柚皮提取物的抑菌作用

柚皮提取物的抑菌作用 李春美 杜 靖 谢笔钧 (华中农业大学食品科技学院，武汉，430070) 摘 要 用乙醇作提取剂提取柚皮，将提取物经过初步分离纯化得到黄酮含量为 10．9％的柚皮提 取物(SPE)，并对其抑制细菌和霉菌的作用进行了研究。用滤纸片扩散法测定了相对抑菌活性，采 用固体稀释法确定柚皮提取物的最小抑菌浓度(MIC)，并进一步研究了pH值、温度对柚皮提取物 抑菌作用的影响，采用 3点接种法初步研究了样 品对米曲霉、黑曲霉、青霉 的抑制作用。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明．柚皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，其 MIC均为2．5％；对沙门氏菌的 抑制作用较弱，其 MIC>2．5％；pH值和温度对柚皮提取物的抑菌活性均有影响，SPE在偏酸性条 件下抑菌效果较好；样品经50℃处理对其抑菌活性影响不大；但处理温度提高到 80℃和 10012时， 其抑菌活力明显降低。在供试的 3种霉菌 中，柚皮提取物对黑 曲霉 的抑制作用最强，抑制率为 60．5％；对米曲霉的作用较差，抑制率为 34．3％。 关键词 柚皮，提取物，抑菌作用 研究表明，葡萄柚提取物不仅对金黄色葡 萄球菌和大肠杆菌和伤寒杆菌有较高的抑菌活 性，而且是强效广谱的抗真菌药物[ 。Negi等 人也证实，葡萄柚中正己烷提取物的醇溶组分 有较强的抑菌活性，且对革兰氏阳性菌更为有 效L2J。但是对于柚皮提取物抑菌的研究，国内 仍处于探索阶段，与之相关的文献报道和研究 很少，仅林捷等研究了柚皮的乙酸乙酯提取物 的抑菌作用。证实了其对苏云金芽孢杆菌、卵 黄色八叠球菌以及酸泡菜中分离的混合细菌有 很强的抑制作用 J。 研究中通过采用乙醇提取柚皮中的活性成 分(主要为柚皮黄酮)，选择了几种细菌、霉菌， 对柚皮提取物的抑菌作用进行了初步的研究， 旨在为我国柚子的综合开发利用提供理论依 据。 1 材料与方法 1．1 材 料 柚皮提取物：自制，总黄酮含量为 10．9％。 葡萄柚原液：湖北庆生堂医药集团有限公 第一作者：博士，副教授。 *湖北省自然科学基金资助项目(No．2001ABB107) 收稿时间：2003一o7—25．改回时间：2003—12—04 (38) 司 。 菌种：供试大肠杆菌(Escherichia coli)、伤 寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球 菌 (Staphylococcus aureus)、米 曲 霉 (As— pergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、 灰绿青霉(Penicillium glaucum)均由我校畜牧 兽医学院提供。 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖马铃 薯(PDA)培养基。 1．2 方 法 1．2．1 柚 皮提取 物 的 制备 称取柚皮干粉200g，以60％的酒精浸提干 粉 2次，第 1次以 20：1的料液比浸提，第 2次 以 10：1的料液比浸提，抽滤得到柚皮提取液。 真空浓缩，得到浓缩液。将浓缩的乙醇提取液 上 NKA9大孔树脂柱，用蒸馏水洗脱，至洗脱 液中不在含糖，然后用 60％的酒精进行洗脱， 将洗脱液重复上柱，收集 60％乙醇洗脱液，回 收溶剂，冷冻干燥后制得样品。置于干燥器中 备用。经芦丁 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 比色法测定，提取物中总黄 酮含量为 10．9％。 维普资讯 http://www.cqvip.com 1．2．2 柚皮提取物的抑 菌活性研究 1．2．2．1 混平板 稀 释法 测 定 最低 抑菌 浓 度 (MIC)t4,5] 菌悬液的制备：取大肠杆菌、沙门氏菌和金 黄色葡萄球菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基 斜面，37℃培养约 24 h，用接种环从斜面上挑菌 到 100mL无菌水中制成菌悬液，稀释 10倍，并 通过混平皿计数，确定菌液的稀释度，使最后的 菌悬液所含活菌量在 1×10 ～1×10’cfu／mL。 接种培养：无菌操作下，用取液器吸取相同 体积的菌液和不同浓度的柚皮提取物到灭菌小 离心管中，充分混匀后，迅速注入 200 L到灭 菌平皿中，每种浓度的柚皮提取物做 2个平行， 以菌液和同体积的无菌水的混合液注 200,uL 作空白，也可直接注入菌液 100 L作空白；倒 入 已灭菌置 45℃ 下恒 温的培养基 10～12 mL (每次实验平皿中培养基倒入量应保持一致)， 晃动平皿使混合液充分散开，均匀分布到平皿 上，待培养基凝固后，置 37℃培养箱中培养 1～ 2 d观察菌落生长情况，并对菌落计数。以下式 计算抑菌率： 抑菌率(％)：窒鱼 ×100％ 1．2．2．