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常见猪病检测方法.doc

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上传者: nan-生主宰 2018-01-14 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《常见猪病检测方法doc》,可适用于农林牧渔领域,主题内容包含常见猪病检测方法参考NYT(动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法)。适用于猪大肠杆菌病的诊断。营养肉汤营养琼脂EMBTSIIMViC生化符等。

常见猪病检测方法参考NYT(动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法)。适用于猪大肠杆菌病的诊断。营养肉汤营养琼脂EMBTSIIMViC生化鉴定管小白鼠a)将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板(同时接种营养肉汤增菌备用)置培养~h。b)观察培养特性挑取黑色有金属光泽的菌落用该菌落涂片革兰氏染色镜检。c)如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌应取~个典型菌落再接种于TSI琼脂。d)同时挑取典型菌落接种营养琼脂培养~h的菌液用于生化特性鉴定。挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管()培养h后观察结果。靛基质试验:a)滴加Kovacs氏靛基质试剂mL于靛基质试验培养基中混合观察结果。b)出现红色环的为反应阳性出现黄色环的为反应阴性。甲基红(MR)试验a)滴加甲基红指示剂mL于MRVP培养基中混合观察结果。b)出现红色为阳性反应出现黄色为阴性反应。VP试验a)滴加VP试剂甲液mL于MRVP培养基中混匀再滴加VP试剂乙液mL混匀静置观察结果。b)在min内出现红色的为阳性反应无颜色变化的为阴性反应。阴性结果h后再观察一次出现红色也为阳性反应。枸橼酸盐试验:观察培养基颜色变化出现蓝色为阳性反应不变色为阴性反应。应符合表要求。MRVP靛基质枸橼酸盐鉴定典型大肠埃希氏杆菌非典型大肠埃希氏杆菌典型柠檬酸盐杆菌非典型柠檬酸盐杆菌典型产气杆菌非典型产气杆菌出现表的生化反应类型时如果为组织样品由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便尿液饲料饮水应进一步做致病性试验。a)取经营养肉汤培养~h后的纯化菌株培养液分别腹腔接种体重g左右的小白鼠每株接种~只每只mL(含菌量约为cfu/mL)同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。b)饲养观察、记录死亡数并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。a)挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中培养~h菌液用于药敏试验。b)将肉汤培养物(用标准比浊管比较达相同浊度)稀释至含菌量为cfu/mL摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上然后用无菌镊子将药敏片贴附其上每纸片~张置培养h后观察。c)根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性选择敏感药物。参考NYT(动物和动物产品沙门氏菌检测方法)。适用于猪沙门氏菌病的诊断。SCDHLTSI赖氨酸脱羧酶(LD)邻硝基酚βD半乳糖苷(DNPG)甘露醇糖发酵管a)采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。b)无菌剪取肝、脾样品g投入mLSC增菌液中(血液、粪便样品可以采适量直接投入mL增菌液)培养~h。c)取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上培养~h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明产硫化氢(HS)菌落中心黑色或几乎全黑色。a)挑取DHL平板上可疑菌落~个每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。b)再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验(LD)和ONPG甘露醇糖发酵管三支生化管若菌落偏小二次挑取菌落有困难可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管培养~h(挑取菌落后的平板应置于冰箱保留h以备复查)。