3-氨基酸

null第三章 氨基酸 (Amino acids)第三章 氨基酸 (Amino acids)本章主要内容一、氨基酸——蛋白质的构件分子 二、氨基酸的分类 三、氨基酸的酸碱化学 四、氨基酸的化学反应 五、氨基酸的光学活性和光谱性质 六、氨基酸混合物的分析分离本章主要内容一、氨基酸——蛋白质的构件分子一、氨基酸——蛋白质的构件分子 将蛋白质完全水解（酸水解、碱水解、酶水解）可以得到构成蛋白质的基本成分，这些基本成分是L-氨基酸。 水解得到的20种氨基酸，除脯氨酸及其衍生物外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相邻的α-碳原子（Cα）上都有一个氨基（α-氨基），一个氢原子和一个可变的侧基R。氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式除甘氨酸外，α碳原子为手性碳侧链基团氨基酸通过肽键（酰胺键）连接成肽氨基酸通过肽键（酰胺键）连接成肽Carboxyl endAmino endAmino acid 2DipeptideAmino acid 1肽键二、氨基酸的分类二、氨基酸的分类从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种。非蛋白质氨基酸（不参与蛋白质组成） 不常见的蛋白质氨基酸（参与蛋白质组成） 20种常见的蛋白质氨基酸（参与蛋白质组成） 根据R基的化学结构将20种常见蛋白氨基酸分为：脂肪族（最多）、芳香族、杂环族常见的蛋白质氨基酸Ⅰ（脂肪族）常见的蛋白质氨基酸Ⅰ（脂肪族）Glycine Alanine Valine Leucine Isoleucine无旋光性常见的蛋白质氨基酸Ⅱ（脂肪族） Serine Threonine Cysteine Methionine蛋氨酸常见的蛋白质氨基酸Ⅱ（脂肪族）常见的蛋白质氨基酸Ⅲ（脂肪族）Aspartic acid Glutamic acid Asparagine Glutamine常见的蛋白质氨基酸Ⅲ（脂肪族）常见的蛋白质氨基酸Ⅳ（脂肪族、杂环族） Lysine Arginine Histidine Proline常见的蛋白质氨基酸Ⅳ（脂肪族、杂环族）常见的蛋白质氨基酸Ⅴ （芳香族） Phenylalanine Tyrosine Tryptophan常见的蛋白质氨基酸Ⅴ （芳香族）氨基酸按其R基的极性分类（pH7时）氨基酸按其R基的极性分类（pH7时）碱性氨基酸酸性氨基酸不常见蛋白质氨基酸Ⅰ不常见蛋白质氨基酸Ⅰ不常见的蛋白氨基酸是由相应的蛋白氨基酸修饰而来的不常见蛋白质氨基酸Ⅱ不常见蛋白质氨基酸Ⅱ不常见蛋白质氨基酸Ⅲ不常见蛋白质氨基酸Ⅲ不常见蛋白质氨基酸Ⅳ不常见蛋白质氨基酸Ⅳ不常见蛋白质氨基酸Ⅴ不常见蛋白质氨基酸Ⅴ硒代半胱氨酸非蛋白质氨基酸Ⅰ非蛋白质氨基酸Ⅰ非蛋白质氨基酸Ⅱ非蛋白质氨基酸Ⅱ非蛋白质氨基酸Ⅲ非蛋白质氨基酸Ⅲ非蛋白质氨基酸甲状腺素非蛋白质氨基酸甲状腺素三、氨基酸的酸碱化学三、氨基酸的酸碱化学氨基酸兼性离子氨基酸晶体具有很高的熔点，且氨基酸能使水的介电常数增高，因此推测氨基酸是以兼性离子（zwitterion），也称为偶极离子（dipolar ion）形式存在的。既是质子供体（酸）又是质子受体（碱）甘氨酸兼性离子的解离甘氨酸兼性离子的解离阳离子（A+）兼性离子（A+）阴离子（A-）Ka1Ka2两步解离的解离常数两步解离的解离常数 第一步解离： Ka1= 第二步解离： Ka2= 一般按其酸性递降的顺序编号为Ka1 、 Ka2 。甘氨酸的滴定曲线甘氨酸的滴定曲线pK1 = 2.34 pI = 5.97 pK2 = 9.60Handerson-Hasselbalch 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 Handerson-Hasselbalch公式当[质子受体]=[质子供体]时可计算任一pH值时一种氨基酸的各种离子的比例。null氨基酸的带电状况与溶液的pH值相关，改变pH可以使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可以使它处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。 等电点（isoelectric point，pI）使氨基酸的静电荷为零时的pH值，称为等电点。 对侧链不解离的中性氨基酸 pI= 1/2 （ pKa1＋pKa2 ）谷氨酸和赖氨酸的滴定曲线谷氨酸和赖氨酸的滴定曲线谷氨酸的解离反应式和pI计算谷氨酸的解离反应式和pI计算赖氨酸的解离反应式和pI计算赖氨酸的解离反应式和pI计算部分氨基酸的解离常数和等电点部分氨基酸的解离常数和等电点甘氨酸的氨基与甲醛的反应甘氨酸的氨基与甲醛的反应反应的结果减弱了氨基的碱性氨基酸不能用酸碱直接滴定来进行测量，因为其酸碱滴定的等电点pH过高（12-13）或过低(1-2)，无指示剂。