红曲桔霉素高效液相色谱测定条件的优化

丝 _D 鱼 丝 ￡丝 ! 一 红曲桔霉素高效液相色谱测定条件的优化 陈 蕴 许赣荣 虞慧玲 (江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡，214036) 摘 要 对高效液相色谱测定红曲桔霉素的方法进行优化，比较不同色谱柱及流动相组成对 分离效果的影响，确定了采用色谱柱 ZORBAXEclipseXDB-C18(5／．an，250mm×4．6mm)，流动 相组成为 (乙腈)： (水)(pH2．5)=35：65。在优化条件下分离到的桔霉素色谱图经质谱 鉴定为单一组分。在优化的色谱条件下绘制了 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，低浓度标准样品的质量浓度与峰面 积的线性关系良好，R =0．9997。标准桔霉素 HPLC的最低检测质量浓度为 0．05mg／L 关键词 HPLC，桔霉素，甲醇，乙腈 近年来国内外学者研究发现u．2 J，红曲霉 菌的二级代谢产物桔霉素对人体的肾脏有一定 的毒害作用。桔霉素含有一个羧基，有两种形 式：离子态和非离子态其结构见图 1。桔霉素 易溶于极性有机溶剂，难溶于水。我国作为红 曲的故乡，越来越重视红曲产品中的桔霉素的 检测和控制，需建立一测定红曲桔霉素含量的 标准方法，以适应国际上对红曲产品中桔霉素 含量严格控制的要求。早期的桔霉素检测方 法，由于检测对象多为青霉菌的代谢产物，无需 考虑色素的干扰作用，而红曲产品中的桔霉素 的检测就要考虑到色素等杂质对检测的干扰作 用。本实验室多年从事红曲霉菌代谢产物的研 究，已建立了TLC及 HPLC测定红曲产品中桔 霉素的方法 J。但原方法存在一个突出的问 题是未采用最适流动相，造成桔霉素与有关杂 质无法分离。在不断实践的过程中，笔者优化 了红曲产品中桔霉素的检测条件，使桔霉素的 检测方法更简便、更准确。 1 材料与方法 1．1 红曲样品 市售产品。 1．2 试 剂 桔霉素标样：Sigma公司出品的标准样品。 萃取桔霉素用的甲苯、乙酸乙酯和甲酸均为分 析纯级，高效液相用乙腈、甲醇等均为色谱纯 级。 1．3 红曲样品的预处理 准确称取一定量(1～5g，根据样品中桔霉 素含量高低而定)红曲米粉于50mL烧杯中，加 入一定体积萃取剂[V(甲苯)／V(乙酸乙酯)／ V(甲酸)，简称 TEF，为 7／3／1]，称重( 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 下 连烧杯在内的质量)，用超声波破碎，每次 10 min(强度 40％，5 S，5 s)，处理，自然澄清、称重， 用 TEF补足至原质量。将上清液全部移入具 塞试管后搅匀，自然澄清、取上清液。残渣再加 TEF，超声波处理，共萃取 3次。上清液合并 后，微滤、用 HPLC分析。或取一定量的上清 液，真空浓缩至干，加 甲醇溶解后，微滤、用 HPLC分析 。 1．4 高效液相色谱条件 高效液相色谱仪：Angilent1 100系列； 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(5／xm， 250mm×4．6mm)，ZORBAX SB C1s(5 m，250 mm×4．6 mm)，NUCLEOSIL RP 18(5 m，250 mm×4．6mm)： 流动相：乙腈与水(pH2．5)的混合液，两者 第一作者：硕士。讲师。 *研究得到中国科学技术部“十五科技攻关计划：食品安全关键技术——食品工业用菌安全性的检测与评价 技术的研究”(课题任务书编号：2001BA804A02)的资助 收稿时间：2003—03—19。改回时间：2003—07—07 (118) 维普资讯 http://www.cqvip.com 比例见下文 ； 检测器：荧光检测器，检测波长为 =331 nm， =500nm； 柱温 ：28℃； 流速：1 mE／min或0．8 mL／min。 1．5 液质联用条件 仪器 ：Waters ZMD 4000。 质谱条件：负离子 电喷雾；毛细管 电压： 3．78kv；锥孔电压：30V；进口温度：120"(2；脱 溶剂温度：25*(2；倍增管：650 V；分子质量范围： 100～500 u。 2 结果与讨论 2．1 色谱柱对桔霉素检测的影响 比较了 ZORBAX Eclipse XDB-C18(5 m， 250×4．6mm)，ZORBAX SB C1s(5 m，250mm ×4．6mm)，NUCLEOSIL RP 18(5 m，250mm ×4．6mm)这 3根 C18柱对桔霉素定性定量检 测的影响。发现用 NUCLEOSIL RP 18(5 m， 250mm×4．