c)按表记录反应结果对照表进行判定。d)凡符合表生化反应模式可报告为沙门氏菌。TSILDONPGMAN生化管ab底斜面硫化氢第一次颜色黄黄黑紫深黄黄记录符合第二次颜色红红无黑色黄无色或淡黄紫记录符号a“底”观察葡萄糖反应。b“斜面”观察乳糖和蔗糖反应。TSI序LDONPGMAN判定号底斜面硫化氢A沙门氏菌亚种、、、aB沙门氏菌亚种b、%aC沙门氏菌亚种a、、%b、%bD少数沙门氏菌亚种cE少数沙门氏菌亚种dF甲型副伤寒沙门氏菌G非沙门氏菌a含%硫化氢阳性的大肠埃希氏菌可加试靛基质加以鉴别其中大肠杆菌阳性沙门氏菌阴性。b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有:甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。c硫化氢阴性的沙门氏菌主要有:甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。。d可直接用(O)单因子血清证实以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。a)挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中培养~h菌液用于药敏试验。b)将肉汤培养物(用标准比浊管比较达相同浊度)稀释至含菌量为cfu/mL摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上然后用无菌镊子将药敏片贴附其上每纸片~张置培养h后观察。c)根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性选择敏感药物。自定标准。适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。绵羊血琼脂牛乳培养基。对疑似病例的肠道黏膜涂片魏氏梭菌呈G直杆状两端钝圆单在或成双无鞭毛不运动。芽孢大而卵圆位于菌体中央或近端多数菌株可形成荚膜。可将肠道内容物接种血平板厌氧培养~h后观察。菌落特点:魏氏梭菌在血平板上可形成直径~mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。对牛乳培养基的“暴烈发酵”。采集空肠后段或结肠前段内容物加适量生理盐水稀释经离心沉淀后取上清液分成两份一份加热(min)。两份上清液分别静脉注射家兔(~ml)或小鼠(~ml)。如有毒素存在不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡而加热组动物不死亡。因为正常人畜肠道内存在此菌并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。参考NYT。适用于猪痢疾(SD)的实验室诊断。Sh器材:显微镜暗视野镜头玻片及盖玻片酒精灯等染色液:结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。样品:病猪新鲜粪便(含粘)或直肠拭子或大肠内容物及黏膜染色样品制作:取样品直接抹片干燥火焰固定以结晶紫液或稀释复红染色min~min水洗吸干后待检。悬滴样品制作:取样品少许悬于生理盐水待检。每份样品最少制片张显微镜检查:染色样品以油镜直接观察悬滴样品在暗视野~倍镜头下观察。典型Sh菌体长μm~μm呈~个密螺旋体两端尖锐呈蛇样活泼运动。当视野中有数量(~条以上)Sh样菌体时在获培养前可作为诊断的重要参考。器材:厌氧培养装置及使用方法细菌学实验常规器材外科手术器材微孔滤器和μm滤膜。试验动物:小鼠(g左右)试剂:PBS(MpH)生理盐水多粘菌素TSA。样品:病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物(含粘液)。对死猪或扑杀猪大肠分段结扎(每段cm)分离取出。样品应尽早分离培养也可~保存~d。样品种Sh镜检将样品少许摸片染色或作成悬滴标本镜检观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者则难以分离成功。分离培养直接划线分离法:即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。集菌法:先将样品以生理盐水或PBS作:稀释rmin弃去沉淀。将上清液再以~rmin离心min。取沉淀划线接种TSA若干皿。稀释法:将样品或集菌法的沉淀物作倍梯度稀释至~。取各梯度稀释液各滴分别划线接种于TSA上(每梯度稀释液最少接种皿)。接种后的培养皿置厌氧罐内进行厌氧培养。若上述稀释液中加入多粘菌素UmL~UmL可提高分离率。观察每隔~d开罐检查一次共~次观察有无溶血区及溶血菌落。致病性Sh呈强β溶血一般看不见菌落。