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苯酚-硫酸比色法测定多糖含量

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苯酚-硫酸比色法测定多糖含量 苯 酚 一硫 酸 比色法 测定 多糖 含 量 张青 张天民 (山东正大福瑞达制药有限公司 济南 25001 4) 随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深 2.4 测定条件选择 人,多糖的研究进展很快。目前多糖含量的测定方法 2.4.1 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡 尚无统一标准,广泛应用的是苯酚 一硫酸比色法。该 法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点, 且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。 1 苯酚一硫酸比色法原理 苯酚 一硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等 ...

苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯 酚 一硫 酸 比色法 测定 多糖 含 量 张青 张天民 (山东正大福瑞达制药有限公司 济南 25001 4) 随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深 2.4 测定条件选择 人,多糖的研究进展很快。目前多糖含量的测定方法 2.4.1 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡 尚无统一标准,广泛应用的是苯酚 一硫酸比色法。该 法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点, 且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。 1 苯酚一硫酸比色法原理 苯酚 一硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等 提出的。其原理是:多糖或寡糖被浓硫酸在适当 高温下水解,产生单糖,并迅速脱水成糠醛衍生物,该 衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应,生成橙黄色 物质,在波长490nm处和一定浓度范围内,其吸光度 值与糖浓度 呈线性关系,从而可用比色法测定其 含量。 2 实验方法 2.1 标准溶液的配制 精密称取 l05℃下干燥至恒重的葡萄糖约 l00. 0mg,置 lOOmL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇 匀,配得葡萄糖标准溶液。 2.2 供试品贮备液的配制 将样品进行适当处理(如真空干燥、回流提取等, 根据各品种不同而有差异),取适量,按一定比例稀释, 配制供试品贮备液。 2.3 苯酚溶液的配制 称取苯酚 lOOg,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g, 常压蒸馏,收集 (180±2)℃馏分。精密称取该馏分 约l0.0g置于200mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度, 摇匀后转置于棕色试剂瓶中,即得苯酚溶液,将其置 于冰箱中备用。 萄糖标准液各 1.OmL于 lOOmL量瓶中,用水稀释至 刻度,分别作为供试品溶液和对照品溶液。分别吸取 供试品溶液1.OmL于两个具塞试管中,各加苯酚液1. OmL,并分别迅速滴加浓硫酸5.OmL。一份于水浴中 煮沸15rain,另一份于401C水浴中恒温30rrdn。另取 两份对照品溶液1.OmL同上操作。取出,冷却至室温, l5rain后于490nm处测其 值,选取 较高的作为 实验温度。 2.4.2 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和 对照品液 1.OmL5份,各加人苯酚液0.2,0.4,0.6, 0.8,1.OmL,加水至2.OmL,再各滴加浓硫酸5.OmL, 40~C恒温30min后,测其 值,从苯酚液加人量达到 某一值开始, 值基本保持不变,说明苯酚液量达到 该值以上时,反应都能完成。另取供试品液和对照品 液0.6mL各5份,分别加苯酚液 1.OmL,再分别滴加 浓硫酸2.0,3.0,4.0,5.0,6.OmL,并均用水稀释 至8.OmL,根据 的稳定性,计算硫酸的最佳加人体 积。 2.4.3 反应时间选择及稳定性 分别取供试品液和 对照品溶液 1.OmL4份,各加苯酚液 1.OmL,浓硫酸 5.OmL,于选定温度分别恒温l0,20,30,40min。测得 值,加热到一定时间以后, 值不再变化,说明加 热该时间即可使反应完全。另测反应完成后样品在不 同时间内的 值,结果应在 1h以上稳定。 2.5 标准曲线的绘制 依据2.4确定的测定条件,精密吸取葡萄糖标准 叁塞虽型蕉 生蔓Z塑I 维普资讯 http://www.cqvip.com 溶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0. 8mL(相当于葡萄糖0.0,100,200,300,400,500, 600,700,800ug),分别置于 10mL具塞刻度试管中, 各加水使成 1.0mL,然后分别加人苯酚溶液,摇匀, 迅速加入浓硫酸,振摇5min后置相应温度水浴中加热 一 定时间,取出置冷水中冷却,最后加水至刻度,摇 匀。用分光光度计在波长490nm处测定吸光度。以 值对浓度 绘制标准曲线,进行线性回归,得标准曲 线方程:A=a.C+b(a、b根据实验确定)。 2.6 校正因子的测定 将样品多糖纯品适量,按适当比例稀释,使单糖 浓度在标准曲线中 范围内,作为纯品贮备液。精密 吸取该贮备液100ul,照标准曲线制作项下的方法测定 , 求出样品多糖的浓度 C(ug/mL),按 ( · )计算换算因子。式中 W (ug)为多糖含量; 为 纯品的稀释倍数。若样品多糖无纯品,如可能进一步 纯化,则将样品进行提纯后用于测定校正因子。 2.7 样品的测定 取样品适量,精密称定,稀释,按照2.5中条件进 行测定,得到多糖浓度 ,按多糖含量 (%)= [( · · / 】×100%计算多糖含量。式中 为样 品重量; 为样品的稀释倍数;,为换算因子。 3 讨论 3.1 用分光光度计测定多糖的方法,具有操作简单、 结果稳定、灵敏度高等优点。 3.2 文中样品用量、葡萄糖标准溶液用量及供试品贮 备液用量,可根据实际情况进行调整,使 值保持在灵 敏范围内,保证样品浓度在标准曲线 范围内,以免 测定结果偏离真实值,但各溶液的用量前后尽可能不要 变化太大。 3.3 含多糖的物质,由于其多样性,水解为单糖的难 易程度不同,故水解的条件应事先确定。水解不够,单 糖不能充分释出;水解条件过度,释出的单糖或有关 困 苤 虽整堡 芏蔓Z塑 糠醛衍生物会被部分破坏。测定条件选择的三个影响 因素,可进行L。(3 )正交试验来确定最佳条件。测 定条件选择中各影响因素的不同水平可根据样品自身 条件进行调整,如反应温度常有煮沸、40"C和室温等, 但室温放置在不同气候条件下影响因素不恒定,因此 不多用。 3.4 关于校正因子的测定,如样品无法进一步纯化, 即不能制得多糖纯品,可不进行校正因子测定。根据 得到的多糖浓度 和 、 直接计算多糖含量 (%)。 3.5 葡萄糖与其它单糖的显色反应虽一般大致相近, 但有一定差异。故要求较高的测定中,应加以校正 [31。 因其他单糖的显色反应有的比葡萄糖强,有的比葡萄 糖弱,误差可抵消一部分。如不加校正,也可基本上 达到多糖含量控制的目的。 3.6 如果供试品溶液有较深的颜色,溶液中有其它组 分在波长490nm处有吸收,则可采用导数法 I测定 含量。 3.7 试验需进行精密度试验、重现性试验和回收率试 验。 参考文献 [1】Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et a1.Colo- rimetric method for determination of sugars and related substances,Anal Chem,1 956,28:350 [2】Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et a1. Acolorimetric method for the determination of sugars,Nature,1951,168:167 [3】 董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚一硫酸法测 定多糖和寡糖含量的研究,中国药学杂志,1996,31: 550 [4】耿霞,梁冰,梁玉祥等 .苯酚一硫酸导数光谱 法快速测定 中药中多糖的研究 ,四川大学学报 , 2002,34:62 维普资讯 http://www.cqvip.com
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