利用谷物进行类胡萝卜素固态发酵

▲ 皂 鲁学 磅 T 曲 C n^ ,c'prrn~nf．9,#k)n In~zqtriP．．q 利用谷物进行类胡萝 卜素固态发酵 徐 军 崔丽霞 韩建荣 (山西大学生命科学与技术学院，太原，030006) 摘 要 研究了7种谷物培养基及相关因素对青霉 PT95菌株进行类胡萝 卜素固态发酵的影响作 用。结果表明，谷物培养基的组成对 PT95菌株在固态发酵条件下的菌核生物量和菌核中的类胡 ． 萝 卜素含量都有明显的影响；接种方式和接种量能明显影响谷物培养基上的菌核生物量，但对菌 核中的类胡萝 卜素含量没有明显的影响；在各物培养基里添加麸皮有利于菌核的形成。在选择最 佳接种方式、接种量，并在培养基里添加2O％麸皮(干重)的固态发酵条件下，大米培养基上得到的 菌核生物量最高，达到 15．00g／lO0 g(干料)；荞麦培养基上，茵核中的类胡萝 卜素含量最高，达到 826 g／g(干菌核)；而在各子培养基上，类胡萝 卜素产率最高，达到 11 457~g／100g(干料)。 关键词 青霉，谷物培养基，固态发酵，类胡萝 卜素产率，菌核生物量 类胡萝 卜素是自然界分布非常广泛、意义 菌株的生长发育以及产生类胡萝 卜素的情况。 妻萋 ： 。仃 酵法生产 1材料与方法 ,／~ 类胡萝 卜素具有不受环境条件限制、lx- -T---_上一T业,Ib ⋯ 一 化生产、提取工艺简单等优点，所以近年来引起 1．1 菌 株 国内外的普遍重视。日益增多的研究报道主要集 青霉 PT95菌株，从山西汾阳混交林土壤 中在少数几个菌株，例如 B／akedea tHspora，脚 一 中分离得到，保存在查氏琼脂斜面上。 comyces blakesleeanus，Phaff~ 等[1--4]。 1．2 接种物的准备 这些菌株无一例外都是在菌丝体或单细胞营养 从 PT95菌株 7 d菌龄的查氏斜面上用无 体内积累类胡萝 卜素的。一 株经鉴 定属于 菌水洗下分生孢子，并制成 100个／mL的孢子 Penicillium thomii的青霉PT95菌株是迄今唯 悬液；在 125 r／min，25~(2条件下摇床培养 48 h 一 报道过的能在菌核内积累类胡萝 卜素的微生 菌株，收集菌丝体并制成 5．0 mg／mL的悬液； 物菌株[ ， 。该菌株只能在固态培养或固态发 从 20 d菌龄的查氏平板上用无菌水洗下菌核， 酵的条件下形成菌核和积累色素，因此只能选 经离心处理洗掉分生孢子，再将纯化后的菌核 择固态培养或固态发酵方法进行有关的基础研 用研钵适当研磨(无菌操作)，制成 5．0 mg／mL 究和应用开发研究。韩建荣等[ ]已经证明了 的菌核悬液。 玉米培养基比麸皮培养基和棉籽壳培养基更适 将以上 3种悬液分别作为固态发酵的接种 合于 PT95菌株固态发酵产生类胡萝 卜素。 物。 我国谷物资源丰富，可供利用的谷物种类 1．3 固态发酵培养基 很多。除了玉米以外，还有哪些谷物适合于 共制备 7种谷物培养基。将玉米、大米、小 PT95菌株进行类胡萝 卜素固态发酵生产，目前 麦、高粱、荞麦、谷子、糜子在 60~(2下烘干并粉 尚不清楚。研究中选择了玉米、大米、小麦、高 碎过 20目筛。分别称取25 g，各加入 20 mL盐 粱、荞麦、谷子、糜子等 7种谷物分别配制成固 溶液，pH6．0。盐溶液组成：K2HP04 1 g，KC1 态培养基，分析比较了在各种培养基上 PT95 0．5 g，MgS04·7H2O 0．5 g，FeS04 0．O1 g，定容 第一作者：硕士，讲师。(韩建荣教授为本文通讯作者)。 *国家自然科学基金资助项目(No．30070021) 收稿时间：2003—04—02，改回时间：2003—08—01 麟 ———。 C 5) 维普资讯 http://www.cqvip.com 生产与科研经 鸷 到 1 L。 1．4 固态发酵方法 将上述固态发酵培养基分别装入 250 mL 三角瓶中。0．1 MPa 30 min灭菌后接入 2 mL菌 种悬液。25"C黑暗培养 20 d。所有试验均设 5 次重复。 1．5 菌核生物量测定 待 PT95菌株在各三角瓶中形成菌核并呈 橙红色时。向瓶中加入适量自来水，用玻璃棒反 复搅拌。