当培养条件适宜时再溶血区可见到云雾状菌苔。无害蛇样螺旋体等呈弱β溶血。移植纯化先作溶血区内物质涂片染色镜检。如见Sh样菌体可在无菌落溶血区内移取小块琼脂划线于TSA若干皿。如此每隔天移植一次一般~次后即可纯化和保存。猪蛇样螺旋体鉴定溶血试验将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株分别划线于同一TSA上不同区内经h培养后观察比较其溶血程度。肠致病性试验每菌株至少接种只小鼠将小鼠停饲h后每只每次灌服mL(含菌~亿)次日再灌服一次d后剖检观察盲肠病变。感染后%出现腹泻和病变者则为致病性Sh。参考NYT。适用于猪巴氏杆菌病的检测。改良马丁氏琼脂马丁氏肉汤常用生化培养基。用肝脏组织或心血摸片或纯培养物染色呈阴性瑞氏染色呈两极浓染的球杆菌。将濒死前或死后数小时内以无菌手术采取病死猪的心血、肝脏组织接种于改良马丁氏琼脂斜面进行分离。培养~h后改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物呈微蓝色菌台或菌落。马丁肉汤培养物生长为均匀浑浊不产生菌膜。本菌发酵葡萄糖、果糖、半乳糖多数发酵蔗糖不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水杨素及鼠李糖吲哚试验和氧化酶试验阳性。根据临床症状和病理变化加上涂片染色镜检可对本病作出初步的诊断但确诊要靠病原分离鉴定。参考GBT和GBT适用于猪链球菌病诊断。绵羊血琼脂对最急性和急性病例无菌采取集病死猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织做触片姬姆萨染色链球菌可见较纯的单个或成双的圆形或椭圆形球菌,有少量形成短链和长链如见链球菌则表明病料中可能含有链球菌。无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结内部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板培养h如果菌落生长缓慢可延长至h后观察。如果是猪链球菌型培养h在普通琼脂绵羊血平板形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落直径mm~mm大多数菌株呈α溶血部分菌株产生β溶血。将可疑菌落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌菌体直径μl固体培养物以双球菌为多少量呈个~个排列的短链液体培养物以链状为主无芽孢能形成荚膜。本菌过氧化氢酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢试验符合者可初步确定为链球菌。经初步鉴定后做%乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。PCR必要时进行猪链球菌型毒力因子PCR检测。台式高速(rmin)离心机DNA扩增仪水浴锅稳压稳流电泳仪和水平电泳槽电泳凝胶成相分析系统可调移液器一套包括~μL支~μL支~μL支与移液器匹配的滴头mL离心管mL或mL(与扩增仪配套)塑料管。细菌DNA提取试剂盒mmolLdNTPPCRBuffermmolLMgClpmolL引物TaqDNA聚合酶TAE(保存液)和TAE(使用液)琼脂糖:电泳级CYBgreenPCR根据猪链球菌型溶血素基因设计引物引物序列如下其目的片断长度为bp。sly:’CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA’()sly:’GAAGATTGCGAGCATTTCCTG’()DNA利用对数生长期的液体培养物严格按照DNA提取试剂盒说明书进行。PCRμL细菌总DNAμLpmolμL的上游引物μLpmolμL的下游引物μLmmolLdNTPs混合物μLPCRBufferμLmmolL的MgClμLU的TaqDNA聚合酶μL双蒸水补至μL。预变性min变性min退火min共个循环延伸min延伸min保存。取g琼脂糖于mL电泳缓冲液中加热充分溶化制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液使液面刚刚没过凝胶。取~μlPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液和CYBgreen混合后加样进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定一般控制在Vcm~Vcm电泳时间为min~min。将电泳好的凝胶放紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果。阳性对照的PCR产物电泳后在bp的位置上出现一条特异性条带阴性对照PCR产物电泳后没有条带试验结果成立。