6 mm)时的保留时间为 9．6min左 右，无法很好地分离出桔霉素 (图 1)，而用 ZORBAX Eclipse XDB—C18(5 m，250mm×4．6 mm)和 ZORBAX SB C18(5 m，250 mm×4．6 mm)这两根柱子的不仅桔霉素保留时间提前 到 5 min左右(保留时间分别为 4．805 min和 5．017min)，而且分离效果较好，可以得到桔霉 素单一的谱峰，但相比较而言，前者所获得的色 谱峰峰形较好(图2和图 3)。所以在以后的实 验中采用色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB．C18(5 m，250mm×4．6mm)。 0 5 10 15 2O 25 30 时问， 图 1 NUCLEOSIL RP 18柱分离色谱图 端 搿 务_辑与检毋】 O 2．5 5 7．5 10 12．5 15 17．5 20 22．5 时问／rain 图 2 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱 分离色谱图 O 2．5 5 ，．5 1o 12．5 15 l，．a 20 22．a 时lhYmin 图3 ZORBAX SB C18柱分离色谱图 2．2 流动相对桔霉素检测的影响 2．2．1 流动相 中采 用乙腈或甲醇对桔霉素检 测 的影响 在以前的测定方法 J中采用甲醇与水的 混合溶液为流动相，比较用乙腈或甲醇为流动 相时对桔霉素检测的影响。当用甲醇作流动相 时，保留时间为 7．244min，桔霉素峰的拖尾现 象较严重，并且桔霉素与有关杂质无法分离，造 成桔霉素保留时间不稳定，对桔霉素的定性和 定量都不是很准，见图 4。而采用乙腈作流相 时，保留时间相对缩短，为 4．534min，当乙腈与 水的比例合理时，能将桔霉素与杂质完全分开， 且保留时间稳定，可以对桔霉素定性定量，见图 5。所以采用乙腈与水的混合液为流动相。 时间／min 图4 V(甲醇)：V(水)=65：45时样品色谱图 (e1 ‘) 维普资讯 http://www.cqvip.com 分斩与检 时间／min 图5 y(乙腈)：y(水)=65：35时样品 NINXIA65—1的色谱图 2．2．2 流动相 中乙腈比例对桔霉素检测的影 响 分别采用乙腈与水的比例为 65：35、60： 4O、50：50、45：55及 35：65的溶液为流动相，检 测标样及样品中桔霉素浓度。如图4所示，图 6～图8为功能性红曲米样品(桔霉素含量较 低)中桔霉素的检测图谱，流动相中乙腈与水的 0 5 10 15 20 25 时问／min 图6 V(乙腈)：y(水)=65：35时 样品色谱图 u 5 l0 l ZU Z 时问／min 图 7 y(乙腈)：y(水)=50：50时 功能性红曲米样品色谱图 比例分别为 65：35，50：50和 45：55(流速 0．8 mL／min)，随着流动相中乙腈比例的减少，保留 时间拖后，但分离效果有明显的改善，当乙腈与 水的比例为45：55并且流速为0．8mL／min时。 桔霉素与其后的一个杂质峰得到了分离。图9 ～ 图 l1为红曲米样品(桔霉素含量较高)中桔 霉素的检测图谱，流动相中乙腈与水的比例分 别为 45：55、40： (120) 0 5 10 lS 20 25 3o 35 40 Igj'l'aJ／min 图8 V(乙腈)：y(水)=45：55时 功能性红曲米样品色谱图 o 5 1o 15 20 25 时间／mifi 图9 V(乙腈)：y(水)=45：55时红曲 米样品色谱图 o 5 1o 15 20 25 3O 时间／min 图 10 y(乙腈)：y(水)：40：60时 红 曲米样品色谱图 60和 35：65，对于 35：65的流动相，样品中桔霉 素的保留时间为 17．324 min，与杂质得到了较 好的分离。因此乙腈与水(pH2．5)的比例为 35： 65较为适宜。 2．2．3 流动相中用磷酸或三氟乙酸调酸对分 离的影响 根据日本的有关资料[ ]介绍，在流动相中 使用了三氟乙酸，其组成为：v(乙腈)：v(水)： V(三氟乙酸)=100：100：0．1，对此以 v(乙 腈)：V(水)(磷酸调 pH2．5)=50：50为对比。 6 5 4 3 2 m 8 6 4 2 O 维普资讯 http://www.cqvip.com 分稀与格纠 [A(TEF)= =6 【和 A(甲醇)=59 S 4 3 n C ： ＼ c l 2 ／＼／＼ ， 1 ● L 一 一 ～ 。· I l _-J ＼ ． 5。 l 1。5 (1 3 ⋯ 。。 靛 时间，mjn O-4 ，～ 竹 一 1t T，，7 H鲁 、．T，，1l，、一 1c ．