折射率，若波长为500 nm，折射率为1.33，驻波场周期约为190 nm。此时相距95 nm的物点分别处于暗平面和亮平面，可被分辨。实际上，物点相距47 nm(λ/8n)时对比度已经足以被分辨了，相对于共焦显微镜500 nm的纵向分辨率提高了10倍。 6.3.2.2 非相干光干涉照明干涉成像显微技术 普通宽场显微镜仅采用一个物镜前向收集信号光，损失了样品背面的信号。 2干涉成像显微镜(image interference microscopy，IM) 在样品的背面放置另一个相同的物镜。双物镜同时收集样品的荧光信号，调节两个光路的光程相等使信号最终在CCD上干涉成像，干涉图像包含了样品更高的纵向分辨率信息。在照明光路引入干涉，由于照明使用的弧光灯发射的是空间非相干光，因此称之为非相 32干干涉照明显微镜(incoherent interference illumination microscopy，IM)。IM、3IM 两种技术都利用干涉获取更高的纵向分辨率信息，彼此独立。二者也可以同时应用，得到非相干光干涉照明干涉成像显微镜(incoherent interference 55illumination image interference microscopy，IM)。IM移动焦平面在样品中的位置获得纵向各层的图像，干涉带来的纵向旁瓣较大，需要去卷积计算去除离焦处的模糊图像，重构样品的三维图像。其纵向分辨率相对于CSFM 最高可提高7 倍，对细胞纤维肌动蛋白三维成像得到优于100 nm的纵向分辨率。 6.3.2.3 4Pi显微技术 4Pi是空间立体角的数值，有阿贝衍射极限可知，增加物镜的接收角(等效增加物镜的NA)，可以减小PSF的尺度从而提高分辨率。4Pi显微技术利用这一概念，通过样品前后的双物镜使总的接收角接近4Pi。4Pi显微镜利用激光聚焦照明样品，共焦扫描采集荧光信号。与普通CSFM相比，接收角的增加将纵向分辨率提高了5-7倍。 25 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 6.3.3 利用非线性效应突破衍射极限 以上介绍的诸多超分辨技术相对于宽场光学显微镜分辨率都有不同程度的提高,但是它们的分辨率仍然依赖于波长,受到Abbe 分辨率极限的限制。从根本上讲这是因为Abbe 的理论是建立在线性光学的基础上,线性的超分辨技术不可能真正突破它,只有利用非线性效应才能真正打破Abbe 分辨率极限。 6.3.3.1 受激发射损耗(STED)显微技术 1994年，S.W.Hell等提出受激发射损耗(stimulated emission depletion，STED)显微术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行淬灭回到基准态，利用这个特性，Hell开发出了受激发射损耗显微技术，其基本的实现过程就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率。 6.3.3.2 基态损耗显(GSD)微技术 差不多同一时期，S. W. Hell等提出基态损耗(ground state depletion，GSD)显微镜。GSD与STED的基本思想一致。不同之处在于GSD利用长寿命的三态作为亚稳态，相对于第一激发态最低振动态S1寿命大大增加，因此GSD显微镜最显著的优点是GSD光强相对于STED光强下降了1000倍。GSD光和激发光(探针光)的时间顺序与STED相反:首先采用一束连续环形GSD光饱和激发荧光分子，耗尽基态的电子使它们最终布居于长寿命的三态上，接下来用一束波长相同的脉冲探针光激发样品，只有没被GSD光耗尽基态电子的中心区域的荧光分子可以被正常激发和发射荧光，从而压缩PSF尺度。GSD显微镜分辨率只取决于基态损耗饱和程度，类似于STED显微镜，同样不受衍射限制，分辨率公式与STED显微镜相同。 6.3.3.3 可逆饱和荧光跃迁(RESOLFT)显微技术 S. W. Hell等抓住STED和GSD显微镜的核心原理，将这种利用荧光分子荧光态(亮态)与非荧光态(暗态)之间的转化结合饱和激发的方法归纳为可逆饱和光学荧光跃迁(reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT)，并将这一概念进一步拓宽。RESOLFT显微镜分辨率都不受远场衍射的限制，由饱和因子决定，具有统一的分辨率表达式。STED显微镜与GSD显微镜利用电 26 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 子态的转化，是物理过程，事实上也可以通过化学过程改变荧光分子的结构得到亮态和暗态，同样可以实现RESOLFT两态转化的机制。 6.3.4 单分子显微技术 Abbe理论指出在远场无法分辨相距,/2n的两个荧光分子所成的像，但并没有限制单个荧光分子“位置”可以达到的精度，如果在,/2n内仅有一个荧光分子发光，光学显微镜可以获得极高的定位精度，如1.5 nm。