【doc】ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用

【doc】ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用 ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用 应用生态2007年4月第l8卷第4期 ChineseJournalofAppliedEcology,Apr.2007,18(4):919—927 ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用木 桂富荣郭建英万方浩? (中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100094;云南农业大学植物保护学院,昆明 650201;农业部外来入侵生物预防与控制研究中心,北京100081) 摘要外来生物入侵是对全球生物多样性最为严重的威胁之一,对经济安全,生态安全,社 会安全,国际利益和国际贸易都具有重要影响.入侵种群的分子标记分析是外来入侵生物研 究的重要途径.其中,简单序列重复区间标记(inter—simplesequencerepeat,ISSR)是一种基于 微卫星序列发展起来的新型分子标记,具有简便,快捷,结果稳定和DNA多态性高等优点.本 文系统地介绍了ISSR分子标记的原理,技术特征及其实验操作,并简要地阐述了ISSR分子 标记在外来入侵植物的群体遗传结构分析,遗传多样性检测,入侵来源推测,入侵植物的分布 模式及其亲缘关系分析,入侵植物的繁育特性检测等方面的应用及其研究进展. 关键词ISSR外来入侵植物遗传多样性检测亲缘关系分析 文章编号1001—9332(2007)04—0919—09中图分类号Q943文献标识码A ApplicationofISSRmolecularmarkerininvasiveplantspeciesstudy.GUIFu—rong'一.GUO Jian—ying,WANFang—hao(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsect Pests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing1000 94,Chi— na;CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;Center rManagementoflnvasiveAlienSpeciesofAgricultureMinistry,Beijing100081,China).一 Chin. App1.Eco1.,2007,18(4):919-927. Abstract:Alienspeciesinvasionisoneofthemostimportantdriversofworldwideenvironmental change,whichmayresultinenvironmentaldegradation,biodiversityloss,andfoodandwatershort— age.Itmayalsoincreasethepossibilityandseverityofnaturaldisasters,anddamageinternational tradeandbenefits.Inlasttwodecades,DNA— basedmolecularmarkerswerewidelyusedtodetect thegeneticdiversityofinvadedalienspecies.Inter— simplesequencerepeat(ISSR)isamicrosatel— lite— basedtechnique,withthesuperioritiesofsimple,quick,reliable,andgeneratinghigherlevels