使沙粒状菌核与发酵基质分离并沉淀 到瓶底。弃去上层发酵基质与水的混合物，收 集沉淀在瓶底的菌核，用水充分冲洗干净，置 50℃烘干称重。 1．6 类胡萝 卜素的提取及含量测定 按参考文献[5]的方法提取菌核中类胡萝 卜素，并按参考文献[7]的方法计算类胡萝 卜素 含量。 1．7 类胡萝 卜素组分分离 按参考文献[1]的方法，在硅胶 G薄板(青 岛海洋化工厂产品)上分别用浓缩后的类胡萝 卜素一CCla浸提液和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 胡萝 卜素(Merck产 品)cch溶液点样，以 V(石油醚)：V(乙酸乙 酯)=9：1为展开剂，于暗处展开，使各组分分 离。 1．8 p-胡萝 卜素的测定 按参考文献[6]的方法进行。 1．9 统计学处理 实验结果表达为平均值 ±标准差，用 Dun— can多重比较法 进行多个均数间两两比较的 显著性检验。 ． 2 实验结果 2．1 接种方式和接种量对 PT95菌株菌核生 物量和类胡萝 卜素含量的影响 从表 1可以看出，无论在哪一种培养基上， 3种接种物对 PT95菌株的菌核生物量有着不 同的影响。用菌核作为接种物比用分生孢子或 菌丝体作为接种物具有更好的效果，菌丝体的 效果最差。然而，接种物对菌核中的类胡萝 卜 素含量没有明显的影响。为了检查接种量的影 响作用，分别配制不同浓度的菌核悬液。接入三 角瓶中。使每瓶中的接种量达到 5mg、10mg、15 mg和 20 mg。结果表明，接种量能显著影响 PT95菌株的菌核生物量，不论在哪一种培养基 上都是这样。随着接种量的增加。菌核生物量 也在增加，接种量为 20 mg的三角瓶中收获的 菌核生物量最高(见表 2)。同样。接种量对菌 核中的类胡萝 卜素含量没有明显的影响。 表 1 接种物对 PT95菌株菌核生物量的影响 注：在同一列中带不同字母的数据差异显著(P<0．01) 表 2 接种量对 zrgs菌株菌核生物量的影响 接种量 菌核干重 ／g·100gI1(干料) g 至 小 麦 高 粱 荞 麦 谷 子 糜 子 5 11．03±0．88a 10．60±0．84a 5．30±0．37a 8．85±0．63a 7．90±O．63a 10 ． 70±0．85a 9．60±0．86a 1O 11．52±0．92a 11．30±0．90a 6．05±O．42a 9．43±0．67a 8 ． 50±0．68a 11．24±0．90a 10．30±0．93a 15 11．87±0．95a 11．73±0．84ab 6．62±0．52ab 10．05±0．90ab 8 ． 95±0．75ab 11．85±0．93ablO．95±0．86ab ： !圭 ：! ： 圭 ：!! ：! 圭 ． b 10—．—76~0．75b 9．40±0．66b 12．30±0．98b 11．45±0．91b 根据以上结果，在下面的研究中选择菌核 为接种物，接种量确定为每瓶 20 mg。 2．2 谷物培养基对 PT95菌株菌核生物量和 类胡萝 卜素产率的影响 在 7种谷物培养基上，PT95菌株的菌核生 物量和菌核中的类胡萝 卜素含量都有较大的差 异(表 3)。谷子培养基上菌核生物量最高。依 次是玉米、大米、糜子、高粱、荞麦和小麦。荞麦 维普资讯 http://www.cqvip.com 培养基上菌核中的类胡萝 卜素含量最高，依次 是谷子、小麦、高粱、糜子、玉米和大米。由于固 态发酵的类胡萝 卜素产率同时受菌核生物量和 菌核中的类胡萝 卜素含量的影响，谷物培养基 既然对 PT95菌株的菌核生物量和类胡萝 卜素 含量都有明显的影响，那么必然对类胡萝 卜素 产率也有明显的影响。为此，分别计算并比较 了各种培养基上的类胡萝 卜素产率，结果表明， 小麦培养基上的类胡萝 卜素产率最低，只有 4 928 g／100g(干料)；谷子培养基上的类胡萝 卜 素产率最高，达到9877~g／100g(干料)。 2．3 添加麸皮对 PT95菌株菌核生物量和类 胡萝 卜素产率的影响 用5 g麸皮代替培养基中的 5 g谷粒，使培 养基中的麸皮与谷粒的干重比达到 1：4，即在 培养基中添加 20％的麸皮，结果导致了菌株菌 核生物量的显著增加，但对菌核中的类胡萝 卜 素含量没有明显的影响(表 4)。