苯 酚 一硫 酸 比色法 测定 多糖 含 量
张青 张天民 (山东正大福瑞达制药有限公司 济南 25001 4)
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深 2.4 测定条件选择
人,多糖的研究进展很快。目前多糖含量的测定方法 2.4.1 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡
尚无统一标准,广泛应用的是苯酚 一硫酸比色法。该
法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点,
且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
1 苯酚一硫酸比色法原理
苯酚 一硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等
提出的。其原理是:多糖或寡糖被浓硫酸在适当
高温下水解,产生单糖,并迅速脱水成糠醛衍生物,该
衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应,生成橙黄色
物质,在波长490nm处和一定浓度范围内,其吸光度
值与糖浓度 呈线性关系,从而可用比色法测定其
含量。
2 实验方法
2.1 标准溶液的配制
精密称取 l05℃下干燥至恒重的葡萄糖约 l00.
0mg,置 lOOmL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇
匀,配得葡萄糖标准溶液。
2.2 供试品贮备液的配制
将样品进行适当处理(如真空干燥、回流提取等,
根据各品种不同而有差异),取适量,按一定比例稀释,
配制供试品贮备液。
2.3 苯酚溶液的配制
称取苯酚 lOOg,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,
常压蒸馏,收集 (180±2)℃馏分。精密称取该馏分
约l0.0g置于200mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,
摇匀后转置于棕色试剂瓶中,即得苯酚溶液,将其置
于冰箱中备用。
萄糖标准液各 1.OmL于 lOOmL量瓶中,用水稀释至
刻度,分别作为供试品溶液和对照品溶液。分别吸取
供试品溶液1.OmL于两个具塞试管中,各加苯酚液1.
OmL,并分别迅速滴加浓硫酸5.OmL。一份于水浴中
煮沸15rain,另一份于401C水浴中恒温30rrdn。另取
两份对照品溶液1.OmL同上操作。取出,冷却至室温,
l5rain后于490nm处测其 值,选取 较高的作为
实验温度。
2.4.2 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和
对照品液 1.OmL5份,各加人苯酚液0.2,0.4,0.6,
0.8,1.OmL,加水至2.OmL,再各滴加浓硫酸5.OmL,
40~C恒温30min后,测其 值,从苯酚液加人量达到
某一值开始, 值基本保持不变,说明苯酚液量达到
该值以上时,反应都能完成。另取供试品液和对照品
液0.6mL各5份,分别加苯酚液 1.OmL,再分别滴加
浓硫酸2.0,3.0,4.0,5.0,6.OmL,并均用水稀释
至8.OmL,根据 的稳定性,计算硫酸的最佳加人体
积。
2.4.3 反应时间选择及稳定性 分别取供试品液和
对照品溶液 1.OmL4份,各加苯酚液 1.OmL,浓硫酸
5.OmL,于选定温度分别恒温l0,20,30,40min。测得
值,加热到一定时间以后, 值不再变化,说明加
热该时间即可使反应完全。另测反应完成后样品在不
同时间内的 值,结果应在 1h以上稳定。
2.5 标准曲线的绘制
依据2.4确定的测定条件,精密吸取葡萄糖标准
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溶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.
8mL(相当于葡萄糖0.0,100,200,300,400,500,
600,700,800ug),分别置于 10mL具塞刻度试管中,
各加水使成 1.0mL,然后分别加人苯酚溶液,摇匀,
迅速加入浓硫酸,振摇5min后置相应温度水浴中加热
一 定时间,取出置冷水中冷却,最后加水至刻度,摇
匀。用分光光度计在波长490nm处测定吸光度。以
值对浓度 绘制标准曲线,进行线性回归,得标准曲
线方程:A=a.C+b(a、b根据实验确定)。
2.6 校正因子的测定
将样品多糖纯品适量,按适当比例稀释,使单糖
浓度在标准曲线中 范围内,作为纯品贮备液。精密
吸取该贮备液100ul,照标准曲线制作项下的方法测定
, 求出样品多糖的浓度 C(ug/mL),按 ( ·
)计算换算因子。式中 W (ug)为多糖含量; 为
纯品的稀释倍数。若样品多糖无纯品,如可能进一步
纯化,则将样品进行提纯后用于测定校正因子。
2.7 样品的测定
取样品适量,精密称定,稀释,按照2.5中条件进
行测定,得到多糖浓度 ,按多糖含量 (%)= [( ·
· / 】×100%计算多糖含量。式中 为样
品重量; 为样品的稀释倍数;,为换算因子。
3 讨论
3.1 用分光光度计测定多糖的方法,具有操作简单、
结果稳定、灵敏度高等优点。
3.2 文中样品用量、葡萄糖标准溶液用量及供试品贮
备液用量,可根据实际情况进行调整,使 值保持在灵
敏范围内,保证样品浓度在标准曲线 范围内,以免
测定结果偏离真实值,但各溶液的用量前后尽可能不要
变化太大。
3.3 含多糖的物质,由于其多样性,水解为单糖的难
易程度不同,故水解的条件应事先确定。水解不够,单
糖不能充分释出;水解条件过度,释出的单糖或有关
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糠醛衍生物会被部分破坏。测定条件选择的三个影响
因素,可进行L。(3 )正交试验来确定最佳条件。测
定条件选择中各影响因素的不同水平可根据样品自身
条件进行调整,如反应温度常有煮沸、40"C和室温等,
但室温放置在不同气候条件下影响因素不恒定,因此
不多用。
3.4 关于校正因子的测定,如样品无法进一步纯化,
即不能制得多糖纯品,可不进行校正因子测定。根据
得到的多糖浓度 和 、 直接计算多糖含量 (%)。
3.5 葡萄糖与其它单糖的显色反应虽一般大致相近,
但有一定差异。故要求较高的测定中,应加以校正 [31。
因其他单糖的显色反应有的比葡萄糖强,有的比葡萄
糖弱,误差可抵消一部分。如不加校正,也可基本上
达到多糖含量控制的目的。
3.6 如果供试品溶液有较深的颜色,溶液中有其它组
分在波长490nm处有吸收,则可采用导数法 I测定
含量。
3.7 试验需进行精密度试验、重现性试验和回收率试
验。
参考文献
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rimetric method for determination of sugars and
related substances,Anal Chem,1 956,28:350
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Acolorimetric method for the determination of
sugars,Nature,1951,168:167
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定多糖和寡糖含量的研究,中国药学杂志,1996,31:
550
[4】耿霞,梁冰,梁玉祥等 .苯酚一硫酸导数光谱
法快速测定 中药中多糖的研究 ,四川大学学报 ,
2002,34:62
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