ofDNApolymorphism,andbeingusedasanewmolecularmarkerforgeneticstudy.Thispaperin— troducedtheprinciples,characteristicsandproceduresofISSR,andsummarizeditsapplicationsin studyingthegeneticstructure,geneticdiversity,origin,distributionmode,phylogenesis,and breedingfeaturesofinvasiveplants. Keywords:inter— simplesequencerepeat(ISSR);invasiveplant;geneticdiversitydetection; phylogeneticanalysis. 随着国际贸易的发展和人们交往的增加,以及 全球环境的变化,生物种类在全球扩散的机会大大 增加,越来越多的物种被有意或无意地带至其原产 地以外的地区.其中的许多物种在其传人地建立种 群并大量繁殖,扩散,排挤本地物种,改变传人地区 国家重点基础研究发展规划项目(2002CB111400)和云南省科技 攻关资助项目(2006SG23). $通讯作者.E-mail:wanfh@cjac.org.cn. 2006-04-06收稿,2007-01-09接受. 的群落结构和生态系统的结构和功能,"],造成了 严重的生态和经济问题?,给传人地区的农,林, 牧,渔业等造成了严重的损失.目前,外来生物入 侵已是对全球生物多样性最为严重的威胁之一c6, 因此,解析其入侵机制是生物入侵的前沿科学问题. 外来入侵植物是指由于自然或人为的因素被引 入到其原生态系统以外的地区,并对新生态环境或 其中的物种构成一定威胁的植物?61.MJ.许多物种在 入境初期表现为中性,甚至良性,当它们离开原来的 生态系统后,在新的生态系统中,由于缺少了原系统 应用生态I8卷 中其他物种和天敌的制约而表现为生机盎然,甚至 疯长蔓延成灾.根据徐海根等引报道,目前我国 共有283种外来入侵物种,其中外来入侵植物188 种,占入侵种的66%.通常,外来植物的成功入侵具 有其快速进化特点和适应性进化机制,入侵种 的遗传变异程度决定其适应性进化的能力大小. 遗传多样性的高低反映了物种对外界环境适应能力 的强弱.外来植物的遗传多样性影响着其对新环 境的适应性.具有较高遗传多样性的外来植物,其适 应性和抵抗病虫害,农药的能力越强,因而防治 的难度也就越大?"J.由此可见,确定外来入侵植 物的遗传多样性对于其有效管理和防治具有重要意 义. 遗传标记是研究生物遗传变异规律及其物质基 础的重要手段,是检验遗传多样性的有效方法. 分子标记是一种比较理想的新型遗传标记形式.它 直接在DNA水平进行操作,通过一定方式或特殊手 段来反映生物个体或种群之间具有差异性状的 ,比传统的形态学,细胞学和生物化学方 DNA片段 法更为直接和准确.因此,该技术一经出现,就迅速 在物种进化,亲缘关系分析和遗传多样性研究等方 面得到广泛应用.在外来生物研究中,分子标记可提 供有关外来物种入侵路径及其遗传变异程度的相关 信息],可以帮助我们更好地了解入侵物种的繁育 系统,决定入侵生物的入侵源,确定更准确的分类依 据J,并为外来生物生态学和种群学的研究和发展 提供新思路…,为入侵生物的预防和控制提供理论 依据. 简单序列重复区间(inter-simplesequencere— peat,ISSR)标记是一种基于微卫星(simplesequence repeat,SSR)序列发展起来的,利用PCR扩增进行检 测的,十分有效的分子标记,首先由加拿大的Zietk— iewicz等进行描述.他们发展了微卫星(即简单 序列重复,SSR或短串联重复,STR)技术,在微卫星 重复系列的5'端或3'端加上2,4个随机选择的 核苷酸作引物,对两个相邻反向微卫星重复系列之 间的DNA系列区域进行扩增?.