将单个荧光分子发射的大量光子所形成的PSF用高斯函数拟合，以高斯函数的中心作为荧光分子的位置，这一过程被称作PSF的数字化。忽略探测器像素有限尺寸和背景噪声的影 -1/2响，单分子的定位精度与发射光子数的关系为,, s/N式中,为定位误差，s x,y x,y为模拟PSF高斯函数的标准差，N为收集的光子数。荧光波长500 nm对应的s 4约为200 nm，荧光分子漂白前发射10个光子，精确度达2 nm。 如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高荧光显微镜在分辨两个或者多个点光源的分辨率。2006年，超高分辨率显微镜研究行业翻开了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组、Samuel Hess小组以及庄晓威科研小组几乎同时报道了基于光控荧光探针和单分子定位的超分辨荧光显微技术，包括光敏定位显微技术(photoactivated localization microscopy，PALM)，荧光光敏定位显微技术(fluorescence photoactivation localization microscopy，FPALM)、随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。通过这些成像技术，可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中，细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光，即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态，每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏，因此相互之间不会受到影响，也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样，就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平，而且成像的分 52子密度也相当高，可以达到10个分子/μm。 6.4 超分辨显微技术的发展展望 与本世纪初相比，超分辨率显微成像已有很大的发展，有多种不同成像技术实际应用于生物系统的范例，甚至已经出现了商业化的超分辨率显微成像系统。但是，目前的成像模式仍然远远没有达到完美状态，对于固定样本成像其三维分辨率还没有达到可以和电子显微镜相媲美的几个纳米的范围。当前的发展趋势是 27 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 结合不同成像模式的优点，进一步提高成像的精度和准确度。为了进一步提高图像的分辨率、对比度和成像的灵活性。由于生命现象非静止的不停歇活动的本质，超分辨率成像应用的一个重要领域是活细胞成像，如近来已有报道的可应用于活 细胞上的超分辨率成像技术包括SSIM技术，PALM技术和STED技术等。但是，活细胞上快速成像的分辨率远低于固定样本成像，其时间分辨率也较低。因此，当前的研究热点集中在通过改进荧光探针和成像模式来进一步提高活细胞上超分辨率成像的时空分辨率。 应用和进一步完善超分辨率显微技成像技术，将使得科学家实时动态观察生物有机体内的生化反应过程成为现实，为深刻认识复杂生命现象的本质打开了黑箱之窗，使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质相互作用、信号网络、细胞功能等多层面、多视角观察研究有机体个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对生命个体影响等生命现象发生、发展的过程，对阐释生命活动的基本规律、揭示疾病发生机理、建立疾病预警系统、提高医疗诊治水平、探寻发现新药物具有重大作用。 28 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第7章 生物光子学中的光谱分析技术 7.1 吸收光谱技术 光谱可以分为紫外区、可见光区和红外区等，原子或分子中的电子由于受光、热、电的激发等多种原因而从一个能级转到另一个能级的过程称为跃迁。因为这些电子吸收了外来辐射的能量后从低能级跃迁到高能级，因此每一次跃迁都对应着电子吸收一定的辐射能量。具有不同分子结构的各种物质，对电磁辐射有选择性的吸收。根据物质对单色光的选择性吸收的特点可以测定物质组份。本节简单介绍光波谱分类和有关吸收光谱的基本知识。重点内容包括: , 根据光的波长不同，光谱可以分为紫外区、可见光区和红外区等。紫外 光是指波长在10-390 nm的电磁辐射，而可见光是波长在390-770 nm之 间的电磁辐射; , 吸光光度法是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来 的，在分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比。 , 郎伯-比尔(Lambert,Beer)定律的物理意义是当一束平行单色光垂直通 过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸 收层厚度b成正比。 , 紫外-可见吸光光度法是利用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的紫外- 可见单色光，根据物质对单色光的选择性吸收的特点来测定物质组份的 分析方法。 , 吸收光谱在生物医学领域的应用。 7.2 荧光光谱技术 本节简单回顾荧光光谱的发展过程，介绍荧光光谱的相关基础知识。重点内容包括: , 荧光的产生原理主要基于Stokes效应，包括以下三个过程:(1)物质的 分子吸收一定的光能，从基态激发到激发态;(2)分子从高能态很快(约 ,12 10s)到一个不稳定的高能级;(3)当分子从不稳定的高能态返回基 态时会伴随光子产生，即有荧光产生。 29 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 荧光分析法有以下优点:(1)灵敏度高，(2)特异性好，而且荧光光 谱可以检测那些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程。 , 荧光光谱包括内源性光谱和外源性荧光光谱。根据所选用的不同激发光 源和检测方式，荧光光谱可以分为稳态和时间分辨(瞬态)荧光光谱。 , 荧光激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处 的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。 , 荧光发射光谱是在某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处 的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。同一荧光物 质其荧光光谱的形状与激发波长无关。不同荧光物质的结构不同，其基 态与高能态间的能量差不一样，而基态中各振动能级的分布也不一样， 所以产生的荧光光谱是不同的，由此可以用荧光光谱进行定性分析。 , 能发出荧光的物质称为荧光发色团。生物的荧光物质可以根据发色团种 类不同分为两大类:自体荧光发色团和荧光探针。 , 物质的激发光谱、发射光谱和时间分辨荧光光谱等通常是采用荧光分光 光度计来测量的。 , 荧光光谱的应用。 7.3 拉曼光谱 本小节简单介绍拉曼光谱的发展过程、能级模型和特征参量，重点内容包括: , 斯托克斯线，反斯托克斯线与入射辐射之间的频率差称为拉曼位移，拉 曼位移与入射光频率无关，而与样品分子的振动能级有关。 , 处于基态E的分子受入射光子的激发而跃迁到受激虚态，受激虚态的分0 子跃迁回到激发态，这时分子吸收了部分能量，并释放出光子，这就是 非弹性碰撞，对应于拉曼散射，所产生的散射光称为斯托克斯线;另一 种情况是处于激发态的分子受入射光子的激发而跃迁到受激虚态，然后 跃迁回到基态E，并释放出光子，即为反斯托克斯线。 0 , 拉曼光谱中的振动频率是用来确定原子团和化学键的特性，这个振动频 率称为拉曼频率。分子振动时键长和键角同时发生变形，若把一个基团 的振动看作孤立的振动并不与邻近的基团发生耦合作用，则这个振动的 频率和强度便是该基团的特征。 30 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 拉曼光谱的应用。 7.4 荧光相关光谱技术 荧光相关光谱通常用来研究可自由扩散的荧光分子，本节简单介绍荧光相关光谱技术的原理和发展。本节重点内容包括: , 荧光相关光谱技术是一种利用荧光强度随时间的涨落进行分析检测的荧 -15光光谱技术。荧光相关光谱技术具有极高的灵敏度，可测定微区内(<10 L)荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度涨落，是一种重要 的单分子检测技术。 , 典型的荧光相关光谱仪器结构包括光源、共聚焦光学系统、检测器和数 据采集及控制系统等部分。 , 荧光相关光谱技术的应用:测定物质的扩散系数和分子间相互作用的检 测。 7.5 生物大分子检测 生物大分子是生物体的重要组成成份，不但有生物功能，而且分子量较大，其结构也比较复杂，它们的分子量往往比一般的无机盐类大百倍或千倍以上。本小节介绍生物大分子的种类和相应的光学检测方法。重点内容包括: , 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或 更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂质、糖类。 生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，蛋白质的组成单位 是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸等等。 , Raman光谱技术，在拉曼光谱中水的拉曼吸收很弱，因此很多水溶性物 质，包括一些生物大分子及其他生物体内组分可以用拉曼光谱来研究。 , 表面等离子体共振传感技术，金属表面存在自由电子按一定的方向水平 移动，当受到光照射后，光能使金属表面电子发生共振，入射光强度减 弱，导致反射角度出现偏差。将配体固定在芯片上，分析物流过芯片表 面上，结合量的变化导致SPR信号的产生。 31 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 第8章 其它常见的生物光子学技术 8.1 流式细胞分析技术 , 流式细胞分析技术，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的 单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分 选的现代细胞分析技术。 , 流式细胞仪集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技 术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 , 流式细胞分析技术的基本步骤包括:荧光标记细胞中的生物物质;利用 流体力学的原理使得液流汇聚得非常细从而使得其中的细胞能够逐一通 过测量区;激光照明并采集光响应信号;数据获取和处理; , 被采集到的光响应包括前向散射信号(FSC)和侧向散射信号(SSC)， 以及各种细胞表达物质的荧光剂的荧光强度。 8.2 生物芯片 , 利用特异性的分子间相互作用，将待检测样品标记后与生物芯片反应， 得到信号值。信号值代表了结合在探针上的待测样本中的特定大分子的 信息。 , 广义的生物芯片指一切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理 器。包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路 结合起来的仿生芯片、缩微化的实验室即芯片实验室以及利用生物分子 相互间的特异识别作用进行生物信号处理的基因芯片、蛋白质芯片、细 胞芯片和组织芯片等。狭义的生物芯片就是微阵列，包括基因芯片、蛋 白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。 , 生物芯片的发展趋势:能耗低，物耗少，污染小;更可靠，更廉价，更 快捷;安全性更高;从研究到生产无需费时费力的中试放大过程。 , 生物芯片急需解决的问题:生物芯片的重复利用;生物芯片的多重用途; 统一的行业标准;定量分析;降低检测生物芯片的仪器的价格。 32 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 8.3 激光光镊技术 , 光镊是一种微操控工具，它能利用聚焦后的激光束捕获生物细胞或者微 米尺度的微粒，它实现光捕获的作用力来自于微粒折射光导致的光子动 量的改变。 , 光镊有很多重要的应用，如研究单个生物分子的结构和动态变化等。 , 光镊可以对单个活体生物以非接触的遥控方式，实施无损无菌操控;实 时动态跟踪、进行微小力的测量，光镊具有视性和无损穿射性。 8.4 光动力学疗法 , 光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是指某些生物染料，能被 恶性肿瘤选择性吸收和滞留，在特定波长的照射下，能激发出特异的荧 光(用于诊断)。在有O条件下，接受波长与吸收峰相一致的光照射时，2 其光化效应，破坏其所在的组织，这一系列化学反应过程，被称为光敏 反应，利用这种效应治疗恶性肿瘤，称为光动力学疗法。 , 光动力作用的四要素:基质，敏化剂，光源，氧。 , 光动力学疗法具有很多优点，同时也存在着目前还未克服的一些缺点， 使得治疗的效果还不尽如人意。 8.5 生物光子学中的纳米技术 , 纳米医学是一个科学、工程学和医学交叉的应用领域，在分子成像、分 子诊断以及靶向治疗中具有广泛应用。基本原理是:纳米尺度的颗粒(如 量子点、氧化铁纳米晶体、金纳米颗粒等)具有块材料所不具备的特殊 结构、光学或电磁特点，当与疾病靶向配体相连时，可以靶向定位到疾 病特异性蛋白，并在病症部位发生富集。在5-100 nm范围，纳米颗粒具 有很大的比表面积，并可在其表面修饰功能基团，与多种用于诊断(如光 学、放射线及电磁成像)和治疗(抗癌、抗HIV药物)的分子绑定形成共 轭物。 , 在纳米颗粒的研究中，应用最广泛的纳米颗粒是量子点(quantum dots， QDs)，也称半导体纳米微晶体，是一种由II-VI或III-V族元素组成的 纳米颗粒，目前应用最为广泛的量子点是以CdSe，CdTe等为核，ZnS， ZnSe，ZnTe等为壳的核/壳结构的纳米颗粒。 33 《生物光子学》讲义 2010年7月编制 , 作为一种新型成像对比剂，量子点已经在生物医学显微成像领域中发挥 重要作用。 34