羟甲基衍生物氨基酸的甲醛滴定曲线氨基酸的甲醛滴定曲线 由于加甲醛与氨基酸的氨基反应，减弱了氨基的碱性，使得滴定终点向中性pH偏移，由pH12左右降低到pH9左右，正好是酚酞指示剂的变色区域。四、氨基酸的化学反应 （一）α－氨基参加的反应 1.与亚硝酸反应 氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸生成氮气。四、氨基酸的化学反应 （一）α－氨基参加的反应 1.与亚硝酸反应 氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸生成氮气。室温（氨基酸定量）2.与酰化试剂反应 氨基酸的氨基与酰氯或酰酐在弱碱溶液中反应，氨基被酰基化。2.与酰化试剂反应 氨基酸的氨基与酰氯或酰酐在弱碱溶液中反应，氨基被酰基化。苄氧甲酰氯苄氧甲酰氨基酸（保护氨基）其它酰基化试剂其它酰基化试剂酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂用于N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定3.烃基化反应3.烃基化反应（氨基酸鉴定） 氨基酸氨基的一个氢原子可被烃基取代 1）与 2,4-二硝基氟笨（DNFB）反应3.烃基化反应 3.烃基化反应 （氨基酸鉴定）2）与苯异硫氰酸酯（ PITC） 反应4.形成西佛碱反应4.形成西佛碱反应（酶与底物过渡态中间物的结合方式之一）（用于甲醛滴定） 氨基酸的α氨基能与醛类化合物生成弱碱——西佛碱（二）α－羧基参加的反应 1.成盐和成酯反应（二）α－羧基参加的反应 1.成盐和成酯反应（保护羧基） 氨基酸与碱作用生成盐，其羧基被醇酯化后生成相应的酯。null当氨基酸的羧基变为甲酯、乙酯或钠盐后，羧基的化学反应性能即被掩蔽或者说羧基被保护，而氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，容易和酰基和烃基结合，这就是氨基酸的酰基化和烃基化要在碱性溶液中进行。2.成酰氯反应2.成酰氯反应（活化羧基） 氨基酸的氨基用适当的保护基（苄氧甲酰基）保护后，其羧基可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯。使氨基酸的羧基被活化，易于与另一氨基酸的氨基结合，常用于多肽的人工合成。3.叠氮反应3.叠氮反应（活化羧基） 氨基酸的氨基通过酰化加以保护，羧基经变为酯化甲酯，然后与肼和亚硝酸反应即生成叠氮化合物。肼（三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应（三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应（氨基酸定量测定，570nm）紫色1.与茚三酮反应 茚三酮在弱酸溶液中与α氨基酸共热，引起氨基酸脱氨、脱羧，另一份茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。亚氨基酸与茚三酮反应的产物亚氨基酸与茚三酮反应的产物亮黄色 茚三酮与亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）反应，不释放NH3，直接生成亮黄色化合物，最大吸收在440nm。2.成肽反应2.成肽反应（环状二肽） 甘氨酸 甘氨酸 二酮哌嗪 一个氨基酸的氨基和另一氨基酸的羧基可以缩合成肽。null氨基酸侧链具有功能团（羟基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基、非α氨基、非α羧基等）时也能发生化学反应。其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。 蛋白质的化学修饰：是在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。（四）半胱氨酸巯基参加的反应 （四）半胱氨酸巯基参加的反应 （标记巯基）1.与碘乙酸反应2.与氮丙啶反应2.与氮丙啶反应（为胰蛋白酶水解肽链提供一个新位点） 半胱氨酸的巯基能打开氮丙啶的环3.与含汞化合物反应3.与含汞化合物反应（蛋白质结晶时制备重原子衍生物）对氯汞苯甲酸 半胱氨酸的巯基能和各种金属离子形成稳定程度不等的络合物。4.与二硫硝基苯甲酸反应4.与二硫硝基苯甲酸反应（一分子的半胱氨酸引起一分子的硫硝基苯甲酸，巯基定量测定）pH8.0, 412nm检测 半胱氨酸与DTNB发生硫醇-二硫化物交换反应5.两个巯基氧化成二硫键5.两个巯基氧化成二硫键（蛋白质形成二、三级结构时） 巯基容易受空气或其他氧化剂氧化。