【word】 厌氧分解纤维素细菌P4-3的产酶特性及其纤维小体组分的定位

【word】 厌氧分解纤维素细菌P4-3的产酶特性及其纤维小体组分的定位 厌氧分解纤维素细菌P4-3的产酶特性及其 纤维小体组分的定位 中国沼气ChinaBiogas2012,30(1)3 厌氧分解纤维素细菌P4.3的产酶特性及 其纤维小体组分的定位 马诗淳,黄艳--,赵银瓶,孙颖杰,贺静,邓宇 (1农业部沼气科学研究所,成都610041;2农业部农村可再生能源开发与利用重点实验室,成都610041) 摘要:中温厌氧纤维素分解菌P4-3可产生活性较高,热稳定性较强的纤维素酶.通过检测CMC酶活性,研究了 培养时间,温度,培养基初始pH值,碳源和氮源对其产酶的影响.通过破壁处理,检测不同部位粗酶液中的CMC 酶,滤纸酶及13一葡萄糖苷酶活性,分析了其纤维小体中三种酶组分的分布和比例.结果显示,利用滤纸和纤维二 糖作为底物达到最大酶活的时间分别为144h和72h;产酶最佳温度为40~C,pH值为7.5,纤维二糖为最佳碳源, 酵母粉为最佳氮源.培养144h,CMC酶,滤纸酶及B一葡萄糖苷酶在上清液,未破壁茵体悬浮液与破壁茵体悬浮 液中的活性比分别为9:1:1,14:4:3和6:3:4. 关键词:厌氧;纤维素水解;纤维小体;组分 中图分类号:TK6;$216.4文献标识码:A文章编 号:1000—1166(2012)O1—0003—06 EnzymeProductionCharacteristicsofAnaerobicCellulolyticBacteriaStrainP4-3andtheLocationofCellulosome Components/MAShi-chun,HUANGYan,ZHAOYin-ping,SUNYing-jie,HEJing,DENGYu.?/ (1.BiogasInstituteofMinistryofAgriculture,Chengdu610041,China;2.KeyLaboratoryofDevelopmentand ApplicationofRuralRenewableEnergy,MinistryofAgriculture,Chengdu610041,China) Abstract:MesophilicanaerobicceUulolyticbacteriumstrainP4.3couldproducehighactiveandthermalstableceHulase. Effectsofculturingperiod,temperature,imtialpH,carbonsonrce8andnitrogensourcesoncellulaseproductionofs~ain P4-3wereanalizedbydetectingtheCMCaseactivity.TheactivitiesofCMCase,FPA,andB-glucosidaseincrudeenzyme solutionfromsupernatant,membrane,andbrokencellsuspensionweredetermined.ProportionanddistributionofeeHulo— somecomponentsincultureswereanalyzed.TheresultsindicatedthatthemaximumceUulaseactivityofstrainP4-3印- pearedafter144hofculturingwitllfilterpaperassubstmte.and72hwithcellobioseassubstrate.Theoptimaltempera- ture,pH,carbonsourceandnitrogensourceforCMCaseproductionwere4|D ?,pH7.5,cellobioseandyeastextract.After culturing144h,theproportionsofCMCase,FPAandB?glucosidaseinsupem atant,membrane,andbrokenceilsuspen- sionwere9:1:1,14:4:3and6:3:4,respectively. Keywords:anaerobic;cellulolytic;cellulosome;competent 1引言 纤维素水解是生物质能源化利用的关键步骤, 生物法水解纤维素具有无污染,能耗低的独特优势. 