fn + ～ ～ 。 【 11 V 、‘—J 同 ，‘ 、，J、，一 JJ ” 0．2‘ g-．d~米样品色谱图 。 注：图中标注处为桔霉素谱峰 ． 对标准桔霉素和样品 B进行 了测定。发现在 。 我们使用 ZORBAX Eclipse XDB—C18(5 m，250 。 mmX4．6mm)色谱柱子的条件下用磷酸调节 ， 流动相的 pH的分离效果较好，其分离度 R为 1．73，而流动相中使用三氟 乙酸的分离度为 一 1·06。 0．4 2．3 样品溶剂对色谱峰形的影响 。 1 i ^ 七 湘 dr h ￡l Tt 后● 生 ^ ! 古 ．I 爱 { 的标样的保留时间总有一点差异，考虑到可能 喜 ：已 TEF K~'d J YC-．,nK 姜 形较宽 的问题，我们用 TEF 妄薹 草 ’ 冀 。 荮 ： 蕃 曼 至 享 茗 盱 值较大，峰宽值较小。两者的峰面积相差很小 一 一 h 俄 一、o 红曲红65u／g 红曲红 65u／口 红曲红 65II／ 红曲蚵fi~TT／ 样品编号 NX65—1—1 NX65—1—2 NX65-1—1 NX65-1—2 样品质量／g 0．50 0．50 0 ．50 0．50 TEF总体积 V／mL 50 50 50 50 稀释倍数(D) 100 100 100 1O0 蒸干再用甲醇溶解 否 否 是 是 标准样出峰时间／min 17．987 17．987 17 ． 987 17．987 HPLC上样峰面积 Y2 639．98 496 ． 78 458．50 355．16 样品出峰时间／min 17．690 17．692 17 ． 864 17．796 样品桔霉素浓度 X／mg·kg 712．25 552．95 510 ． 34 395．33 ~ ／min 1．625 1 ． 578 0．985 1．018 峰高(Mv) 5．574 4 ． 453 6．655 4．953 高宽比 3．43 2 ． 82 6．76 4 ． 87 在红曲曲样品的图谱中也有同样的现象， 图 14～图 16所示。但是经过真空浓缩这一过 甲醇溶解的红曲红桔霉素的谱峰较为尖锐，如 程的处理 ，会造成桔霉素的损失而影响其回收 ～l⋯一 )： 维普资讯 http://www.cqvip.com 分辑与检 率。 0 5 10 15 20 25 时问／min 图 14 甲醇溶解的红曲红桔霉素 O 5 10 15 20 25 时问／rain 图 15 TEF溶解的经曲红桔霉素 2．4 质谱检测结果 为了鉴定 HPLC法分离桔霉素的效果，我 们对红曲样品的桔霉素谱峰进行质谱检验。 样 品 为 021022—9：SJS-26—3，稀 释 倍 数 16．67；021022—10：标准桔霉素，50 mg／L，甲醇 溶解。 经质谱鉴定，在优化的色谱条件下样品中 分离到的桔霉素谱峰为单一组分，如图 16所 示。 2．5 HPLC测定桔霉素标准曲线的绘制 将标准桔霉素溶液进行 HPLC测定，标样 质量浓度分别为 0．10，0．25，1．00，5．00，10．00 mg／L。以峰面积为纵坐标，桔霉素质量浓度为 横坐标，结果见图 17。在此范围内线性关系良 好，R =0．9994。 2．6 标准桔霉素溶液的高效液相检测的最低 检测浓度 在上述优化的高效液相色谱条件下(色谱 柱 ZORBAX Eclipse XDB—Cl8(5 ptm，250 X 4．6 mm)，流动相组成为 V(乙腈)：V(水，pH2．5) =35：65)，用标准桔霉素溶液作最低检测浓度 的试验，发现当其质量浓度为0．05mg／L时，仍 能检测到，并基线平稳。 图 16 红曲样品和桔霉素标样的质谱图 l 0o0 8OO 蜃6OO 整 4OO 卸 200 0 标准桔霉素的质m~ ／rag·L-- )'--89．859x-0．0421 R-~．-．-_0．9994 图 17 标准桔霉素溶液质量浓度与 色谱峰面积的线性关系图 2．7 高效液相色谱测定的精密度试验 对同一红曲样品红样品预处理后，HPLC 重复进样 5次，得到的桔霉素峰面积及相应的 误差计算如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 2所示。计算得到相对标准偏差 RsD 为 2．19％。 表 2 精密度试验中 HPLC的结果分析 3 结 论 采用色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-Cl8(5 ptm，250 X 4．6 mm)，流动相为 V(。乙腈 )：V 7 6 5 4 3 2 l O 6 5 4 3 2 l 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com