在试验结果成立的前提下如果样品中PCR产物电泳后在bp的位置上出现一条特异性条带判为该菌株含有猪链球菌型溶血素基因。HpsPCR自定标准。副猪嗜血杆菌诊断。台式高速(rmin)离心机DNA扩增仪水浴锅稳压稳流电泳仪和水平电泳槽电泳凝胶成相分析系统可调移液器一套包括~μL支~μL支~μL支与移液器匹配的滴头mL离心管mL或mL(与扩增仪配套)塑料管。TSA培养基TSB培养基mmolLTrismmolLEDTA溶液中溶菌buffer(TweenmgmLproteinaseK和molLTrispH)mmolLdNTPPCRBuffermmolLMgClpmolL引物TAE(保存液)和TAE(使用液)LoadingBuffer琼脂糖CYBgreen对从临床症状疑似副猪嗜血杆菌病的发病仔猪的肺和脾作组织触片革兰氏染色副猪嗜血杆菌镜检呈革兰氏阴性小球杆菌。取出患病仔猪病变肺、气管分泌物、胸水、腹水及脾组织划线接种于TSA平板。CO培养~h。副猪嗜血杆菌呈无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小菌落革兰氏染色呈阴性小球杆菌老龄培养物呈多形态(细小杆状、短链状和长丝状)。PCRHPS:′GTGATGAGGAAGGGTGGTGT′HPS:′GGCTTCGTCACCCTCTGT′该引物扩增出编码SrRNA的DNA部分片段长度为bp。tbpA:′TTAGCCTTGCTCTTCTTAGCC′tbpA:′AAGCTTGAAACTAAGGTACTCTAA′该引物扩增出编码转铁结合蛋白A的DNA部分片段长度为kb。DNA将TSA平板上典型菌落接种TSB过夜培养取对数生长期分离菌悬浮于mmolLTrismmolLEDTA溶液中rmin离心min弃上清沉淀用溶菌buffer重悬作用min最后煮沸minrmin离心min收集上清保存备用。注:DNA的提取可以用试剂盒按试剂盒操作说明进行以节省时间减少DNA损失。SrRNADNAμL细菌总DNAμLpmolμL的上游引物μLpmolμL的下游引物μLmmolLdNTPs混合物μL无Mg缓冲液μLmmolL的MgClμLU的TaqDNA聚合酶μL双蒸水补至μL。预变性min变性s退火s共个循环延伸s延伸min。tbpADNA预变性min变性min退火min共个循环延伸min最后延伸min。称取g琼脂糖加入mLTAE中加热融化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中胶板厚mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样空)放入电泳槽中加TAE缓冲液淹没胶面。取~μLPCR扩增产物和~μL加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加孔阳性对照的扩增产物作为对照没有阳性对照的情况下一定加Marker。电压~V或电流~mA电泳~min。电泳结束后取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上即他们与加样孔的距离相同或根据Marker判定大小与设计的大小(bp和kb)一致则该样品判定为阳性。同份样品在个PCR中全部阳性的才可以判为本猪(群)已经感染Hps根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。PRRSPCR自定标准。适用于PRRS的PCR诊断。组织匀浆机低温台式高速(rmin)离心机DNA扩增仪水浴锅稳压稳流电泳仪和水平电泳槽电泳凝胶成相分析系统可调移液器一套包括~μL支~μL支~μL支与移液器匹配的滴头mL离心管mL或mL(与扩增仪配套)塑料管。Trizol试剂氯仿异丙醇反转录酶MMLV(UµL)乙醇焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液mmolLdNTPPCRBuffermmolLMgClpmolL引物TAE(保存液)和TAE(使用液)LoadingBuffer琼脂糖Oligo(dT)(μmolL)CYBgreen取疑似猪的肺脏、淋巴结和脾脏病变部位组织保存备用。取部分组织样品磨碎并用MPBS(PH~)稀释成:乳剂(或将病料用剪刀剪成小块放入mL青霉素小瓶进一步剪碎按倍体积的MPBS后用匀浆机匀浆)保存备用或立即用于RNA提取。RNAa)取处理好的稀释样品~µL加入µLTRIZOL试剂涡悬混匀在~温育~min加入µL的氯仿盖紧管盖上下颠倒混匀s~温育~min~g离心minb)转移水相µL到一新的离心管中加入mL的异丙醇~作用min~g离心minc)弃去上清液加入乙醇mL振摇~g离心mind)弃去上清干燥沉淀物(室温约min)加入µLDEPC水溶解保存或立即使用(置冰上)。