生物法水解纤维素类原料的本质是纤维素酶的水解 作用.但是,目前已有的纤维素酶E匕活力不高,用于 纤维素预处理时效率较低.寻找高产纤维素酶的微 生物是解决生物预处理技术的重要途径.目前,筛 选到的产纤维素酶的微生物主要为木霉,曲霉及部 分细菌.与木霉,曲霉不同,厌氧纤维素分解细菌的 纤维素酶是由葡聚糖外切酶,葡聚糖内切酶和p一 葡萄糖苷酶等组成的纤维小体(Cellulosome)?, 通过纤维小体将纤维素水解为糖类的同时将其转化 为乙醇,氢气等绿色能源,在可再生能源的转化过程 中具有显着的优势,在CBP(Consolidatedbioprocess— ing)工艺开发中具有潜在的应用价值. 菌株P4.3是分离自泥炭的厌氧纤维素分解菌, 具有较高的纤维素酶活力,其纤维素酶包括CMC酶 (CMCase),滤纸酶(VPF)及B-葡萄糖苷酶活性三 种组分.能够利用滤纸,纤维二糖,木聚糖产生乙 收稿日期:2011.12-02 项目来源:”生物燃气工程项目”L~(2011BAD15B04);四川省科技基础条件平台项目”四川省微生物资源共享平台(2Ol1年)’’ 作者简介:马诗淳(1983一).女,硕士,主要研究方向为生物质厌氧转化. 通讯作者:邓宇.E-mMl:dengkaiyu@yahoo.tom.ca 4中国沼气ChinaBiogas2012,30(1) 醇,乙酸,H等引.文章对其产纤维素酶的影响因 素及纤维小体的组成进行了研究. 2 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 2.1材料 分离自泥炭的厌氧纤维素分解菌P4-3,培养方 法见参考文献【4J. 2.2方法 2.2.1纤维素酶活力测定 样品制备见参考文献,纤维素酶活和生物 量利用BeckmanCultureDU800紫外分光光度计分 别测定540nm和600nm的OD值. 2.2.2培养条件对厌氧纤维素菌产酶的影响 (1)培养时间对厌氧纤维素菌株P4.3产纤维 素酶的影响 利用厌氧亨盖特技术配制,分装培养基,将300 mL培养基分装于500mL盐水瓶中,分别以l%纤 维二糖和0.5%滤纸(w/V,1.0cm×3.0cm)作为 唯一碳源,接种量2%,35%静置培养.分别取以纤 维二糖为底物培养24h,36h,46h,58h,72h,84h, 96h,120h的发酵液,以滤纸为底物培养2d,3d,4 d,5d,6d,7d,8d,9d的发酵液,离心收集上清测 定其滤纸酶活力,CMC酶活力及B一葡萄糖苷酶活 力及生物量(OD60o)”... (2)培养温度与培养基初始pH对P4-3产酶的 影响 培养温度为2O?,25?,30?,35?,40?,1% 纤维二糖作为唯一碳源,接种量2%.测定最佳培 养时间时CMC酶活力及生物量(OD鲫). (3)培养基初始pH对菌株P4-3产纤维素酶的 影响 pH为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,1%纤维二糖作 为唯一碳源,接种量2%.置于最佳产酶培养温度 下培养.测定最佳培养时间时CMC酶活力及生物 量(0D600). (4)碳源对菌株P4-3产纤维素酶的影响 配制不含碳源的无菌无氧培养基,以葡萄糖,滤 纸条,纤维二糖,CMC—Na,纤维素粉MN300和微晶 纤维素作为底物,可溶性底物终浓度为1%,滤纸和 微晶纤维素浓度为0.5%,接种量2%.测定最佳培 养条件下CMC酶活力[.?加】. (4)氮源对菌株P4.3产纤维素酶的影响 配制不含氮源的无菌无氧培养基,接种前加入 无菌无氧的尿素,NHC1,NHNO3酵母粉和蛋白胨 溶液作为氮源,接种量2%.测定最佳培养条件下 CMC酶活力. 1.2.3菌株P4-3纤维素酶的热稳定性 将酶液分别置于25?,30%,35%,40%,45%, 50cI=,55?,6O?,65o【=,70?,75?,85?水浴锅中保 温30min,以DNS法测定CMC酶的活力. 