该策略的优点是 在基因组上,只有与锚定的核苷酸匹配的那些位点 才能被靶定,从而导致位于反向排列的间隔不太大 的重复序列间的基因组节段得到扩增,避免了引物 在基因组上的滑动,可以提高PCR扩增反应的专一 性【16,85].该技术克服了RFLP技术的局限性和 RAPD的假阳性』,可以有效地应用于基因多态性 分析,是目前广泛应用的一种新型基因标记. 2ISSR分子标记技术简介 2.1ISSR标记原理I,A ISSR标记的基础是基于真核生物基因组中广 泛分布的微卫星重复系列.它与SSR标记技术相 反,是直接利用SSR序列作为引物,用PCR方法扩 增两个SSR之间的单拷贝序列J.在真核生物中, 大约每隔10,50kb就存在1个微卫星引,其主要 以2个核苷酸为重复单位,也有一些微卫星重复单 位为3个核苷酸,极少数为4个核苷酸或更多.Mor— gante和Olivieri_4对34个高等植物微卫星序列的 研究表明,微卫星序列在高等植物DNA中大量分 布,大约50kb中就有1个双碱基或三碱基重复型 微卫星存在.Wang等对54个植物种的核DNA 和28个植物种的细胞器DNA的1,4碱基重复型 微卫星研究发现,平均23.3kb就有1个微卫星重 复系列,双子叶植物中的微卫星数量大于单子叶植 物,核DNA中的微卫星重复系列数量多于细胞质 DNA中的微卫星重复系列.基于微卫星重复系列作 为引物来扩增基因组DNA的多位点方法,在实验过 程中可由SSR重复单元序列的改变,引物长度不同 以及5'和3'末端锚定核苷酸的有无产生不同的扩 增模式.依赖于不同引物的使用,扩增产物可 以是SSR之间的序列或是SSR之间的序列加上 SSR序列.DNA复制时,两条链上的重复单元可能 在退火时错位,于是导致在新合成的链上微卫星长 度增加或减少.DNA滑动所导致微卫星的多态性, 可通过PCR检测出来并用于特征鉴别. 1SSR利用人工合成的16,18个核苷酸重复序 列(2,3,4或5核苷酸重复)作为引物,在引物的3' 端或5'端加上2,4个随机选择但通常是简并的核 苷酸,对传统意义上2个SSR之间的一段短DNA序 列进行PCR扩增,而不是扩增SSR本身.在动植物 基因组中存在大量的双核苷酸重复序列,因此,大多 数ISSR标记所用PCR引物是基于双核苷酸重复序 列的.一般在引物的3'端或5'端接上2,4个嘌呤 或嘧啶碱基,以对具有相同重复形式的许多SSR座 位进行筛选,使得最终扩增出的ISSR片段不致太 多,也可用非锚定的SSR系列作为引物?.如果基 因组在这些扩增区域内发生DNA片段插入,缺失或 碱基突变以及其它结构变异,就可能导致这些区域 与引物结合的数量和位置的改变,从而使PCR扩增 片段数量及长度改变,通过电泳即可检测出基因组 在这些SSR位点的多态性.由于在真核生物基因组 4期桂富荣等:ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用 中散布有大量的SSR序列,因此,基因组可能含有 丰富的ISSR多态信息.每个ISSR—PCR反应通常可 扩增25—50个片断,产生条带数多与位点重复单元 的核苷酸数成反比.微卫星重复系列的广泛分布 和易检测性促进了ISSR标记的发展.随着获得SSR 重复单元类型的增加,用SSR序列作为引物直接进 行PCR扩增的潜在研究将不断增多. 2.2ISSR标记的优点与不足 众所周知,RAPD的不稳定性限制了其发展,而 RFLP,AFLP,SSR等分子标记技术操作复杂,耗时, 昂贵,也为其普及带来了障碍.ISSR标记技术利用 基因组中有关SSR序列的信息设计引物对目标物 种的基因组DNA进行扩增,克服了SSR及RAPD标 记技术的某些缺点.与RAPD相比,ISSR技术采用 了较长的引物,因此引物具有更强的专一性,与模板 结合的强度提高,降低了杂带的干扰,随之提高了实 验结果的可重复性,结果更可靠.每个引物能产生更 高的多态性,同时具备RAPD的简便及易操作 性[52,57,71].与RFLP,AFLP相比,ISSR更快捷,稳定, 成本较低,DNA用量小,安全性较高;与SSR相比, ISSR不需要预先获知序列信息,大大减少了多态性 分析的预备工作,程序简化,因而成本更低.