添加麸皮以 ¨ ¨ 生产与斜唧参鼙 后，大米培养基上的菌 核生物量最高，达到 15．10 g／lOO g(干料)，依次是玉米、谷子、糜子、 高粱、养麦和小麦；养麦培养基上菌核中的类胡 萝 卜素含量最高，达到826~g／g(干菌核)；谷子 培养基上的类胡萝 卜素产率最高，达到 11 457 ／．tg／100g(干料)。 2．4 谷物培养基对 PT95菌株类胡萝 卜素成 分的影响 韩建荣等 J在以前的研究中证 明，PT95 菌株的菌核中积累的类胡萝 卜素由2种色素成 分组成，其中 8一胡萝 卜素占色素总量的 71％。 薄层色谱分析表明，在本实验条件下，从不同谷 物培养基上培养得到的菌核中积累的类胡萝 卜 素同样是由2种色素成分组成，不过各色素样 品中的8一胡萝 卜素的百分含量略有差异(表 3)。 培养基里添加麸皮对菌核中的 胡萝 卜素的百分 含量亦无明显影响(表 4)。 表 3 谷物培养基对 PT95菌株菌核生物量和类胡萝 卜素产率的影响 表 4 添加麸皮对 PT95菌株菌核生物量和类胡萝 卜素产率的影响 3 讨 论 一 般来说，氧气供应是固态发酵过程中必 须解决的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 [ 。本实验中添加麸皮可以适 当增／Jn-~-粒之间的空隙，因而也就增加了氧气 在培养基中的渗透。至于应该添加多大比例的 麸皮才能使固态发酵的效果最佳，或者说才能 获得最高的菌核生物量，还需做进一步的研究。 培养基底物颗粒的大小直接影响到单位体积反 应表面积，也会影响颗粒间菌体的生长、氧的供 应等u ，所以对于固态发酵过程，选择合适大 小的基质颗粒是十分必要的。研究中，尽管对 ( ) 维普资讯 http://www.cqvip.com 生产与科研经 赣 各种谷粒做了粉碎处理，但只选择了一种筛分 进行固态发酵实验；今后似有必要对其他筛分 也进行同样的比较实验，以选择最佳的颗粒大 小。 大多数青霉菌株都具有极强的产孢子能 力。PT95菌株在多种固态培养基上，尤其在天 然培养基或半合成培养基上，在形成大量菌核 的同时，亦能形成大量的分生孢子[ ．6]。理想 的情况是，能在最大量形成菌核的同时，尽可能 少地产生分生孢子，这对在固态发酵条件下菌 核的分离及色素的提取是非常有利的。也就是 说应该尽可能创造满足菌核分化需要，抑制分 生孢子产生的固态发酵条件。实验中以菌核作 为接种物比分生孢子或菌丝体作为接种物具有 更好的效果，这与在固态培养基里几乎没有分 生孢子的形成有很大关系。至于为什么菌核接 种物在各种谷粒培养基上能抑制分生孢子的产 生而有利于菌核分化，有待进一步探讨。 参 考 文 献 1 An G H，Schuman D B。Johnson E A．Isolation of Phaffia rhodozyma mutants with increased astaxan— thin[J]．Appl Environ Mierobiol，1989，55：116～ 124 2 Mehta B J，Salgado L M，Bejarano E R et a1．New mutants of Phycomyces blakesleeanus for~-earotene production[J]．Appl Environ Mierobiol，1997，63： 3657～ 3661 3 Vandamme E J．Prod uction of vitamins，coenzymes and related biochemieals by bioteehnologieal processes ．[J]．J Chem Teehnol Biotechnol，1992，53：313～ 327 4 张素琴，朱湘民，马国华 ．一株胡萝 b素高产菌 Cr- 1的研究[J]．食品与发酵工业，1989(5)：1～5 5 韩建荣，王肖娟。原香娥 ．青霉 PT95菌株菌核内 产生类胡萝 b素的研究[J]．微生物学通报，1998， 25(6)：319～321 6 韩建荣，徐 军 ．青霉 PT95菌株固态发酵产生类 胡萝 卜素的研究[J]．