1.2.4菌株P4-3纤维素酶的定位 以滤纸作为碳源培养菌株P4-3,采用修正的方 法制备粗酶液u引. (1)上清液:最佳培养条件下培养物于4?, 10000rpm离心10min,取上清液. (2)未破壁菌体悬浮液:制备上清液时离心所 得菌体用pH6.8PBS重新悬浮. (3)破壁菌体悬浮液:制备上清液时离心所得 菌体用pH6.8PBS重新收集,经超声细胞粉碎机破 碎菌体,工作时间3s,间隔3s,处理200次.破碎 2.0? o o 15 10 0.5 00 2345678910 时问,天 以滤纸为碳源时培养时间对菌株P4—3产酶的影响 2o柏608o100120 时间,h 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0g o 0 1.5 10 0.5 0O 图2以纤维二糖为碳源时培养时间对菌株P4.3产酶的影响 注:滤纸酶的酶活单位为滤纸在酶的催化下,每nfin形成1I~nol葡萄 糖所用该酶的量为1个酶活单位Unit(岬葡萄糖?min) =;”? 山.3,姆髓 拍???? 山.,R蝗髓 中国沼气China8iog~2012,30(1)5 后10000rpm离心10min,取上清液. (4)菌液:最佳培养条件下培养物. 2结果与分析 2.1培养时间对茵株P4-3产纤维素酶的影响 2.1.1以滤纸为底物时培养时间对P4.3产酶的影 响 菌株P4-3以0.5%滤纸作为唯一碳源(图1) 时,接种后,三种纤维素酶的活力随菌体浓度的增加 而持续上升.培养第5天,菌体浓度达到最大值,而 纤维素酶活力最大值则滞后l天,此时滤纸酶,CMC 酶和B一葡萄糖苷酶活力分别为3.35U?mL,, 0.99U?mL和0.78U?mL,. 2.1.2以纤维二糖为底物时培养时间对P4-3产酶 的影响 菌株P4-3以1%纤维二糖作为唯一碳源时(图 2),培养前60h,三种纤维素酶的活力随菌体浓度 迅速增加而持续上升.培养至72h,滤纸酶,CMC 酶和B一葡萄糖苷酶活力达最大值,分别为1.94 U?mL,,0.81U?mL和0.69U?mL一. 以纤维二糖为底物时,FPA,CMC酶和B.葡萄 糖苷酶活比例的变化趋势与滤纸相似. 2.1培养条件对P4-3产酶的影响 2.2.1培养温度对菌株P4—3产CMC酶的影响 253o3540 温度,? 3-a 2_5 2O 1.5c}o 1O O5 00 图3温度对菌株P4-3产酶的影响 不同培养温度下,菌株P4-3以1%纤维二糖为 底物,培养72h时产生CMC酶的活力及生物量见 图3.菌株P4-3在30~(2—40~(2时,生长速率与CMC 酶活力均呈升高趋势,40%时CMC酶活力达到最 大值. 2.2.2培养基初始pH对菌株P4-3产CMC酶的影 响 不同初始pH值的培养基中,菌株P4—3培养72 h时产生CMC酶活力及生物量如图4所示.pH? 7.0时,CMC酶活力逐渐升高,pH7.5时,CMC酶 活力最高.菌株P43在初始pH7.0的培养基中比 生长速率最大,由于底物发酵产生的挥发酸可以微 弱降低pH值,因此,培养72h后,初始pH>7.0的 培养基中的菌体浓度稍高于pH<7.0的培养物. 6.06.57.07与80 pH 图4pH对菌株P4-3的影响 2.5 2.0 t.5g 口 o 10 0.5 00 2.1.3碳源对菌株P4.3产纤维素酶的影响 以不同类型的碳水化合物作为底物,培养基初 始pH为7.5,35?培养120h,菌株P4-3的CMC酶 活力及生物量见表l.可溶性和不可溶性底物均可 被菌株P4—3利用并在培养物中检测出CMC酶活 性,纤维二糖作为底物时,菌株P4-3的CMC酶活力 最高. 表1碳源对菌株P4.3产酶的影响 2.1.4氮源对菌株P4-3产纤维素酶的影响 菌株P4—3可以利用有机和无机氮源产生纤维 素酶,利用有机氮源所产生的CMC酶活力比利用无 机氮源高,同时,P4-3利用有机氮源生长速率较高. 利用0.2%酵母粉所产生的CMC酶的比活力最大, ?? L.]E.n,呈{9s?0o ?? L.]旱_『蜒.曲?oo 6中国沼气ChinaBiogas2012,30(1) 为0.42U?mL,,其他依次为0.2%蛋白胨,0.2% NH4C1和0.2%尿素. 表2氮源对菌株P4-3产酶的影响 2?. 