另外, ISSR引物可在不同物种间通用,而SSR则在物种间 非常保守. 作为一种新型基因标记,ISSR标记具有如下优 点:1)不受季节和环境的影响.它可以在生长周期 的任何阶段进行检测.2)ISSR的引物开发费用 低廉.ISSR引物在开发时不象SSR引物需测序获得 SSR两侧的单拷贝序列,它是用半随机引物进行扩 增J,可基于任何在微卫星位点发现的SSR重复单 元(2,3或4个核苷酸等),并且侧翼靶标简单序列 重复的任何一端均能够锚定基因组序列;它 无需预先知道序列的信息即可检测到微卫星的高度 多态性,可以在没有任何分子生物学研究基础的情 况下进行基因组指纹图谱构建,为物种演化和分类 研究提供DNA水平上的证据.3)多态性丰富.它可以同时检测基因组多个SSR位点,适用于任何富含 SSR重复单元的物种,可同时提供多位点信息和揭 示不同微卫星座位个体间变异的信息,获得丰富的 多态性,能比RFLP,RAPD提供更多的遗传信 息j.例如Nagaoka和Ogihara在小麦的ISSR 标记研究中发现,ISSR标记可获得几倍于RAPD标 记的信息量,同时发现其较高的多态性在检测物种 间亲缘关系时,其精确度几乎可同RFLP标记相比 拟.Bodo—Slotta等?用ISSR标记引物研究加拿大 蓟的种群结构时发现,每个ISSR位点可平均产生 11个多态性等位基因.4)呈孟德尔方式遗传,结果 记录方便,实验操作简单,检测方便快捷,一旦扩增 条件优化,由琼脂糖凝胶电泳即产生可读性信息,甚 至是对于种内变异的高度多态性.5)ISSR的引 物较长,实验稳定性高,结果可靠,PCR条件严 谨J,能快速扫描对应的靶标区域.6)模板需要量 少,实验成本低.目前加拿大哥伦比亚大学已推出了 成套ISSR引物试剂盒,可用于多个物种的ISSR标 记分析引物筛选,已发表的有关ISSR标记的文献大 多使用上述引物试剂盒. ISSR标记的不足之处在于它大多为显性标记, 多数情况下不能区别一个位点扩增的DNA片段,解 决交配系统,计算杂合度和父系分析等问题时效果 不佳;且不同物种的微卫星系列不同,造成引物在筛 选上具有相对的不随机性;同时,PCR扩增时最适 反应条件需要一定时间的摸索, 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 严格掌握循环 扩增退火温度. 2.3ISSR标记实验操作 2.3.1DNA制备新鲜或干燥冷冻植物组织器官材 料(如叶片,冬芽,种子等)均可用于提取模板DNA. 目前植物组织DNA的提取通常采用CTAB法.., 一 般不需要对提取的DNA进行纯化,但需对DNA 样品质量和浓度进行测定. 2.3.2ISSR—PCR反应体系为了保证ISSR—PCR反 应结果的清晰,准确,必须对扩增条件进行优化.影 响扩增反应的主要因素有Taq酶,引物浓度及其退 火温度,Mg浓度,模板浓度等.ISSR—PCR反应体 系中,不同的实验体系和不同物种的引物浓度不同, 需通过设置不同的浓度梯度比较确定.绝大多数IS— SR—PCR反应体系中,Mg浓度一般为1.5,3mmo] ? L..,但不同实验材料,不同引物的最适Mg浓度 需要通过实验确定.不同物种,不同引物的退火温度 也各不相同,应试几个温度梯度,反复调试,选出最 适宜的退火温度.目前大多数ISSR实验采用的引物 退火温度在52?左右.为增加可比性,对于Taq酶, 用同一引物扩增时要尽量选用同一家公司,同一批 次的产品.ISSR反应对模板含量不甚敏感,一般25 反应体系中DNA含量在5,50ng均可获得比较 一 致的实验结果.但模板纯度对实验结果的影响较 大,在DNA不纯的情况下,应使用有效浓度范围内 的较低浓度,使抑制聚合酶活性的因子影响到最小. 2.3.3PCR扩增及其产物检测扩增反应的循环次 应用生态l8卷 ,35个循环.每个循环内的反应温 数一般控制在27 度和时间一般为92,95?变性30,60s;退火温度 比引物Tm值高2,4?,45,60s;72?