微生物学报，1999，39(2)： 148～ 153 7 王业勤，李勤生 ．天然类胡萝 卜素研究进展、生产、 应用[M]．北京：医药科技出版社。1997 8 杜荣骞 ．生物统计学 [M]．北京：高等教育出版 社，1985 9 Abdullah A L，Tengerdy R P，Murphy V G．Opti— mization of solid substrate fermentation of wheat straw [J]．Bioteehnol Bioeng，1985，27：20～27 10 Auria R，Morales M，Villegas E et a1．Influence of mold growth on the pressure drop in aerated solid state fermentor[J]．Biotechnol Bioeng，1993。41：1 007～ 】0】3 S(，lid-state Fermentation of Gl'ains for Carotenoid Production XU Jun Cui Lixia Han Jianrong (College of Life Science and Technology of Shanxi University，Taiyuan，030006) ABSTRACT Various grains and inocula were investigated for carotenoid production by solid．．state fer．． mentation using Penicillium sp．PT95．The millet medium was more effective to the sclerotia growth of strain PT 95 and carotenoid prod uction than other grain media．An inoculum in the form of scle．． rotium may obtain higher sclerotia biomass than either a spore inoculum or a mycelial pellet inoculum ． Supplementing wheat bran to grain medium favored the form ation of sclerotia．However ， neither the inoeulum type nor the supplementing of wheat bran resulted in a significant change in content of carotenoid in sclerotia．The effect of wheat brain in grain media with the ratio of wheat bran to grain 1：4(w／w，dry basis)was investigated．It is indicated that the medium consisting of rice and wheat bran gave the highest sclerotia biomass(15．10#100 g grain)；the medium consisting of buckwheat and wheat bran gave the highest content of carotenoid in sclerotia(826／~g／g dry sclerotia)and the medium consisting of millet and wheat bran gave the highest carotenoid yield(1 1 457~g／100g grain)． Key words Penicillium sp．， grain medium， solid—state fermentation， carotenoid yield ， sclerotia biomass 维普资讯 http://www.cqvip.com