1?8 =J ‘. ‘‘ )ig1.0 喜a8 舌..e .?4 .?2 0.0 253035?4550eo6570758085? 温度,? 图5菌株P4.3纤维素酶的热稳定性 10o 8D 6o 蝗 髓 40靛 2o O 2.2菌株P4.3产生的纤维素酶的热稳定性 以未经保温处理酶液的CMC酶酶活力作为 100%酶活,处理后CMC酶酶活及相对活力如图5 所示.酶液于25?一45cI=处理后,CMC酶酶活力基 本保持稳定.5O?之后,随着温度的升高,酶活力逐 渐降低,55?处理后CMc酶酶活力可以保持原酶活 的88%,处理温度为6O?时,CMC酶酶活力保持原 酶活的54%.因此,菌株P4-3所产生的纤维素酶 具有较好的热稳定性. 2.3菌株P4—3的纤维小体组分在细胞中的定位 2.3.1CMC酶定位 菌株P4.3不同部位的CMC酶酶活力大小为未 破壁菌液>上清液>破壁菌液>破壁菌体悬浮液> 未破壁菌体悬浮液.培养144h时,培养物上清液, 未破壁菌体悬浮液与破壁菌体悬浮液的CMC酶酶 活之比约为9:1:1,破壁菌体悬浮液与未破壁菌体 悬浮液酶活力差异较小,因此分离菌株的CMC酶 主要游离于细胞外,少量分布于细胞膜上,膜内亦具 有极少量CMC酶活性组分.未破壁菌液CMC酶酶 活力大于上清液与未破壁菌体酶活之和,推测结合 于细胞膜上的CMC酶酶与游离CMC酶酶在催化过 程中具有一定的正协同作用. 表3不同酶液中CMC酶酶活 2.3.2滤纸酶定位 菌株P4-3产生的不同粗酶液的滤纸酶活力见 表4.菌株P4-3培养第144小时,上清液,未破壁菌 l4:4:3,因此,滤纸酶多数以游离形式存在,少数结 合于细胞上.未破壁菌液酶活高于上清液与菌体悬 浮液酶活之和,可以推测游离的滤纸酶与结合于细 体悬浮液与破壁菌体悬浮液的滤纸酶活力之比约为胞膜上的滤纸酶具有一定的协同作用. 表4不同酶液中滤纸酶酶活 2.3.3B一葡萄糖苷酶定位如表5所示,菌株P4-3的上清液,未破壁菌 体 中国沼气ChinaB/og~s2012,30(1)7 悬浮液与破壁菌体悬浮液的B一葡萄糖苷酶活力之 比约为6:3:4,未破壁菌液的B-葡萄糖苷酶最大,破 壁菌体悬浮液比未破壁菌体悬浮液稍大.由此推 测,在菌株P4—3的纤维素酶组分中,30%以上的 B一葡萄糖苷酶与细胞膜相结合. 表5不同酶液中8一葡萄糖苷酶酶活 3讨论 (1)以滤纸和纤维二糖为底物时,菌株P4-3的 最佳产酶时间分别为144h和72h.以纤维二糖为 底物时,最适产酶温度和pH为40?和pH7.5, 65cI=时,酶活半衰期为30min. C.cellulolyticum既具有与细胞表面结合的纤维 素酶复合体(又称纤维小体),又具有游离的纤维素 酶复合体,在指数生长末期和稳定期,与细胞结合的 纤维小体可能会脱离细胞游离至上清液中J,因 此,随着培养时间的延长,菌株P4—3培养物的上清 液中纤维素酶活不断增加,最大酶活出现.另外,在 限制碳源浓度的情况下,C.cellulolyticum首先附着 于纤维素上,通过纤维素酶对纤维素进行水解,随着 纤维素的水解和细菌的增殖,附着位点减少,绝大多 数细菌和纤维小体被释放到上清液中【1-12],纤维素 酶活最高点滞后于生物量最高点.衰退期菌体发生 自溶,培养第7天,由于细菌的二次生长,菌体浓度 出现短暂,微弱的上升. 菌株P4-3发酵初期,在相同的培养时间内,分 别以滤纸和纤维二糖为底物的培养液中三种酶组分 的活力比值不同.培养48h时,以滤纸为底物的发 酵液中CMC酶的酶活占总酶活的73.7%,FPA为 4.2%,3-葡萄糖苷酶为22.1%;以纤维二糖为底物 时分别为62.8%,4.I%和33.2%.由此可推测,滤 纸对内切B一1,4葡聚糖酶(CMC酶)和外切一1,4葡聚 糖酶(FPA)的合成具有诱导作用;l%纤维二糖对 外切p一1,4葡聚糖酶和内切B一1,4葡聚糖酶可能具 有微弱的抑制作用,而对B一葡萄糖苷酶却有一定的 诱导作用.这一结论在其他文献中也有相关报 道?. (2)菌株P4-3利用不溶性纤维素类底物所产 生的纤CMC酶酶活力高于可溶性纤维素底物.这 一 现象一方面可能与纤维素酶的合成受一定浓度的 纤维素降解底物的诱导有关,较高浓度的可溶性底 物(如葡萄糖和纤维二糖)则会抑制该酶的活性. 