western blot 实验步骤

Western blot 之生理宝典 样品的制备 1. 收细胞 1.1 从-20℃取出细胞裂解液和蛋白溶解酶抑制剂片剂，每2毫升细胞裂解液加四分之一片蛋白溶解酶抑制剂片剂,置于4℃冰上，此步骤需新鲜配制； 1.2 取出灭菌EP管，做好标记，置于4℃冰上； 1.3 取出六孔板（含有培养细胞），去培养基，每孔用10ml移液管加入4℃PBS 1ml，移去，每孔用移液枪加入60-100微升细胞裂解液（已加入蛋白溶解酶抑制剂）,吹打，用细胞刮将贴壁细胞刮下，吹打，用移液枪吸到已标记的EP管中，置于4℃冰上，注意细胞刮每次刮完一孔用纸巾擦净，再刮下一个，刮的时候要保证各个方向都刮到。 1.4 如需保存，将EP管置于-80℃。 2. 收组织 2.1 向放有组织的EP管中加入细胞裂解液（含PMSF），每250mg组织加入1ml裂解液，不足100μl的，补至100μl。 2.2 将含有裂解液的组织用干净镊子或小剪刀剪碎，越碎越好。（冰上操作） 3. 提蛋白 3.1 将含有裂解液的细胞液或组织悬浊液用超声仪裂解（4℃冰上操作），每支离心管超声10次，每次1s。每管超声后，超声仪金属头部需用PBS或蒸馏水清洗（洗瓶清洗），再用滤纸吸干。超声仪金属头部不可插入EP管过深，否则会有细胞液溅出。 3.2 充分裂解后，4℃、12000r离心10min，取上清，快速加入到已标记的EP管中。 4. 测蛋白浓度 4.1细胞蛋白液 细胞密集时，则从原液中抽出5μl，再加30μl PBS，稀释7倍； 细胞稀疏时，则从原液中抽出7μl，再加28μl PBS，稀释5倍。剩余母液放入4℃。 4.2 组织蛋白 从原液中抽取2μl，再加38μl PBS，稀释20倍。剩余母液放入4℃。 4.3 用倍倍稀释法，制作标准蛋白梯度，即0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025μg/μl标准蛋白   μg/μl 母液+PBS=次级母液   μg/μl A 0.5 220+55=275 B 0.4 B 0.4 171+57=228 C 0.3 C 0.3 126+63=189 D 0.2 D 0.2 88+88=176 E 0.1 E 0.1 75+75=150 F 0.05 F 0.05 50+50=100 G 0.025           4.4 在96孔板内加入BCA工作液，每孔100μl，再将各浓度标准蛋白和稀释样品点入含有BCA液体的孔内，每孔10μl（BCA工作液配制时需要多配，以防不够用）。将点好样品的96孔板放入水浴箱，37℃，30min。 4.5 将96孔板放入酶标仪，选择demo 1，开始。 4.6 将测好浓度的数据，用excel编辑。保证细胞蛋白不低于30μg/20μl，组织蛋白上样不低于60~80μg/20μl。 4.7 将计算好的每孔数据，根据样品母液实际量等体积扩大、稀释，再加入loading buffer，按照1:4（loading buffer：细胞液）加入，混合，在保证每个EP管壁和管顶都有编号，并保证每个EP管上打过孔或封口膜封口后，再沸水煮3-5min，按顺序摆放到干燥的冰盒上，然后低速离心。 4.8 将变性过的蛋白进行分装，充分混匀，每管分装35μl。 样品的使用（western blot用液配置见配方宝典） 1. 制备SDS-PAGE电泳胶版 1.1 清洗玻璃板需轻拿轻放。将玻璃板先用含洗衣液的纱布洗净后，用自来水清洗干净，再用蒸馏水清洗，最后用无水乙醇冲洗，保证玻璃版面上无杂质后，晾干（可放于烘箱内，快速烘干）。 1.2用50ml EP管配置凝胶液，先配下层胶，配20ml体系（两块胶板），配方见配方宝典（其中，APS加倍，TEMED在原量上再加1μl），每块胶板加入750μl下层胶溶液后，用蒸馏水加满，封闭。加液时，从左至右，缓慢均匀加入。当水层和胶层间出现一条明显折线时，说明下层胶已凝聚。一般5分钟内可凝。 1.3 再用另一50ml EP管配置上层胶，配6ml体系，配方见配方宝典，数据不变。若胶板非当天使用，需用封口膜将其密封，内加入100ml running buffer，4℃冷藏。 