根据文献和PRRSV代表株VR和LV设计了一对引物:PRRSVN:′ATGGCCAGCCAGTCAATCA′PRRSVN:′TCGCCCTAATTGAATAGGTG′RT总体积为µL反应体系如下:RTbufferµLdNTP(mmolL)µLOligo(dT)µLRNA模板µL混匀离心作用min冰上冷却加入MMLV(UµL)µLh冰上冷却后作为PCR模板。PCRPCR反应总体积为µL包括:条PRRSV引物(pmolµL)各µL(MgmmolL)µLdNTP(mmolL)µLBufferµLTaq酶(UµL)µL模板cDNAµL灭菌双蒸水µL瞬时离心混匀将PCR反应管置于PCR仪内。PCR反应参数为:预变性minminmin共个循环min延伸min。将PCR产物放保存或立即做琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。称取g琼脂糖加入mLTAE中加热融化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中胶板厚mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样空)放入电泳槽中加TAE缓冲液淹没胶面。取~μLPCR扩增产物和~μL加样缓冲液和和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加孔阳性对照的扩增产物作为对照没有阳性对照的情况下一定加Marker。电压~V或电流~mA电泳~min。电泳结束后取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上即他们与加样孔的距离相同或根据Marker判定大小与设计的大小(bp或kb)一致则该样品判定为阳性。PCR检测结果阳性表明该猪(群)已感染PRRSV根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。CSFVPCR自定标准。适用于古典猪瘟(CSFV)的PCR诊断。:组织匀浆机低温台式高速(~rmin)离心机DNA扩增仪水浴锅稳压稳流电泳仪和水平电泳槽电泳凝胶成相分析系统可调移液器一套包括~μL支~μL支~μL支与移液器匹配的滴头mL离心管mL或mL(与扩增仪配套)塑料管。Trizol试剂氯仿异丙醇反转录酶MMLV(UµL)乙醇焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液mmolLdNTPPCRBuffermmolLMgClμmolL引物TAE(保存液)和TAE(使用液)LoadingBuffer琼脂糖BSA(mgmL)CYBgreen可用于检测的病料包括扁桃体、淋巴结、脾脏和母猪流产胎儿及死胎(扁桃体、淋巴结和脾脏)保存备用。取部分材料~g于无菌研钵磨碎并用PBS(M,PH~)稀释成:乳剂(或将病料用剪刀剪成小块放入mL青霉素小瓶进一步剪碎按倍体积的PBS后用匀浆机匀浆)保存备用或立即用于RNA提取。RNAa)取处理好的稀释样品~µL加入µLTRIZOL试剂涡悬混匀在~温育~min加入µL的氯仿盖紧管盖上下颠倒混匀s~温育~min~g离心minb)转移水相µL到一新的离心管中加入mL的异丙醇~作用min~g离心minc)弃去上清液加入乙醇mL振摇~g离心mind)弃去上清干燥沉淀物(室温约min)加入µLDEPC水溶解保存或立即使用(置冰上)。根据华中农业大学年在Genbank中公开发表的序列DQ设计的引物产物大小为bp引物序列如下:gE:'CCACCCGACGCTACGATTGT'gE:'CTGGCATCCATCATTCCCTG'RT以提取到的组织总RNA为模板进行反转录反转录体系为µL。反转录体系如下:RNAµLμmolL引物(gEgE)µL于水浴中分钟然后室温冷却分钟再加入:dNTP(mM)µLMMLVbufferµLBSA(mgmL)µLMMLV反转录酶µL混均后水浴分钟。保存。PCRcDNAµLPCRbufferµLdNTP(mM)µLMgCl(mM)µL上游引物(μmolL)µL下游引物(μmolL)µLTaqDNA聚合酶(U)µL灭菌双蒸水µL配好反应液后将PCR反应管置于PCR仪内循环参数如下:minminmin共个循环minmin将PCR产物放保存或立即做琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。称取g琼脂糖加入mLTAE中加热融化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中胶板厚mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样空)放入电泳槽中加TAE缓冲液淹没胶面。取~μLPCR扩增产物和~μL加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加孔阳性对照的扩增产物作为对照没有阳性对照的情况下一定加Marker。电压~V或电流~mA电泳~min。