另一方面,该现象也可能与厌氧梭菌的代谢通量应 答有关?’J.在低碳流量下,菌株P4—3纤维素酶的 关键催化亚基和细胞表面复合体水平增加,从而促 进菌体对纤维素的利用能力. (3)培养144h后,CMC酶,滤纸酶及B一葡萄糖 苷酶在上清液,未破壁菌体悬浮液与破壁菌体悬浮 液中的活性比显示纤维素酶活力主要存在于上清液 中.与其他两种组分相比,B一葡萄糖苷酶在胞内和 膜上存在的比例较高.但是本实验中是采用超声波 对样品进行破壁处理,这种处理方法可能会影响纤 维索酶组分的活性.因此,还需要通过荧光定量 PCR等方式对纤维素酶不同组分的定位进行进一 步确定. 参考文献: [1]B61aiehJ,CTardif,AB61aich,eta1.TheceUulolytic systemofClostridiluncellulolyticum[J].Joumalofbio— technology,1997,57(1—3):3—14. [2]SchwarzW.Theeellulosomeandcellulosedegradationby anaerobicbacteria.AppHed[J]microbiologyandbio- technology,2001,56(5):634—649. [3]DesvauxM.TheeeIIulosomeofClostridiumceUulolyticum [J].EnzymeandMicrobialTechnology,2005,37(4): 373—385. 【4]马诗淳,罗辉,杨丽丽,等.中温厌氧纤维素菌的分离 鉴定,系统发育学分析及其酶学性质的研究[J].中 国沼气,2009.27(003):3—7. [5]马诗淳.沼气发酵微生物代谢调控技术研究[D]. 2009,中国农业科学院. [6]吴窈画,邵蔚蓝,产结晶纤维素酶的嗜热菌鉴定及其 酶学性质[J].南京师大:自然科学版,2007.30 (002):84—88: (下转第16页) 16中国沼气ChinaBiogas2012,30(1) 强酸性或强碱性条件下.当pH为9.0时,产氢菌 比耗氢菌活性差距最大,此条件下更适合产氢菌生 长,此时,比产氢速率达到最大,可达24.23 mmolH2?gCOD一d,. 1结论 (1)以高浓度有机废水为发酵底物,接种颗粒 污泥进行厌氧发酵制氢,通过批量试验研究初始pH 值对微波预处理颗粒污泥厌氧发酵产氢的影响.结 果表明,当进水初始pH9.0时,颗粒污泥产氢效果最 好,比产氢速率达到24.23mmolH2?gCODd,.COD 平均去除率为31%左右,挥发性脂肪酸总量为 3768.24mg?L,. (2)初始pH较低(pH?5.0)时,过度的酸积累 导致系统严重酸化,对污泥的活性影响很大;初始 pH值较高(pH?10.0)时,超出了颗粒污泥厌氧发 酵适宜的pH范围,对微生物也产生了一定的抑制 作用.可见,初始pH过高或者过低,对微生物的生 长和代谢都会产生抑制作用,最终导致系统不稳定, 产氢量大幅降低. 参考文献: [1] [2] PatrickC,Hallenbeck,DipankarGhosh,MonikaT, Skonieczny,VivianeYargeau.Microbiologicalandengi- neefingaspectsofbiohydrogenproducfion[J].IndianJ Microbiol,2009,49:48—59. MahyudinAbdulRachman,etc.Enhancedhydrogenpro- ductioninalteredmixedacidfermentationofslucoseby enterobacteraerogenes[J].Journaloffermentationand bioengineering,1997,83(4):358—363. [3]任南琪,郭婉茜,刘冰峰.生物制氢技术的发展及应用 前景[J].哈尔滨工业大学,2010,42(6):855— 863. [4]黄惠莹,周兴求.微波预处理对厌氧颗粒污泥发酵产 氢的影响[J].中国给水排水,2010,26(23):13—16. 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