2 滤纸片扩散法测定抑菌圈[ ， ] 菌悬液及柚皮提取物的制备：直接用接种 环挑取已经活化好的斜面菌种到无菌水中制成 菌悬液(含活菌量较大，以便抑菌实验中可以致 密接种)。用无菌水倍比稀释配制 5％、2．5％、 1％、0．5％四个浓度的柚皮提取物，用无菌水稀 释配制 1：50的葡萄柚原液。 滤纸片的制备及处理：用灭菌镊子取烘干 后的灭菌滤纸片到配制好的柚皮提取物中浸 2 h，置 30℃烘箱中烘干备用。以无菌水浸过的 滤纸片做空白。 接种培养：无菌操作下，倒入灭菌过的培养 基制成平板，将菌悬液注 100,uL到平板上，用 涂布棒涂抹均匀后放置约 30 min后以无菌操 作将含柚皮提取物的 5．5 mm滤纸片贴到培养 基上，每个平皿贴全所有浓度及空白的滤纸片， 共计 6张，每种菌做 2个平行；置 37*(2培养箱 鬻 鲁 中培养 1～2 d观察测量抑菌圈直径大小。 1．2．2．3 介质 pH值对柚皮提取物抑菌效果 的影响 不同pH值培养基的准备：配制普通牛肉 膏蛋白胨培养基，分为 3份，调节 pH值分别为 5、6、7，121℃灭菌 20min备用。 菌悬液制备及接种培养：同 MIC法，所用 柚皮提取物浓度为 1％。 1．2．2．4 温度对柚皮提取物抑菌效果的影响 样品的处理及制备菌悬液：取 1％的柚皮 提取物，用4支小离心管分装，1支于室温(20 ～ 25℃)下放置，另外 3支分别置 50℃、80℃、 100℃的不同烘箱中处理 2 h，取出备用。以无 菌水稀释已活化好的大肠杆菌和沙门氏菌种制 备含活菌量 1×10 ～1×10 cfu／mL的菌悬液 备用。 接种培养：同 1．2．2．3节。 1．2．2．5 菌种点接法测试对霉菌的抑制作 用【 ， ] 霉菌菌种的活化：制备 PSA培养基斜面， 取黑曲霉、米曲霉、青霉菌种接种到斜面上活化 24 h，取活化菌再次接种到斜面上进行 2次活 化 48h，备用。 接种培养：无菌操作下，用取样器吸取 5％ 柚皮提取物到 6个灭菌平皿中，每种菌做两个 平行，另取6个灭菌平皿作空白，倒入已灭菌置 45℃下恒温的PSA培养基约 15 mL(每次实验 平皿中培养基倒入量应保持一致)，充分混匀制 成平板。用接种针把少量的三种霉菌接种在平 板表面上，成等边 3角形的 3点接种，在温度 28±1℃的培养箱中培养 2～3d，使各自独立形 成菌落，分别于第 2天和第 3天观察记录菌落 生长情况，并测量菌落直径大小。 抑菌率通过以下公式计算： 抑菌率／％=皇鱼 麓 ×·00 2 结果与分析 2．1 柚皮提取物对细菌的抑制作用 2．1．1 固体稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) (39) 维普资讯 http://www.cqvip.com 研究报告 用稀 释 好 的 0．25％、0．5％、1％、2％、 菌，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的 MIC，并计 2．5％等 5个浓度的柚皮提取物测定对大肠杆 算抑菌率，结果见表 1。 表 1 SPE对 3种不同细菌的 MIC及抑菌率 由表 1可见，柚皮提取物对大肠杆菌，金葡 球菌和沙门氏菌都具有一定的抑菌作用。对大 肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，其 MIC均为 1％，但对沙门氏菌的抑制作用较弱， 当浓度达到2．5％时，抑制率仅为65．2％。 2．1．2 滤纸圆片法测定抑菌圈 用稀释好的0．5％、1％、2．5％、2．5％和 1： 50的葡萄柚原液 5种不同浓度的柚皮提取物 的抑菌圈直径大小，比较柚皮提取物的抑菌效 果，结果见表 2。 表 2 滤纸圆片法测定不同浓度柚皮 提取物的抑菌圈 mm 注 ：表中数据为抑 菌圈直径平均 值。其中 0表不 无抑菌 圈 形成。滤纸片直径为5．5 mm 抗菌素抑菌圈试验结果的判定标准是：抑 菌圈直径 >15 mm时为高度敏感、10～15 mm 时为中度敏感，7～9 mm时为低度敏感、无抑菌 圈者为不敏感。从表 2可以看出，葡萄柚对供 试 3种细菌均有很强的抑制效果，2％的葡萄柚 原液抑菌圈均大于 15 mm，属高度敏感，而柚皮 提取物对所试 3种细菌均有一定的抑制效果， 当提取物浓度为 1％时即有一定的抑菌圈，而 且随着提取物浓度的增加，其抑菌效果也成上 升趋势，当浓度达 5％时均表现为中度敏感，但 相比较而言，SPE对大肠杆菌和金葡球菌的抑 (40) 制作用强于沙门氏菌，这与 MIC的实验结果一 致。但是其量效关系和 MIC实验相比较，不是 很明显。这可能是与提取物的扩散性有关，当 提取液在滤纸片吸附后，不能很好的扩散到培 养基中去，影响了抑菌效果。 2．1．3 pH值对柚皮提取物抑 菌效果的影响 分别调节牛肉膏蛋白胨培养基 pH值为 5、 6、7．2，用平板稀释法测定 1．0％柚皮提取物在 不同pH的环境中对供试 3种细菌的抑制效 果，结果见图 1。图 1表明，pH对柚皮提取物 抑菌有较明显的影响，偏酸性的 pH值更有利 于抑菌。