延伸90, 120s. PCR产物的检测一般采用1.5%,2.0%琼脂 糖凝胶电泳或5%,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳.前者 经EB染色后在紫外光下观察,拍照;后者可银染后 在可见光下观察记录并拍照.通常情况下,聚丙烯酰 胺凝胶电泳的分辨能力强于琼脂糖电泳.但从其他 方面,如时间,设备,技术等考虑,琼脂糖电泳更为实 用.电泳结果的统计根据同一位点扩增条带的有无 编成0,l矩阵输入计算机,再采用相关软件(如NT— SYS,POPGEN和PAUP等)进行数据的统计与分析. 3ISSR标记在入侵植物研究中的应用 ISSR标记技术提供了一种分析遗传多样性,反 映所分析个体的遗传关系的快速方法,在遗传相似 性的检测中发挥着巨大作用,在许多情况下(如 育种,种质评估,对狭窄背景种质的指纹图谱构建 中)均具有极大的潜力.目前,该技术已应用于许多 研究领域,如分析遗传关系及遗传多样性",群 体遗传结构培],品种鉴定?,系统发生关系,基 因标签j,植物基因组作图以及微卫星引物开 发等.作为多位点标记,ISSR标记在物种和种群 遗传多样性,亲缘关系分析等研究方面的应用非常 有效,在外来入侵植物的遗传关系研究中有着广阔 的应用前景. 3.1群体遗传结构和遗传多样性 遗传结构是指基因或基因型在空间和时间上的 非随机分布,种群的遗传结构包括种群内的遗传变 异和种群间的遗传分化.一个物种的遗传结构是长 期进化的产物,许多物种独特的遗传结构反映了其 进化历史上的一些特殊事件,外来物种的遗传结 构组成受很多因素的影响,比如入侵来源,奠基者效 应,遗传漂变,种群年龄和大小,有性生殖比例,繁育 系统,杂交以及环境异质性等?.对遗传结构及其 影响因子的研究是探讨生物适应意义,物种形成过 程及其进化机制的基础. Hollingsworth等应用ISSR和RAPD标记研 究了英国境内蓼科蔓蓼属的3种入侵杂草的遗传结 构.发现日本紫菀(Fallopiajaponica)只有一种基因 型,所有植株均为1个无性系的克隆植物;大紫菀 (sachalinensis)有2种基因型,但绝大部分植株 为克隆繁殖后代;而日本紫菀和大紫菀的杂交后代 (×bohemica)中发现了5种基因型.Fernandes— Matioli等用ISSR引物扩增裸背鳗属(加) 的4个近缘种的198个个体时发现遗传漂变可使种 群丢失遗传多样性,部分种群可能于再定居的过程 中还伴随着奠基者效应,从而导致种群遗传结构的 单一化.Hassel等在用ISSR标记研究扩张性苔 藓(Pogonatumdentatum)的遗传分化状况时也发现, 该物种在扩张过程中,由于瓶颈效应,奠基者效应和 基因漂流而导致遗传多样性下降,尽管山谷地区的 苔藓以克隆繁殖扩张为主,而平原地区以孢子扩散 传播为主,两地区的苔藓却未出现明显的遗传差异. 大米草原产于英国南海岸是一种宿根性很强的草 本植物,目前已由保滩固堤,促瘀造陆的先锋植物转 变成为一种全球性害草.Baumel等应用ISSR, RAPD和PCR—RFLP标记分析了法国大米草(Sparti— naanglica)l7个种群的遗传结构,发现法国大米草 的基因型均为1个多位点的基因型.该基因型与源 于英国的杂交种S.×townsendii的基因型一致,且所 有法国大米草的叶绿体DNA系列均与其母本s. alterniflora的叶绿体DNA系列一致,从而说明该物 种在形成初期经历了严重的遗传瓶颈.Baumel 等【】..用ISSR等分子标记研究了入侵大米草与欧洲 本地种(S.maritima)杂交的遗传证据,结果表明, S.×neyrautii和S.×townsendii的母本(S.alterniflo— Ta)和父本(S.maritima)相同,但英国和法国西南部 的种群各自拥有独立的父本基因型.凤眼莲(Eich— horniacrct~sipes)原产于南美洲,现广泛分布于北美, 亚洲,大洋洲和非洲的60多个国家,被列为世界上 危害最为严重的十大恶性杂草之一.