2. SDS-PAGE电泳 2.1 在加样前，先合理设计需要加入的样品的排版，并记录，若两块以上，更需标明板间差别，或用Marker的不同点样孔来区别。样品尽量加于胶版中央。两种分子量相近的蛋白不可以在同一个胶版上电泳。  2.2 安装好胶版后，倒入running buffer 于内部，观察胶版下部是否有漏液情况，若不漏液则加到电泳盒划线处。若漏液，则重新安装。 2.3 用注射器清洗胶孔，加样，每孔上样的蛋白不能低于25μg，加样液不可多于40μl，所以蛋白浓度越高越好，但需保证每孔的上样量（蛋白浓度和加样体积）一致。Marker的加量为4μl。 2.4 电泳分为两部分：低压电泳和高压电泳，均为恒压电泳。 低压电泳：70v  40min 高压电泳：110v  60-90min  （其实根据分子量大小，胶版浓度，具体判定的。） 2.5 将running buffer回收，使用次数不可超过3次。 3. 转膜 3.1 电泳开始的同时，将制冰机打开。转膜液现用现配，每次配制1000ml，将配好的转膜液放入-20℃冷冻（放心，不会结冰的），注意，转膜为恒流，300mA  40min~90min不等，根据蛋白大小做判定。 3.2 先将冷转膜液倒入盘中（内有夹板和滤纸,夹板黑色于下方），全部浸润。 3.3 先将PVDF膜用圆珠笔标记，再取摇板盒，先甲醇浸泡15s，后DD-H2O浸泡2min，再转膜液至少浸泡5min，后可用。 3.4 将电泳过的胶板放于夹板中滤纸上（滤纸下面有层黑色海绵），再将泡好的PVDF膜放于胶板上，再层放1张滤纸，1张海绵，用玻棒赶走层与层之间的气体，夹上夹子。（如上操作均在冷转膜液中操作，否则会有气泡产生） 3.5 由于恒流会产生大量的热，所以在电泳盒内放入冰盒（需固定型号），还有1枚搅拌子（转膜专用，在转膜盘内，不可他用），再将电泳盒放于一个装满冰的盆内，其下为一磁力搅拌器。 3.6 转膜结束后，清理桌面，弃掉转膜液。 4. TBST清洗3次，每次在摇床振摇5min， 5. 5%脱脂牛奶摇床振摇1h，（其配制液为TBST） 6. 加一抗 （抗体量具体见其说明书或经验） 6.1根据实验设计，即所加入抗体成分，来进裁剪已转上蛋白质的PVDF膜。 6.2根据修剪过膜的大小来制作密封袋，密封袋可多封几层，防止漏液。 6.3先将修剪过的PVDF放入修剪过的密封袋内，将3边密封，最后用1000μl移液枪将于1%脱脂牛奶混匀的抗体加入密封袋，赶走气泡，最后密封，检查，防止漏液 6.4 将封好的抗体粘于杂交炉上，检查无漏液，杂交2h，再4℃过夜。（有时为了迅速观察结果，可以一抗杂交3h后，直接进行以下操作） 7. 将过夜的加过一抗的PVDF膜用TBST清洗4次，每次5min，并将剩余的一抗封口回收。 8. 加二抗 （抗体量具体见其说明书或经验） 方法同一抗，杂交炉1h 9. TBST清洗4次，每次5min。 10. 压片，显影 10.1 将ECL-底物反应液、压片盒、白色底片、底片、自制显影小盒、计时器、保鲜膜、剪刀、1000μl移液枪、1000μl枪头、1.5ml EP管（压几张板，拿几支管）、干净的橡胶手套一双、废液缸、湿抹布和盛有被TBST浸泡的PVDF膜的摇盒放入篮子内，到暗室进行以下操作。 10.2在暗室内，先打开水阀，再打开洗片机，等到只剩1盏灯时(此时会有提醒声)，方可使用机器。在暗室需使用光线时，只可使用红色灯，以便使眼睛适应黑暗环境。 10.3 听到提示音后，配制ECL-底物反应液，每瓶取500μl（根据膜的大小决定量）于一5ml EP管。 10.4 将PVDF膜按顺序放入自制显影盒排好，正面向上，此时将配好的底物反应液加于膜上，使显影液和膜反应1-2分钟 。 10.5将反应后的PVDF膜正面向上，平铺于白色底片上，再加一层保鲜膜，赶走气泡，将其包裹，压平。正面向上放于压片盒内。 10.6换双干净手套，关闭红灯，观察膜上的荧光亮度，若很亮，则将底片压上1s足已，若很微弱，则压5min，更弱则30min。1h后还无条带，就不用再压了。如果是重要的实验数据，按照不同的时间点（1s、5s、10s、30s、1min、3min、5min、10min、30min），多压几张底片，并标明压片时间、日期、样品名，扫描存档。