在 pH5～6范围内，柚皮提取物抑菌 效果更好，这可能是因为柚皮黄酮是提取物中 起抑菌作用的主要物质之一，而柚皮黄酮在酸 性条件下比较稳定。同时，当介质 pH分别为 5 和 6时，空白对照中金黄色葡萄球菌和沙门氏 菌的菌落数也明显少于 pH7．2时，这是因为金 黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最适生长条件是 pH 7．0～7．5，在酸性条件下金黄色葡萄球菌 和沙门氏菌本身的生长也受到了抑制，而大肠 杆菌的最适生长条件是 pH6．0～7．0，在 pH5 时，其本身的生长也受到了一定的抑制。 l00 碍 5o 曩 0 pH5．0 pH6 pH7．2 pH值 图 1 介质 pH对 SPE抑菌效果的影响 2．1．4 温度对柚皮提取物抑菌效果的影响 分别用不同温度下处理柚皮提取物，用平 维普资讯 http://www.cqvip.com 板稀释法测定不同温度处理后的 1．0％柚皮提 取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果。结果 见图 2。 温度，℃ 图 2 温度对 SPE抑菌效果 的影 响 图 2表明，经过 50℃处理，样 品的抑菌活 性基本未变，但经过 80℃和 100℃处理后样品 的抑菌活性已经大幅度降低，这可能是经过高 温加热后，提取物中抑菌物质的化学结构发生 了变化，从而降低了抑菌效果。 2．2 菌种点接法测定对霉菌的抑菌作用 制备含柚皮提取物的 PSA培养基平板，将 黑曲霉、青霉和米曲霉 3点接种到平板上，培养 观察测定菌落直径大小，以初步评价柚皮提取 物对霉菌的作用效果，结果见表 6。 表 3 柚皮提取物对 3种霉菌的抑制作用 注 ：表 中黑 曲霉实验 用的抽皮提 取物浓 度为 2％．其 他 2 种菌用的是 5％；表中数据为菌落直径单位 mm。 表 3表明，柚皮提取物对霉菌有一定的抑 制作用，对黑曲霉的抑制作用最明显，2％的柚 皮提取物抑制率为 60．5％；对青霉和米曲霉的 抑制作用相对较弱 5％的柚皮提取物对青霉和 米曲霉抑制率分别为 59．5％和 34．3％。 3 讨 论 Negi等 研究发现，葡萄柚的正己烷提取 物的醇溶组分有较强的抑菌活性，混合物的抑 菌活性强于从中所分离出的纯柚皮苷， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 是 多种组分共同发挥抑菌作用的。林捷等 。 用 嗣黼 鲁 不同溶剂提取梁平柚皮并对提取物抑菌作用进 行了研究，结果表明柚皮经乙酸乙酯浸提而得 的提取物抑菌效果最好，而乙醇、石油醚 、丙酮 、 乙醚浸提的样品抑菌效果并不理想。且乙酸乙 酯提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用很 微弱，而对苏云金芽孢杆菌，卵黄色八叠球菌等 革兰氏阳性菌具有很强的抑制作用[63。因此 他认为，提取物中起抑菌作用的主要是香精油 类物质如百里香酚、紫苏醇、乙酸芳樟醇等。本 实验以在分类学上与葡萄柚最相近的胡柚为试 材，发现其乙醇提取物对金黄色葡萄球菌，大肠 杆菌及沙门氏菌均有较强的抑制作用，对黑曲 霉，米曲霉和青霉也有一定的抑制作用，且研究 中发现，提高黄酮含量，其抑菌活性也相对提 高，这说明本实验所得的提取物中黄酮类化合 物是主要的活性成分之一。有关提取物中主要 活性成分的结构及抑菌机理还有待进一步研 究。 参 考 文 献 1 蒋云霞，刘德峰，朱军生等 ，葡萄柚植物消毒剂杀 菌效果与毒性的试验观察[J]．中国消毒学杂志， 2001，18(4)：227--230 2 Negi P S。Jayaprakasha G K．Antibacterial activity of grapefruit(Citrus paradisi)peel extract[J]．Eur Food Res Technol，2001(213)：484～487 3 林 捷，吴锦铸，朱新贵 ，柚皮提取物的抑菌作用 研究[J]．华南农业大学学报，1999，20(3)：59～62 4 熊平源，边藏丽，胡 萍等 ．食醋对 15种病原菌最 低抑菌浓度测定[J]．武汉科技大学学报(自然科学 版 )，2000，23(3)：318～319 5 张 伟 ．蜂胶对食品致病菌抑菌作用研究[J]．食 品科学，1998(3)：40～42 6 李倩如，姜永嘉，张耀东．银杏叶乙醇提取物对霉 菌抑制作用的研究(一)——银杏叶乙醇提取物对 储藏物霉菌的抑制作用[J]．郑州粮食学院学报， 2000，21(2)：16--20 7 Gafnen S．An tifungal and An tibacterial Chalcones from Myrica Soserratta[J]．Planta Med，1996，62 (1)：67～69 (下转第 56页) (41) 媾、碍器嚣 维普资讯 http://www.cqvip.com 研竞报告 Effect of Food-originated Compounds on the Ice．