它主要以克 隆生长的方式迅速在水体中繁衍,滋生,为漂浮生恶 性杂草,对当地生态系统的生物多样性具有严重影 响,并对社区居民的生产,生活,健康造成威胁. 该杂草广泛分布于中国华北,华东,华中和华南的 l7个省市,目前已有l0余个省市受到其危害." 等【4同时采用ISSR和RAPD标记分析了采自我国 南方热带和亚热带地区的6个水葫芦种群的遗传结 构,结果发现所有种群均显示相同的基因型,其爆发 成灾主要是靠无性繁殖. 物种的遗传多样性是其长期进化的产物,也是 其生存和发展的前提.对物种遗传多样性和遗传结 构的研究,是探讨其适应性,生存力的基础,也是分 析入侵物种入侵机理和路径的基础,研究结果有助 于制定科学有效的入侵物种管理和防范 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 . 水花生(Alternantheraphiloxeroides)是我国危害 4期桂富荣等:ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用 严重的入侵性杂草之一.Ye等用ISSR标记对广 东,海南和福建等省的11个种群193个个体的水花 生进行遗传多样性分析,结果表明,水花生在我国的 遗传多样性并不高;我国南方8个种群的水花生 RAPD分析结果支持了上述结论.Wang等应 用23个ISSR引物和28个RAPD引物对我国南方 海口,昆明,南宁,武汉等7个地区112个水花生植 株的遗传多样性分析也发现,其遗传变异程度很低, 说明水花生在我国的快速扩张主要是靠其强大的克 隆繁殖能力引.Lj等的研究结果表明,凤眼莲的 种群间的遗传分化程度也很低,瓶颈效应和极少进 行有性繁殖是导致水葫芦遗传多样性低的主要原 因,强大的快速克隆繁殖能力,环境适应性和表型可 塑性在其成功入侵中起到了关键作用.飞机草 (Chromolaenaodorata)是一种世界性恶性入侵杂 草,在我国西南地区广为分布.Ye等应用ISSR 标记分析了云南,海南,广东和广西27个飞机草种 群的遗传多样性,结果发现这些种群的遗传变异很 小,基因多样性(珥)仅0.0406,物种水平的香农指 数为0.0623,显示了明显的奠基者效应.Poulin 等用ISSR标记检测了狼尾草(Pennisetumsetace- am)的遗传多样性,并分析其与该杂草成功入侵的 关系,结果发现狼尾草的遗传多样性极低,在种群内 和地区间均未出现遗传分化,说明该杂草的成功入 侵与其遗传多样性不存在相关性,不同地区的季节 性降雨状况对其成功入侵具有显着影响,入侵时间 和入侵后的迟滞期也是决定亚利桑那州和加利福尼 亚州南部种群入侵成功与否的重要因素. 入侵物种在入侵过程中通常会因瓶颈效应和奠 基者效应的出现呈现遗传多样性降低的现象J,而 外来物种在入侵过程中出现基因突变,重组,杂交和 多次入侵往往可增加其遗传多样性那.Holling- swo~h等研究发现日本紫菀和大紫菀的杂交后 代(F.×bohemica)中有5种基因型,说明杂交是遗 传多样性增加的原因之一.很多研究表明,入侵性被 子植物的遗传多样性常比预期结果要高得多.例 如Mengistu和Messersmith用ISSR标记分析了地 肤(Kochiascoparia)的13个种群453个植株的遗传 多样性,结果发现,地肤的遗传多样性很高,平均基 因多样性达0.35,有90%的遗传变异存在于种群内 个体间,从而说明尽管经历了除草剂的持续多代选 择,地肤仍然在种群内及种群之间保持有相当水平 的基因流,以维持其高水平的遗传多样性.Chapman 等l】用ISSR分析了入侵新西兰的山柳菊属杂草 Hieraciumlepidulum的遗传结构,结果表明,该杂草 的种群基因多样性较高,遗传分化显着,种群间固定 系数(F)达0.54,重组和突变是产生其遗传分化 的主要原因.同时发现该入侵杂草的种群间基因流 较小,遗传距离与地理距离存在明显的正相关关系. 3.2推测入侵物种的入侵来源 外来物种的地理起源常常会影响其在新生境的 入侵性.成功的入侵物种往往来自生物群区丰 富的大陆J.