电泳结束后取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上即他们与加样孔的距离相同或根据Marker判定大小与设计的大小(bp)一致则该样品判定为阳性。如果是在免疫后d采集的样品PCR检测结果阳性表明该猪(群)已感染野毒根据流行病学、临床症状和病理变化判定猪群是否发病。自定标准。适用于猪细小病毒(PPV)病的PCR诊断。台式高速离心机DNA扩增仪水浴锅稳压稳流电泳仪和水平电泳槽电泳凝胶成相分析系统可调移液器一套包括~μL支~μL支~μL支与移液器匹配的滴头mL离心管mL或mL(与扩增仪配套)塑料管。TEN缓冲液%SDSmgmL蛋白酶K饱和酚酚:氯仿:异戍醇(::)氯仿:异戍醇(:)纯乙醇mmolLdNTPPCRBuffermmolLMgClμmolL引物TAE(保存液)和TAE(使用液)LoadingBuffer琼脂糖CYBgreen采集病猪的淋巴结、脾脏、肝脏置保存。DNAa)所采病料经组织研磨器充分研磨按:用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内反复冻融次rmin离心min。b)取上清液μl,加入μl%SDS和μl的mgmL蛋白酶K水浴摇床上放置h。c)加入等量的饱和酚μl涡旋s。d)离心取上清液加等量的酚:氯仿:异戍醇(::)抽提一次。e)用氯仿:异戍醇(:)再抽提一次。f)用乙醇沉淀真空抽干后加入μl双蒸水溶解贮存备用。根据GenBank中公开发表的序列设计扩增猪细小病毒VP基因部分片段序列如下:P:′CAGAATCAGCAACCTCAC′P:′TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG′反应体系μl组成如下:引物各μlmMMgClμldNTPsμl缓冲液μlTaq聚合酶μlDNA模板μl灭菌去离子水μl扩増条件为:变性min进入循环sss个循环后延伸min。称取g琼脂糖加入mLTAE中加热融化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中胶板厚mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样空)放入电泳槽中加TAE缓冲液淹没胶面。取~μLPCR扩增产物和~μL加样缓冲液和和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加孔阳性对照的扩增产物作为对照没有阳性对照的情况下一定加Marker。电压~V或电流~mA电泳~min。电泳结束后取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上即他们与加样孔的距离相同或根据Marker判定大小与设计的大小(bp)一致则该样品判定为阳性。(FMDV)PCR参考GBT和OIEFMDV参考实验室的方法(NB:VERSIONADOPTEDMAY)。适用于FMDVO型和AsiaI型的PCR诊断。水泡液和水泡皮:用一次性注射器抽取水泡液用灼烧的止血钳封死注射器前端放入保鲜盒加冰贮存送检将水泡皮剪下放入干净青霉素瓶中放入保鲜盒加冻贮存送检。组织脏器:如血液、淋巴结、肌肉等。取样后放入干净青霉素瓶或干净食袋中于保鲜盒内加冰贮存送检。鼻咽拭子:用灭菌的棉签采集后放保鲜袋中加冰贮存送检。水泡皮、脏器等:取g用无菌PBS缓冲液(M,pH)冲洗干净剪碎、研磨用PBS稀释成:~:的悬液置冰箱过夜。rpm离心min取上清液为检测材料。鼻咽拭子:加入mLPBS缓冲液充分挤压取出棉签rpm离心min取上清液。血液、水泡液:血液可直接作检测材料水泡液于rpm离心min后取上清若量太少可适当加入PBS缓冲液。PCR根据Genbank中AsiaIJiangsu株自行设计引物片段大小约bp序列如下:Asia:′ACTCACCCAGCCCAAGAGCAC’Asia:′GCGTGCAAGGGCGGCGAGATC’根据武汉大学在Genbank中公开发表的序列自行设计扩增片段大小约bp序列如下:O:′GTCAAGCCACAGGAACAGG′O:′AGAGTTCTTTCTGCCTTCTGAGC′RNAa)取处理好的稀释样品~µL加入µLTRIZOL试剂涡悬s混匀室温静止min加入µL的氯仿盖紧管盖上下颠倒混匀s室温静止min~g离心minb)转移水相µL到一新的离心管中加入mL的异丙醇混匀室温静止min~g离心minc)弃去上清液加入乙醇mL振摇~g离心mind)弃去上清干燥沉淀物(室温约min)加入µLDEPC水溶解保存或立即使用(置冰上)。RTRNAµLμmolL引物(gEgE)µL于水浴中min然后室温冷却分钟再加入:dNTP(mM)µLMMLVbufferµLBSA(mgmL)µLMMLV反转录酶µL混均后水浴分钟。保存。