当有痕量的Cu2+、Fe2+、Co2+或Mn2+存在下，巯基的空气氧化将显著提高。6.蛋白质中二硫键的氧化和还原6.蛋白质中二硫键的氧化和还原（蛋白质结构研究）胱氨酸 Cystine过甲酸（氧化剂） 氧化剂和还原剂都能打开二硫键。反应一反应二巯基化合物（还原剂）二硫化物磺基丙氨酸7.蛋白质中二硫键的被DTT还原7.蛋白质中二硫键的被DTT还原（蛋白质结构研究）二硫苏糖醇 DTT五、氨基酸的光学活性和光谱性质五、氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的相对构型null从蛋白质的酸水解液或酶促水解液中获得的氨基酸都是L型的 D型氨基酸主要是作为某些肽抗生素和某些微生物细胞壁的成分存在。 苏氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸除了α-碳原子外，还有第二个不对称碳原子，因此在实验室里可以存在4种光学异构体，分别称为L-，D-，L-别-，D-别-氨基酸。苏氨酸的4种光学异构体苏氨酸的4种光学异构体部分氨基酸的比旋光度部分氨基酸的比旋光度Murchison陨星 ——地球外偏手性的发现Murchison陨星 ——地球外偏手性的发现 组成蛋白质的氨基酸都是L-氨基酸，在产生生命之前天然合成的氨基酸应该是D-和L-型的氨基酸各占一半，那么生命体中的氨基酸的构型是随机选择的吗？John Cronin和Sandra Pizzarello检测了1969年9月28号落在澳大利亚默奇森 （Murchison）附近的陨星中的特殊氨基酸的构型，检测的4种特殊氨基酸是2-氨基-2,3-二甲基戊酸（α-methylisoleucine和α-methylalloisoleucine）、2-氨基-2-甲基丁酸（Isovaline）及2-氨基-2甲基-戊酸（α-Methylnorvaline），以避免地球上氨基酸的污染。结果发现它们中L型的比D型的分别多2~9%。 四种特殊氨基酸的结构式四种特殊氨基酸的结构式α-甲基异亮氨酸 α-甲基别异亮氨酸异缬氨酸α-甲基正缬氨酸芳香族氨基酸在pH6时的紫外吸收光谱芳香族氨基酸在pH6时的紫外吸收光谱只有芳香族氨基酸在近紫外区（200～400nm）有吸收光的能力。Lambert-Beer 定律Lambert-Beer 定律 式中：A为吸光度，I 0为入射光强，I为透过光强，T为透光率，ε为摩尔吸收系数，c为溶质浓度，l为光径。 ε定义为：光通过1cm光径时1Mol / L溶质对该波长光的吸收值。 蛋白质的最大吸收波长一般在280nm处，因此可利用分光光度计发测定蛋白质的含量，其依据是Lambert-Beer 定律。六、氨基酸混合物的分析分离蛋白质的水解 （1）酸水解：用6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4回流20h左右可使蛋白质完全水解。酸水解不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。但色氨酸被完全破坏，丝氨酸和苏氨酸有一小部分被分解，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。六、氨基酸混合物的分析分离null（2）碱水解：与5 mol/L NaOH共沸10～20h可使蛋白质完全水解。碱水解导致多数氨基酸破坏，并引起消旋作用，得到的是D-和L-氨基酸的混合物。碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。但色氨酸是稳定的。 （3）酶水解：不同的蛋白酶有不同的切割特异性，需要几种酶共同作用才能使蛋白质完全水解。酶水解常用于产生肽段。 分配层析分配层析分配定律：当一种溶质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）。 cA和cB分别代表某一物质在互不相溶的两相——A（动相）、B（静相）中的浓度。 逆流分溶（配） 用分配定律通过分溶（相）把混合溶质分开的方法null例1：设X的Kd=1000，Y的Kd=1/1000，A溶剂密度小于B XY混合物溶于AB等量混合液，摇匀静置分层， 把A抽出于第二容器， 则 第一容器中 X 1份 Y1000份 第二容器中 X 1000份 Y1份逆流分溶原理逆流分溶原理分溶曲线分溶曲线分配系数大的物质延一系列分溶管的移动速度比分配系数小的物质快 每一种物质在一系列分溶管中是相对集中的，分溶曲线呈峰形分溶曲线与转移次数n的依数关系分溶曲线与转移次数n的依数关系转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线的峰形越窄而高柱层析装置柱层析装置氨基酸的纸层析图谱和 Rf 值氨基酸的纸层析图谱和 Rf 值双向层析 单向层析Rf：retardation factor