一个外来物种在到达新传人地区之 初,因其种群数目较小,很少引起人们的注意;当它 们的种群增长到足以引起人们注意时,却又难以根 据其生物学特性来确定其入侵起源地.此时分子标 记的应用显示出极大的优势.Meekins等利用IS- SR标记研究了蒜芥末(Alliariapetiolata)的生物地 理学相关性及入侵地与原产地的遗传相似性,结果 显示,绝大部分的美国种群起源于不列颠岛.入侵地 与原产地的遗传差异不显着,该入侵植物的大部分 (61.0%)遗传变异存在于种群之间,少部分 (22.7%)存在于种群内,而大陆之间的变异只有 16.3%,说明外来植物在一个新区域的定殖与其种 群内基因多样性的下降和种群间基因多样性的提高 有关.Amsellem等对外来悬钩子(Rubusalceifoli- )原产地和入侵地的遗传多样性研究表明,在原产 地,该植物种群内和地缘性相近的种群间的遗传差 异较大;其次是Madagascar的种群,其它地方的种 群都和Madagascar的种群基因型较为相似,因此认 为该植物首先通过多种途径被引入Madagascar地 区,然后又以Madagascar为中心被引入到其它地 区.法国大米草的遗传多样性分析结果显示,所有法 国大米草均来源于英国南部的南安普敦海湾J. Bond等?用ISSR标记检测了喀拉哈里沙漠一种 具有多个来源途径的蒺藜草(Cenchrus6z0)入侵 来源时发现,ISSR标记是确定入侵杂草来源的有效 分子标记.茅叶水车前(Alismalanceolatum)是稻田 里的一种恶性入侵性杂草,Ash等用ISSR标记分 析了该杂草在澳大利亚东南部种群的入侵来源,结 果发现其有2个人侵途径,其中的Griffith类群并非 源于茅叶水车前与普通水车前的杂交,很可能是来 源于一个单独的入侵渠道.Sun等用ISSR标记 分析了美国的恶性入侵野葛(Pueranalobata)的入 侵来源,结果表明该物种来源于中国或日本. 3.3确定人侵植物的分布模式及其亲缘关系 ISSR技术在分析入侵物种的分布模式中具有 很大的潜力.Tranel和Wassom70]用ISSR—PCR标 924应用生态18卷 记评价了美国217个苍耳(Xanthiumstrumarium)品 系的遗传关系,结果表明,苍耳在美国的分布与纬度 有显着相关性,绝大部分品系的遗传变异随纬度梯 度的变化而改变.Hettwer和Gerowitt应用ISSR 和REP(repetitiveenterogenicprimer)标记研究了加 拿大蓟(Cirsiuma~eme)在田间的扩散与分布模式, 结果表明,其主要是通过单性生殖种子扩散至新的 入侵地点建立种苗,进而建立无性繁殖系进行扩散, 匍匐根茎的伸长对其扩散的贡献不大.Ash等对 茅叶水车前在澳大利亚东南部分布状况的研究结果 表明,该杂草的分布具有明显的地域性,种子传播是 Murray流域和Colleambally地区的茅叶水车前种群 扩散的主要方式. ISSR在分析物种间亲缘关系的研究中也有着 广泛的应用.Kostia等副的研究表明,当物种间 的分歧尺度为3000万年时,ISSR方法对系统发育 的研究是一种有效的工具.Thomson等应用ISSR 和AP—PCR(ArbitrarilyPrimed—PCR)标记分析了非 洲亚撒哈拉沙漠的入侵植物欧洲蕨(Pteridiumaq— uilinum)2个亚种的亲缘关系,结果发现,尽管其中 一 个亚种Pteridiltmaquilinumssp.aquilinum分布广 泛,而另一亚种P.aquilinumssp.centrali—africanum 仅分布于非洲东部热带地区,但两亚种拥有很近的 亲缘关系,均为欧洲亚种(sspp.aquilinum&pineto— rum)的姊妹群.美国的野葛与其近缘的4个种(尸. edulis,P.montana,尸|phaseoloides和P.thomsoni) 以及中国野葛的遗传多样性比较结果表明,该物种 与4个近缘种的遗传差异显着,而与中国野葛的遗 传差异不明显. 