PCRcDNAµLPCRbufferµLdNTP(mM)µLMgCl(mM)µL上游引物(μmolL)µL下游引物(μmolL)µLTaqDNA聚合酶(U)µL灭菌双蒸水µL配好反应液后将PCR反应管置于PCR仪内循环参数如下:minminAsiaI型O型min共个循环minmin。将PCR产物放保存或立即做琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。称取g琼脂糖加入mLTAE中加热融化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中胶板厚mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样空)放入电泳槽中加TAE缓冲液淹没胶面。取~μLPCR扩增产物和~μL加样缓冲液和适量CYBgreen混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加孔阳性对照的扩增产物作为对照没有阳性对照的情况下一定加Marker。电压~V或电流~mA电泳~min。电泳结束后取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。如某一待检样品扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条直线上即他们与加样孔的距离相同或根据Marker判定大小与设计的大小(或bp)一致则该样品判定为阳性。参考GBT。适用于猪球虫病的实验室诊断。饱和盐水。目尼龙膜或钢丝网、mL量杯、mL烧杯、mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、显微镜、载玻片、盖玻片等。被检动物新鲜粪便不少于g。取被检动物的新鲜粪便g放入mL烧杯中加入适量水。轻轻摇匀经目铜丝网或尼龙网过滤。将滤液移入支mL~mL试管中rmin离心min。倾去上清液各管沉淀物中加入少量饱和盐水混匀。各管的沉淀物混悬液移入一个mL玻璃瓶。用饱和盐水加满盖上盖玻片静置min。取下盖玻片放在载玻片上镜检。球虫卵囊呈椭圆形、圆形、卵圆形或梨形等不同的形态均有卵囊壁。卵囊内有个孢子囊每个孢子囊含个子孢子。注意与猪艾美耳属球虫卵囊区别后者卵囊内有个孢子囊每个孢子囊内含个孢子。判定a)发现虫卵判为阳性说明该动物已经感染球虫。b)未发现虫卵的需重复检查次仍未见虫卵本粪样可判为阴性。只有连续检查粪便~d均未发现虫卵方可说明该动物(群)未感染球虫。PBS。mL或mL烧杯、吸管、镊子、玻片、盖玻片、显微镜、水浴锅。疑为发生球虫病的动物的粪便。或球虫感染致死或将要死的动物。对疑为球虫感染致死或将要死的动物进行剖检观察病变情况。主要检查肠道病变。若肠道明显肿大、胀起或变肠浆膜面出现针尖大小颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点或斑块肠内容物充满出血块、脱落的上皮细胞、纤维蛋白、粘液等呈暗红色、橙黄色或乳白色多为稀薄状肠粘膜增厚有坏死的病灶和灰白色的斑点或斑块等可疑为球虫病进一步做球虫裂殖子或卵囊的检查。取病变明显的肠道纵向剪开用PBS轻轻洗去粘膜表层的杂物。刮取少许粘膜放在载玻片上滴~滴PBS加盖玻片置于显微镜下检查。在高倍镜下如见有大量球形的像剥了皮的枳子似的裂殖体和香蕉形或月牙形的裂殖子即可确诊为球虫病。将病变明显的肠道纵向切开。取少量内容物放在载玻片上滴~滴PBS加盖玻片轻轻将内容物压散置于显微镜下检查若见大量球虫卵囊可确诊为球虫病。或取有灰白色斑点或斑块的肠道纵向切开用PBS洗去粘膜表面的杂物。刮取少许有灰白色斑的粘膜放在载玻片上滴~滴PBS,轻轻将内容物压散置显微镜下检查若见大量球虫卵囊可确诊为球虫病。检测项目检测方法试剂供应商用途检测猪瘟猪瘟抗原(ELISA)IDEXX公司抗原监测抗体猪瘟猪瘟抗体(ELISA)IDEXX公司水平厦门市格林沃生物技术监测抗体猪瘟抗体免疫金标检测试纸有限公司水平检测野毒伪狂犬野毒感染抗体(gEELISA)IDEXX公司感染繁殖与呼吸综抗体检测(ELISA)IDEXX公司检测抗体合征FMDVNS检测野毒IDEXX公司抗体检测(ELISA)感染O型FMDV抗体免疫金标检厦门市格林沃生物技术监测抗体测试纸有限公司水平口蹄疫O型FMDV正向间接血凝抗监测抗体兰州兽医研究所体检测试剂盒水平AsiaI型液相阻断ELISA抗体监测抗体兰州兽医研究所检测试剂盒水平细小病毒乳胶凝集华中农业大学抗体流行性乙型乳胶凝集华中农业大学抗体脑炎大肠杆菌分离鉴定北京陆桥病原沙门氏菌分离鉴定北京陆桥病原魏氏梭菌分离鉴定北京陆桥病原猪痢疾密螺旋分离鉴定北京陆桥病原体猪胸膜肺炎放抗体检测(IHA)兰州兽医研究所抗体线杆菌马兽疫链球菌分离鉴定北京陆桥病原弓形体抗体检测(IHA)兰州兽医研究所抗体猪等孢子球虫检查虫卵北京陆桥病原

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