nucleation Active Bacteria Song Liping Chen Qingsen Ji Ruifang (Department of Biological Engineering，Tianjin University of Commerce，Tianjin，300400) ABSTRACT Food—originated compounds enhancing the ice—nucleation active bacteria to express the ice nucleation active protein．The mustard seeds are added in the medium for cell culture of the ice nu— cleation active bacteria Xanthomonas ampelina TS206．It is shown that the activity of the bacteria is increased 37．5％ and the biomaSs is increased 36．2％ ．The mustard seeds are assumed tO be a kind of effectors that can active the promoter and enhance the initiation of the translation．The compound is an enhancer in the process of the gene express and it increases the productivity of the ice mucleation active protein． Key words food—orginated compo unds，ice nucleation activity protein，ice nucleation activity bacteria (上接第 41页) Antimicrobial Activity of Shaddock Peels Extract Li Chunmei Du Jing (Department of Food Science，Huazhong Agriculture Xie Bijun University。Wuhan，430070) ABSTRACT Shaddock peels extracted(SPE)with the content of flavone of 10．9％ was obtained US— ing ethanol extraction and its antimicrobial activity against a series of bacterium and mold was studied． it iS indicated that SPE can effectively inhibit the growth of bacteria．The minimal inhibition concen— tration(MIC)of SPE to different bacteria are as folloWS：Escherichia coli 2．5％；Staphylococcus au— reus 2．5％ 。salmonella>2．5％ ．It iS seen that pH value and temperature affect the antibacterial ac． tivity of the SPE．SPE was more effective under acid condition．The antibacterial activity didn’t change remarkably when the sample was treated below 50℃ but it will decrease when temperature is over 80*(2．The extract can also inhibit the growth of mold．the inhibit rate of the SPE to Aspergillus niger V，Tiegh，Penicillium and Aspergillus otyzae were 60．5％ ，59．5％ ，34．3％ respectively． Key words shaddock peels，extract，antimicrobial activity 信息窗 澳大利亚利用葡萄渣制作保健食品 香醇的葡萄酒不仅口感好，还有健体强身的作用。最近，澳大利亚科学家利用从加工葡萄酒剩下的残渣中提取的抗氧化剂制 成有益健康的椒盐脆饼。 在澳大利亚南部的巴罗萨葡萄酒加工区，每年都会产生大约1万t葡萄渣，研究者从葡萄渣里挑出葡萄籽，再将富含抗氧化剂 的葡萄籽皮熔化成液体，经过烘干就制成了黄色粉末状的抗氧化剂。将这种抗氧化剂添加到休闲食品中，可制成各种有益健康的 小食品。 (56) 维普资讯 http://www.cqvip.com