3.4检测入侵植物的繁育特性 外来人侵植物中有相当一部分是克隆植物,其 危害严重性与其克隆生长习性直接相关.一些 研究显示,克隆特性能影响外来植物的传播和入侵 性.目前已有多种分子标记应用于植物的繁育 特性研究,其中多态性丰富的ISSR标记可作为一种 检测克隆多样性的很好工具.Jonsson等研究 认为,在进行克隆植物遗传多样性的研究时可优先 考虑使用ISSR分子标记.Li和Ge的研究也表 明,ISSR在研究植物克隆多样性方面具有巨大潜 力. 当一种植物被引入到其原产地之外的地区时, 克隆植物因具有独特的适应能力,强大的存活能力 和较强的空间扩展能力而较容易地成为入侵物 种.凤眼莲是世界上生长最快的植物之一,主要 以克隆生长的方式迅速在水体中繁衍,滋生,在5d 内即可以通过匍匐茎产生一代新植株.研究发 现,其极少进行有性生殖.无性繁殖是该入侵杂草爆 发成灾的主要原因H.对入侵我国南方各省的水花 生繁育特性研究结果也表明,水花生在我国的快速 扩张主要是靠其强大的克隆繁殖能力.Hassel 等用ISSR标记研究扩张性苔藓(Pogonatumden— tatum)的繁育系统特性时发现,山谷地区的苔藓主 要以克隆繁殖扩张.狼尾草(Pennisetumsetaceum)的 遗传变异ISSR标记检测结果表明,该杂草在种群内 和地区间均未出现遗传分化.这主要是由于它具有 完全无融合生殖的繁育体系所致. 4展望 国际经济交往的日益频繁和交通的便利使得原 有的地理阻隔因素在逐渐消除,世界各地问物种的 交流和渗透在日益加剧,外来物种入侵的风险也在 随之增加.如今,外来入侵物种已成为除生境丧失外 威胁全球生物多样性的最重要因素之一.生物入侵 所带来的危害已逐渐为人们所认识,并受到越来越 广泛的关注.外来生物侵入扩张的分子机理研究已 成为生物学界关注的热点.尽管ISSR技术目前尚存 在一些缺点,使其应用受到一定的限制,但它的引物 设计容易,结果稳定以及多态性丰富等优点却是其 他分子遗传标记无法比拟的.该技术已在植物的遗 传图谱构建,标记辅助育种及种质资源搜集保存利 用等方面发挥了重大作用.随着分子技术的发展,相 信ISSR技术现存的缺陷可通过其他途径得以改进, 从而使其成为一种成熟的遗传分析手段而更适合于 推广应用.ISSR标记技术必将以其多态性高,稳定 性强,简便快捷等优势而在外来物种的检验检疫,入 侵机理分析,入侵来源追踪等领域得以广泛应用,并 可在更多物种,更多领域获得应用. 参考文献 [1]AbbottRJ,SmithLC,MilineRI.2000.Moleculara— nalysisofplantmigrationandrefugiaintheArctic.Sci, enee.289:1343—1346 [2]AlbaniMC,WilkinsonMJ.1998.Intersimplesequence repeatpolymerasechainreactionforthedetectionofSO" maclonalvariation.PlantBreeding,117:573—575 [3]AlbertP,BoneE,HozapfelC.2000.Invasiveness,in— visibilityandtheroleofenvironmentalstressinthe spreadofnon.riativeplants.PerspectivesinP1antEcolo. gY,EvolutionandSystematics,3:52—56 [4]AmoldS,PfrenderME,JonesAG.2001.Theadaptive 4期桂富荣等:ISSR分子标记在入侵植物研究中的应用 landscapeasaconceptualbridgebetweenmicroevolution andmacroevolution.Genetics.15:l12一l13 [5]AmsellemL,Noyer'儿,BourgeoisTL,eta1.2000. 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